Сыворотка Бесплатное производство трехмерных человеческих гепатосфер из плюрипотентных стволовых клеток

1. Подготовка агаросы Microplate плесени ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации, используемые для этих экспериментов, должны быть стерильными и при комнатной температуре (RT) для клеточной культуры. Подготовка 2% агарозных форм. Растворите 2 г агарозы низкой температуры плавления в 100 мл стерилизоватой дистиллированной воды. Тщательно нагревайте в микроволновой печи с интервалом встряхивания, чтобы полностью раствориться. Добавьте 520 л расплавленной агарозы в форму формата 256 колодцев и оставьте затвердеть. Перенесите каждую микроплиту агарозы в один колодец 12-колодца. Добавьте 1,5 мл из 1x Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS) с Ca2″/Mg2″ к каждой скважине и удалить пузырьки воздуха из микроколодцев, мягко пипетки вверх и вниз несколько раз с помощью P1000 пипетка отзыв. Это выполняется для обеспечения равномерного посева клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Микроплиты Агарозы могут храниться до 6 месяцев при 4 градусах По Цельсию в 1x DPBS. 2. Посев человека Плюрипотентные стволовые клетки в Агароуз Microwell пластин Подготовка клеточной суспензии Аспирировать среды от недифференцированной культуры hPSCs, как ранее описано8.ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs культивируются на LN-521 в mTeSR1 со средой изменен каждые 24 ч, и регулярно проходят, как только клетки достигают 75% до 85% от выпуклости, как ранее описано8. Промыть клетки с 5 мл RT 1x DPBS без Ca2″/Mg2″ и удалить буфер. Добавьте 5 мл реагента диссоциации 1x клетки(Таблицаматериалов) к клеткам и позвольте разъединению клеток путем инкубировать клетки на 37 c для 6-8 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы остановить реакцию, изучите отслоение клеток под микроскопом. Клетки должны быть частично отделены от пластины. Продлить инкубацию на дополнительные 1-2 мин, если требуется больше времени. Остановите реакцию, удалив реагент диссоциации клеток и добавьте 5 мл свежей среды mTeSR1, дополненной ингибитором 10 мкм Rho-associated-ассоциированной киназы (ROCK) Y27632 к клеткам. Диссоциативные клетки путем pipetting вверх и вниз несколько раз с помощью P1000 пипетка отзыв. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра и trypan синий окрашивания исключения. После этого подготовьте суспензию клетки в необходимой концентрации. Рассчитайте общее количество необходимых ячеек. Для дифференциации 3D гепатосферы, семена 3,84 х 105 клеток на микроплиту агаросы для генерации сфероидов с диаметром 100-150 мкм. Перенесите нужное количество клеток в стерильную 15 мл или 50 мл центрифуги трубки и центрифуги трубки на 200 х г в течение 5 минут на RT, чтобы гранулы клеток. Аспирировать и отбрасывать супернатант и повторного отображения клеток в mTeSR1 среды плюс 10 мкм ROCK ингибитор Y27632. Разбавить клеточные гранулы в соответствующем объеме средней до конечной концентрации 2,1 х 106 клеток/мл. Посев клеток до подготовленных агарозных микроплитПРИМЕЧАНИЕ: При использовании холодильника хранятся агарозные микроплиты, поместите их в клеточный инкубатор на 37 градусов по Цельсию, по крайней мере за час до использования и аспирировать 1x DPBS из хорошо перед посевной клетки. Добавьте 190 л клеточной подвески в микроскважину агарозы. После посева, вернуть пластины в клеточный инкубатор на 37 кв и 5% CO2 на 2 ч, чтобы клетки оседают. После 2 ч добавьте 1 мл свежей и теплой среды mTeSR1, дополненной 10 ингибитором Y27632. Вернуть пластины в клеточный инкубатор при 37 градусах По кв. м и 5% CO2 на 24 ч и изучить образование сфер на следующий день, чтобы позволить клеткам прикрепляться. 3. Дифференциирование hPSCs на 3D гепатосферы на Микроуэллах Агаросы Приготовление поли2-гидроксиэтил метакрилата (поли-ХЕМА) покрытых скважин Растворите 2 г поли-HEMA в 100 мл 95% этанола. Перемешать раствор на ночь с помощью горячей пластины при 55 градусах Цельсия. Добавьте 250 л раствора поли-HEMA на скважину 24-хорошей тарелки и высушите на ночь при температуре 60 градусов по Цельсию с помощью духовки. Подготовка среды дифференциации Подготовьте 1000x стоковой раствор человеческого актививина А путем растворения человеческого активибилизированного белка в стерильных 0,2% бычьего сыворотки альбумина (BSA)/DPBS до конечной концентрации 100 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000. Подготовьте 1000x фондовый раствор Wnt3a путем растворения мыши Wnt3a лиофилизированного белка в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Использовать в 1:200. Подготовьте 1000x фондовый раствор фактора роста гепатоцитов человека (HGF) путем растворения лиофилизированного белка HGF в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000. Подготовьте 1000x биржевое решение онкостататина M (OSM) путем растворения OSM