Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

1. preparação de moldes da microplaca do agarose Nota: Os meios utilizados para estes experimentos devem ser estéreis e à temperatura ambiente (RT) para a cultura celular. Prepare 2% moldes de agarose. Dissolva 2 g de agarose de baixa temperatura de fusão em 100 mL de água destilada esterilizada. Aqueça com cuidado em um microondas com agitação do intervalo para dissolver completamente. Adicione 520 μL de agarose derretido a um molde de formato 256-well e deixe-o solidificar. Transfira cada microplaca do agarose em um único poço de uma placa de 12 poços. Adicione 1,5 mL de soro fisiológico com tampão fosfato de 1x Dulbecco (DPBS) com CA2 +/mg2 + para cada poço e retire as bolhas de ar dos micropoços introduzindo suavemente a pipetagem para cima e para baixo várias vezes utilizando uma ponta de pipeta P1000. Isso é realizado para garantir a semeadura de células uniformes.Nota: Os microplates do agarose podem ser armazenados por até 6 meses em 4 ° c em 1x DPBS. 2. semeando células-tronco pluripotentes humanas em placas de micropoços de agarose Preparação da suspensão celular Aspirar o meio de uma cultura indiferenciada de hPSCs como descrito anteriormente8.Nota: os hpscs são cultivados em LN-521 em mTeSR1 com o meio mudado cada 24 h, e é regularmente uma vez que as pilhas alcangam 75% a 85% da confluência como descrito previamente8. Enxague as células com 5 mL de RT 1x DPBS sem CA2 +/mg2 + e retire o tampão. Adicionar 5 mL de reagente de dissociação de célula 1x (tabela de materiais) às células e permitir a dissociação celular por células incubantes a 37 ° c por 6-8 min.Nota: Para interromper a reação, examine o descolamento da célula o microscópio. As células devem ser parcialmente separadas da placa. Estenda a incubação por um extra de 1-2 min se for necessário mais tempo. Pare a reação removendo o reagente da dissociação da pilha e adicione 5 mL do meio mTeSR1 fresco suplementado com o inibidor Rho-associado da quinase de 10 μM (rocha) Y27632 às pilhas. Dissociar as células pipetando para cima e para baixo várias vezes usando uma ponta de pipeta P1000. Conte as células viáveis usando um hemocitômetro e a exclusão de coloração azul do Tripan. Depois disso, prepare a suspensão da célula na concentração requerida. Calcule o número total de células necessárias. Para a diferenciação do hepatosphere 3D, semente 3,84 x 105 pilhas por o microplate do agarose para gerar esferoides com o μm 100-150 no diâmetro. Transfira o número desejado de pilhas em um tubo de centrifugador estéril de 15 mL ou de 50 mL e Centrifugue o tubo em 200 x g por 5 minutos em RT para pellet as pilhas. Aspirar e descartar as células sobrenadantes e ressuscitará no meio mTeSR1 mais 10 μM de inibidor de rocha Y27632. Diluir o pellet celular no volume adequado de médio a uma concentração final de 2,1 x 106 células/ml. Semeando as células para as microplacas de agarose preparadasNota: se estiver usando microplacas de agarose armazenadas em geladeira, coloque-as na incubadora de células a 37 ° c por pelo menos uma hora antes de usar e aspire o 1x DPBS do poço antes da semeadura da célula. Adicionar 190 μL da suspensão celular no micropoço de agarose. Após a semeadura, retorne as placas para a incubadora de células a 37 ° c e 5% CO2 para 2 h para permitir que as células se acomodem. Após 2 h, adicione 1 mL de meio mTeSR1 fresco e morno suplementado com o inibidor da rocha de 10 μM Y27632 a cada poço. Retorne as placas para a incubadora de células a 37 ° c e 5% CO2 por 24 h e examine a formação de esferas no dia seguinte para permitir que as células se fixem. 3. diferenciando hPSCs para Hepatoesferas 3D em micropoços de agarose Preparação de Poços revestidos poli-2-hidroxietil metacrilato (poli-HEMA) Dissolver 2 g de poli-HEMA em 100 mL de etanol a 95%. Agitar a solução durante a noite usando uma placa quente em 55 ° c. Adicionar 250 μL de solução de poli-HEMA por poço de uma placa de 24 poços e secar durante a noite a 60 ° c usando um forno. Preparação do meio de diferenciação Prepare uma solução de 1, 000x stock de activina humano a dissolvendo o activina humano uma proteína liofilizada na albumina de soro bovina estéril de 0,2% (BSA)/DPBS a uma concentração final de 100 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000. Prepare uma solução de 1, 000x stock de Wnt3a dissolvendo a proteína liofilizada do rato Wnt3a em 0,2% BSA/DPBS estéril a uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:200. Prepare uma solução de 1, 000x de fator de crescimento de hepatócitos humanos (HGF) dissolvendo a proteína liofilizada HGF humana em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000. Prepare uma solução de estoque de 1.000 x de oncostatina M (OSM) dissolvendo OSM em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 20 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000. Prepare uma solução de estoque de 1000x de fator de crescimento epitelial (EGF) dissolvendo a proteína liofilizada em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000. Prepare uma solução de 1, 000x de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) dissolvendo a proteína liofilizada em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000. Prepare uma solução de 1, 000x de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) dissolvendo a proteína liofilizada em 0,2% de BSA/DPBS para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000. Faça meio de diferenciação endoderma consistindo de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) meio basal suplementado com 2% B27 suplemento (50x, sem insulina), e 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais: 100 UI/mL e 100 μg/mL, respectivamente). A menos que indicado, em cada mudança média, complemente o volume exigido com Wnt3a e activina a em uma concentração final de 50 ng/mL e 100 ng/mL, respectivamente.Nota: Conservar a 4 ° c e utilizar dentro de duas semanas. Faça meio de diferenciação hepatoblast consistindo de nocaute Dulbecco ‘ s modificado Eagle médio (KO-DMEM) com 20% nocaute soro substituto (KOSR) e suplementado com 0,5% de um suplemento alternativo para L-glutamina, 1% não-aminoácidos essenciais (NEAA), 0,1 mM beta-Mercaptoetanol, 1% dimetil sulfóxido (DMSO) e 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais de 100 UI/mL e 100 μg/mL, respetivamente). Filtro vácuo.Nota: Conservar a 4 ° c e utilizar dentro de duas semanas. Faça meio de maturação de hepatócitos constituído por meio de hepatócitos suplementado com 1% de um suplemento alternativo à L-glutamina, 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato de sal de sódio (HCC), 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 μg/mL, respetivamente). Para cada alteração média, completar o volume necessário com OSM e HGF (concentrações finais a 20 ng/mL e 10 ng/mL, respectivamente).Nota: Armazene o estoque a 4 ° c e use dentro de duas semanas. Faça meio de manutenção de hepatócitos consistindo de meio de William E suplementado com reposição sérica de nocaute de 10%, consistindo em 1% de um suplemento alternativo à L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 μg/mL, respectivamente). Para cada mudança média, complemente o volume necessário com HGF, EGF, bFGF e VEGF (concentração final de cada fator de crescimento a 10 ng/mL).Nota: Armazene o estoque a 4 ° c e use dentro de duas semanas. Verificar a formação da hepatofera 24 h após a semeadura e iniciar a diferenciação de hepatócitos. Retire cuidadosamente o meio mTeSR1 e substitua-o por 1 mL de meio de diferenciação de endoderma fresco suplementado com 100 ng/mL activina a e 50 ng/mL Wnt3a. Mude o meio de escorva suplementado do endoderme cada 24 h por 3 dias para hESCs. Ao trabalhar com hiPSCs, estenda este estágio por mais 2 dias completando a mídia com activina a (100ng/mL) sozinho. Após a indução definitiva do endoderma, mude para o meio de diferenciação hepatoblast para a especificação do hepatoblast por 5 dias substituindo o meio a cada 2 dias e realize a última alteração no último dia da especificação do hepatoblast. Transfira hepatoferas para os Poços revestidos de poli-HEMA. Lave as células uma vez com meio de maturação de hepatócitos sem suplementos após a remoção do meio KSR/DMSO e adicione 1 mL de meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 ng/mL de HGF e 20 ng/mL de OSM. Usando uma pipeta P1000, levante as hepatoferas da microplaca do agarose introduzindo uma pipetagem para cima e para baixo a solução várias vezes. Transfira o meio que contem os hepatospheres a um poli-HEMA revestido bem. Lave a microplaca de agarose usando 1 mL de meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 ng/mL de HGF e 20 ng/mL de OSM e transfira o meio para o poço revestido de poli-HEMA. Repita a etapa 3.6.4 tantas como vezes como possível a fim transferir todos os hepatospheres do microplate do agarose.Nota: É crítico para pipeta com cuidado acima e para baixo a solução que contem os hepatospheres para evitar danificá-los. Aspirar com cuidado o meio excedente sem remover hepatospheres usando uma pipeta P100 até que ~ 1 mL do meio que contem os hepatspheres remanescem no poço poli-HEMA revestido. Mude o meio cada 48 h por 12 dias. No dia 20, ao trabalhar com hESCs ou dia 22, se trabalhar com hiPSCs, alterne o meio para o meio de manutenção de hepatócitos. Remova o meio de maturação de hepatócitos