в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 20 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000. Подготовьте 1000-x стоковой раствор фактора эпителиального роста (EGF) путем растворения лиофилизированного белка в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000. Подготовьте 1000-x биржевое решение базового фактора роста фибробластов (bFGF) путем растворения лиофилизированного белка в стерильных 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000. Подготовьте 1000-x стоковой раствор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) путем растворения лиофизированного белка в 0,2% BSA/DPBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Хранить при -20 градусов по Цельсию в небольших аликвотах. Используйте в 1:1,000. Сделать эндодерм дифференциации среды, состоящей из Розуэлл Парк Мемориальный институт 1640 (RPMI 1640) базальная среда дополнена 2% B27 дополнения (50x, без инсулина), и 1% пенициллин / стрептомицин (окончательные концентрации: 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл, соответственно). Если не указано, при каждом среднем изменении, дополнить необходимый объем wnt3a и активицин А при окончательной концентрации 50 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Храните при 4 градусах Цельсия и используйте в течение двух недель. Сделать гепатобластной дифференциации среды, состоящей из нокаута Dulbecco в модифицированных Eagle среды (KO-DMEM) с 20% нокаутом замены сыворотки (KOSR) и дополнены 0,5% альтернативной добавки к L-глутамамин, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 0,1 мМ бета-меркаптоэтанол, 1% диметилсульксид (ДМСО) и 1% пенициллина/стрептомицина (окончательные концентрации на уровне 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл соответственно). Фильтр под вакуумом.ПРИМЕЧАНИЕ: Храните при 4 градусах Цельсия и используйте в течение двух недель. Сделать гепатоцитов созревания среды, состоящей из гепатоцитов среды дополняется 1% от альтернативного дополнения к L-глутамин, 10 ММ гидрокортизон 21-гемисуцина соли натрия (HCC), 1% пенициллин / стрептомицин (окончательная концентрация на 100 МЕ /мл и 100 мкг/мл, соответственно). Для каждого среднего изменения дополнить необходимый объем с OSM и HGF (окончательные концентрации на 20 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно).ПРИМЕЧАНИЕ: Храните бульон при 4 градусах по Цельсию и используйте в течение двух недель. Сделать гепатоцитов поддержания среды, состоящей из Уильяма E среды дополняется 10% нокаутом замены сыворотки, состоящий из 1% от альтернативного дополнения к L-глутамин, 1% пенициллин / стрептомицин (окончательные концентрации на 100 МЕ /мл и 100 мкг/мл, соответственно). Для каждого среднего изменения дополнить необходимый объем hGF, EGF, bFGF и VEGF (окончательная концентрация каждого фактора роста на уровне 10 нг/мл).ПРИМЕЧАНИЕ: Храните бульон при 4 градусах по Цельсию и используйте в течение двух недель. Проверьте гепатосферу формирования 24 ч после посева и инициировать дифференциации гепатоцитов. Тщательно удалите mTeSR1 среды и заменить его 1 мл свежей эндодерм дифференциации среды дополнены 100 нг / мл активицин А и 50 нг /мл Wnt3a. Изменение дополнено эндодерм грунтовки среды каждые 24 ч в течение 3 дней для hESCs. При работе с hiPSCs, продлить этот этап еще на 2 дня, дополняя средства массовой информации с активицином А (100ng/mL) в одиночку. После окончательной индукции эндодерма, переключитесь на среду дифференциации гепатобластов для спецификации гепатобластов в течение 5 дней, заменяя среду каждые 2 дня, и выполните последнее изменение в последний день спецификации гепатобластов. Перенос гепатосферв в поли-HEMA покрытием скважин. Вымойте клетки один раз с гепатоцитов созревания среды без добавок после удаления KSR / DMSO среды и добавить 1 мл гепатоцитов созревания среды дополнены 10 нг / мл HGF и 20 нг /мл OSM. Используя пипетку P1000, поднимите гепатосферы из микроплиты агарозы, несколько раз подняв и опуская раствор. Перенесите среду, содержащую гепатосферы, в поли-HEMA покрытием хорошо. Вымойте микроплиту агарозы с помощью 1 мл среды созревания гепатоцитов, дополненной 10 нг/мл HGF и 20 ng/mL OSM и перенесите среду на поли-HEMA с покрытием. Повторите шаг 3.6.4 как много времен как возможно для того чтобы перенести все hepatospheres от микроплиты агарозы.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно тщательно пипетку вверх и вниз раствор, содержащий гепатосферы, чтобы избежать повреждения их. Тщательно аспирировать избыток среды без удаления гепатосферы с помощью пипетки P100 до 1 мл среды, содержащей гепатосферы остается в поли-HEMA покрытием хорошо. Изменение среды каждые 48 ч в течение 12 дней. На 20-й день при работе с hESCs или день 22 при работе с hiPSCs, переключить средний на гепатоцитов среднего. Удалить гепатоцитов созревания среды и мыть клетки один раз с гепатоцитов поддержания среды без добавок. Добавьте 1 мл средних эксплуатационных работ гепатоцитов, дополненных 10 нг/мл HGF, EGF, FGF и VEGF. Изменение среды для свежего гепатоцитов обслуживания среды каждые 48 ч. 4. Функциональный анализ долгосрочных культурных 3D гепатосфер Переключитесь на среду созревания гепатоцитов, дополненную 10 МКм HCC, L-глютамином, 1% пенициллином/стрептомицином (окончательные концентрации на уровне 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл соответственно) и 10 нг/мл HGF 48 h до выполнения функционального анализа. Анализ гепатоцитов метаболической функции с помощью цитохрома (CYP) P450 анализы. Замените среду с 1 мл свежего гепатоцита созревания среды дополнены 50 мкм люциферин-6′-пентафторо-бензил эфир (люциферин-ПФБЭ) субстрата для обнаружения CYP3A базальной активности или 100 мкм люциферин-метил-эфир (люциферин-ME) субстрата для обнаружения CYP12 базальной активности (количество репликатов No 3). Использование тканевой культуры средств массовой информации в качестве отрицательного контроля.ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание перекрестной реактивности рекомендуется не использовать те же скважины, содержащие 3D гепатосферы, для тестирования различных видов деятельности CYP P450, а выполнять их в отдельных скважинах. Инкубировать клетки для 24 ч при 37 с. Соберите супернатанты с помощью наконечника пипетки P100 и проведите ажиотажа в рамках инструкций производителя. Измерьте относительные уровни базальной активности и нормализуйте к протеину мг как обусловино анализом bicinchoninic кислоты (BCA). Проверьте выработку белка сыворотки с помощью ферментно-связанного иммуносорбента (ELISA). Замените среду 1 мл свежей среды созревания гепатоцитов, дополненной 10 нг/мл HGF и 20 нг/мл OSM (количество репликаций No 3). Использование тканевой культуры средств массовой информации в качестве отрицательного контроля. Инкубировать клетки для 24 ч при 37 с. Соберите супернатант с помощью наконечника пипетки P100 и измерьте относительные уровни производства белка сыворотки в рамках инструкций производителя. Нормализация на мг белка, как это определено BCA Анализ. 5. Иммуноцитохимия Приготовление парафиновых секций, содержащих гепатосферы. Вымойте гепатосферы три раза с 1x DPBS. Зафиксните гепатосферы с ледяным метанолом в течение 30 мин. Вымойте три раза с 1x DPBS. Вставьте гепатосферы в 300 qL закаленного раствора 2% агаросы, растворенного в H2O, используя пустой колодец 24-хорошей пластины в виде плесени и оставьте ее затвердеть в течение 30 мин. Встраивай агароз, содержащий гепатосферы в парафин. Раздел парафиновый блок, содержащий фиксированные гепатосферы в 4 мкм толщиной разделов с использованием микротома. Де-воще и регидратация секций.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежие решения, когда это возможно. Не используйте решения, которые были на окрашивание корыта дольше, чем на неделю. Поместите секции в стеллажную стойку. Погрузить слайд-стойку, содержащую секции в окрашивание корыта, содержащего 300 мл ксилена в течение 5 мин. Повторите шаг 5.2.2. Погрузитесь в абсолютный этанол на 20 с. Погрузитесь в 95% этанола на 20 с. Погрузитесь в 90% этанола на 20 с. Погрузитесь в 80% этанола на 20 с. Погрузитесь в 70% этанола на 20 с. Увлажняй секции водой в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте слайды в той же стойке слайда и переместите ее из одного окрашивания в другой. Используемый объем (обычно 300 мл) зависит от размера окрашивания корыта. Антиген азаг парафина разделы, содержащие гепатосферы. Тепло де-воска и регидратированных секций в 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 буферный раствор в течение 15 минут в микроволновой печи на 800 Вт. Охладите образцы, погрузив их в водопроводную воду в течение 5 мин. Иммуностоинг. Инкубировать слайды с блокирующим раствором из PBS с 0,1% полисорбат 20 (PBS/T)/10% BSA за 1 ч на RT. Замените блокирующий раствор соответствующим первичным антителом, разбавленным в PBS/T/1% BSA, и инкубация при 4 градусах Цельсия с нежным возбуждением на ночь. Вымойте клетки pbS/T в течение 5 мин и повторите три раза. Инкубировать с соответствующими вторичными антителами, разбавленными в PBS/T/1% BSA и инкубировать в темноте на RT в течение 1 ч с нежным возбуждением.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизированные первичные и вторичные антитела перечислены в таблицематериалов. Вымойте клетки pbS/T в течение 5 мин и повторите три раза. Добавьте 4′,6-diamidino-2-penylindole (DAPI) в клетки в соответствии с инструкциями производителя и поместите стеклянный покрывало мягко, чтобы уменьшить пузырьки воздуха. Держите фиксированные клетки при 4 градусах по Цельсию в темноте. Наблюдайте за окрашиванием под микроскопом с соответствующим фильтром и люминесцентной лампой.ПРИМЕЧАНИЕ: Храните тарелки при 4 градусах по цельсию в темноте до визуализации.