e lave as células uma vez com meio de manutenção de hepatócitos sem os suplementos. Adicionar 1 mL de meio de manutenção de hepatócitos suplementado com 10 ng/mL de HGF, EGF, FGF e VEGF. Mude o meio para o meio fresco da manutenção do hepatócito cada 48 h. 4. análise funcional de longo-prazo cultivadas 3D Hepatoferas Mudar para o meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 μM de HCC, L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 μg/mL, respectivamente) e 10 ng/mL HGF 48 h antes da realização da análise funcional. Analise a função metabólica de hepatócitos usando os ensaios do citocromo (CYP) P450. Substitua o meio com 1 mL de meio de maturação de hepatócitos fresco suplementado com substrato de 50 μM de luciferina-6 ‘-pentafluoro-benzílico (luciferina-PFBE) para detectar a atividade basal do CYP3A ou substrato de 100 μM luciferina-metil éter (luciferina-ME) para detectar CYP1A2 atividade basal (número de repetições = 3). Use meios de cultura de tecido como um controle negativo.Nota: A fim de evitar a reatividade cruzada, recomenda-se não usar os mesmos poços contendo hepatesferas 3D para testar diferentes atividades do CYP P450, mas para realizá-las em poços individuais. Incubar células por 24 h a 37 ° C. Colete os sobrenadantes usando uma ponta de pipeta P100 e realize o ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Medir os níveis relativos de atividade basal e normalizar a proteína por mg, conforme determinado pelo ensaio de ácido bicinchoninico (BCA). Teste a produção de proteínas séricas utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Substitua o meio com 1 mL de meio de maturação de hepatócitos fresco suplementado com 10 ng/mL de HGF e 20 ng/mL de OSM (número de repetições = 3). Use meios de cultura de tecido como um controle negativo. Incubar células por 24 h a 37 ° C. Colete o sobrenadante usando uma ponta de pipeta P100 e meça os níveis relativos de produção de proteínas séricas de acordo com as instruções do fabricante. Normalize a por a proteína do magnésio como determinada pelo ensaio de BCA. 5. Immunocytochemistry Preparação de secções de parafina contendo hepatesferas. Lave as hepatoferas três vezes com 1x DPBS. Fixar as hepatoferas com metanol gelado por 30 min. Lave três vezes com 1x DPBS. Incorpore os hepatospheres em 300 μL de uma solução moderada do agarose de 2% dissolvido em H2o usando um poço vazio de uma placa de 24 poços como um molde e deixe-a solidificar por 30 minutos. Incorpore o agarose que contem hepatospheres na parafina. Seção o bloco de parafina contendo hepatoesferas fixas em 4 μm de espessura seções usando um micrótomo. De-depilação e reidratação das secções.Nota: utilize soluções frescas sempre que possível. Não utilize soluções que tenham estado na calha de coloração durante mais de uma semana. Coloque seções em um rack de slides. Mergulhe a cremalheira de corrediça que contem seções em uma calha de mancha que contem 300 ml do xileno por 5 minutos. Repita o passo 5.2.2. Mergulhe em etanol absoluto por 20 s. Mergulhe em 95% de etanol por 20 s. Mergulhe em 90% de etanol por 20 s. Mergulhe em 80% de etanol por 20 s. Mergulhe em 70% de etanol por 20 s. Rehidrate as secções com água durante 5 min.Nota: Mantenha os slides no mesmo rack de slides e mova-o de uma calha de coloração para a próxima. O volume usado (geralmente ~ 300 mL) depende do tamanho da calha de coloração. Recuperação do antígeno de seções da parafina que contêm hepatospheres. Calor de-encerado e rehidratado seções em 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 solução tampão para 15 min em um microondas em 800 W. Arrefecer as amostras mergultando-as na água da torneira durante 5 min. Immunostaining. Incubar lâminas com solução de bloqueio feita de PBS com 0,1% de polissorbato 20 (PBS/T)/10% BSA para 1 h at RT. Substitua a solução de bloqueio pelo anticorpo primário apropriado diluído em PBS/T/1% BSA e incubar a 4 ° c com agitação suave durante a noite. Lave as células com PBS/T durante 5 min e repita três vezes. Incubar com o anticorpo secundário apropriado diluído em PBS/T/1% BSA e incubar no escuro em RT para 1 h com agitação delicada.Nota: Os anticorpos primários e secundários otimizados estão listados na tabela de materiais. Lave as células com PBS/T durante 5 min e repita três vezes. Adicionar 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para as células de acordo com as instruções do fabricante e coloque uma lamínula de vidro suavemente para reduzir as bolhas de ar. Mantenha as células fixas a 4 ° c no escuro. Observe a coloração um microscópio com filtro apropriado e lâmpada fluorescente.Nota: armazene as placas em 4 ° c no escuro até a imagem latente.