多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

1. アガロースマイクロプレート金型の調製 注:これらの実験に使用される培地は、細胞培養のために無菌および室温(RT)でなければならない。 2%アガロースカビを準備します。 低溶融温度アガロースの2gを殺菌蒸留水の100mLに溶解します。電子レンジで注意深く加熱し、間隔を振って完全に溶解させます。 溶かしたアガロースの520 μLを256ウェルフォーマットの金型に加え、固化させる。 各アガロースマイクロプレートを12ウェルプレートの単一のウェルに移します。 各ウェルにCa2+/Mg2+を付けた1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の1.5 mLを追加し、P1000ピペットチップを使用して数回上下にゆっくりとピペッティングしてマイクロウェルから気泡を除去します。これは、均一な細胞播種を確保するために行われる。注:アガロースマイクロプレートは、1x DPBSで4°Cで最大6ヶ月間保存できます。 2. ヒト多能性幹細胞をアガロースマイクロウェルプレートに播種する 細胞懸濁液の調製 前述の8.hPSCの未分化培養から培地を吸引する。注:hPSCはmTeSR1のLN-521上で培養され、培地は24時間ごとに変化し、細胞が前述の8のように合流の75%から85%に達すると定期的に通過する。 Ca2+/Mg2+なしで RT 1x DPBS の 5 mL でセルをすすいで、バッファーを除去します。 細胞に1x細胞解離試薬(材料表)の5mLを加え、37°Cで細胞を6~8分間インキュベートして細胞解離を可能にします。注:反応を止めるには、顕微鏡下で細胞剥離を調べます。セルはプレートから部分的に切り離す必要があります。より長い時間が必要な場合は、余分な1-2分のインキュベーションを延長します。 細胞解離試薬を除去して反応を停止し、10μM Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y27632を添加した新鮮なmTeSR1培地を5mL添加する。P1000ピペットチップを使用して、上下に数回ピペットによって細胞を解離します。 ヘモサイトメーターとトリパンブルー染色除外を使用して生存細胞を数えます。これに続いて、必要な濃度で細胞懸濁液を調出す。 必要なセルの合計数を計算します。3D肝球分化の場合、アガロースマイクロプレート当たり3.84 x 105細胞をシードし、直径100~150μmのスフェロイドを生成します。 必要な数の細胞を無菌15 mLまたは50 mL遠心分離管に移し、RTで5分間200 x gでチューブを遠心分離し、細胞をペレットします。 mTeSR1培地に上清を吸引し、細胞を再懸濁し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を再懸濁する。細胞ペレットを適量の培地で希釈し、2.1 x 106細胞/mLの最終濃度にする。 調製したアガロースマイクロプレートに細胞を播種する注:冷蔵庫に保存されたアガロースマイクロプレートを使用する場合は、使用前に少なくとも1時間37°Cのセルインキュベーターに入れ、細胞播種前の井戸から1x DPBSを吸引します。 アガロースマイクロウェルに190μLの細胞懸濁液を加えます。 播種後、プレートを37°Cでセルインキュベーターに戻し、2時間5%CO2で細胞を定着させます。 2時間後、10μM ROCK阻害剤Y27632を各ウェルに添加した新鮮で温かいmTeSR1培地を1mL加える。 37°Cと5%CO2で24時間でプレートをセルインキュベーターに戻し、翌日の球体の形成を調べて細胞が付着できるようにします。 3. アガローズマイクロウェルズの3D肝球にhPSCを分ける ポリ2-ヒドロキセチルメタクリレート(ポリHEMA)コーティングウェルの調製 95%エタノールの100mLでポリHEMAの2gを溶解する。55°Cでホットプレートを使用して一晩溶液をかき混ぜます。24ウェルプレートのウェルあたり250 μLのポリHEMA溶液を加え、オーブンを使用して60°Cで一晩乾燥させます。 分化媒体の調製 ヒトアクチビンA凍結性タンパク質を無菌0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)/DPBSで溶解してヒトアクチビンAの1,000倍のストック溶液を100μg/mLの最終濃度に調剤する。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。 マウスWnt3a凍結乾燥タンパク質を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解してWnt3aの1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に調製する。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:200で使用します。 ヒトHGF凍結性タンパク質を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解してヒト肝細胞増殖因子(HGF)の1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に調質させる。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。 OSMを無菌0.2%BSA/DPBSで溶解し、20 μg/mLの最終濃度に溶解することにより、オンコスタチンM(OSM)の1,000倍のストック溶液を調調えます。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。 凍結性成長因子(EGF)の1000倍のストック溶液を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解して10μg/mLの最終濃度に調質する。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。 塩分化タンパク質を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解して、基本線維芽細胞増殖因子(bFGF)の1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に溶解させる。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。 凍結乾燥タンパク質を0.2%BSA/DPBSに溶解して血管内皮増殖因子(VEGF)の1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に溶解させる。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。 ロズウェルパーク記念研究所1640(RPMI 1640)基底培地からなる内皮分化媒体を作る 2% B27サプリメント(50x、インスリンなし)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度:100 IU/mLおよび100μg/mL)それぞれ)。指示がない限り、各培地変化において、必要な体積をWnt3aおよびアクチビンAでそれぞれ50 ng/mLおよび100 ng/mLの最終濃度で補う。注:4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。 20%ノックアウト血清置換(KOSR)を持つノックアウトダルベッコの改変イーグル培地(KO-DMEM)からなる肝芽芽細胞分化媒体を作り、L-グルタミンに対する代替サプリメントの0.5%、1%非必須アミノ酸(NEAA)を補充し、0.1 mM β-メルカプトエタノール、1%ジメチルスルホキシド(DMSO)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ100 IU/mLおよび100 μg/mLでの最終濃度)。真空下でフィルターをします。注:4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。 肝細胞性成熟培地を作る肝細胞培地は、L-グルタミン、10μMヒドロコルチゾン21-ヘミコンチン酸ナトリウム塩(HCC)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU/mLおよび最終濃度および100ΜMLの代替サプリメントの1%を補充した。それぞれ100 μg/mL)。各媒体変化について、OSMおよびHGF(それぞれ20 ng/mLおよび10 ng/mLの最終濃度)で必要な体積を補う。注:在庫を4°Cに保管し、2週間以内に使用してください。 L-グルタミンに対する代替サプリメントの1%、ペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU/mLおよび100 μg/mLの最終濃度)からなる10%ノックアウト血清置換物を補充した肝細胞維持培地を作る。それぞれ)。各培地変化について、HGF、EGF、bFGFおよびVEGF(各成長因子の最終濃度10ng/mL)で必要な体積を補う。注:在庫を4°Cに保管し、2週間以内に使用してください。 肝球形成24hポストシードをチェックし、肝細胞分化を開始します。慎重にmTeSR1培地を取り外し、100 ng/mLアクチビンAと50 ng/mL Wnt3aを補充した新鮮な内皮分化培地の1 mLに置き換えます。 hESCに対して24時間毎に24時間毎に補充された内皮プライミング培地を変更する。hiPSC で作業する場合は、アクチビン A (100ng/mL) だけでメディアを補完するさらに 2 日間このステージを拡張します。 決定的な内皮誘導に続いて、2日ごとに培地を交換する5日間の肝芽細胞分化媒体に切り替え、肝芽細胞仕様の最終日に最後の変更を行う。 肝球をポリHEMAコーティングウェルに移します。 KSR/DMSO培地を除去した後、サプリメントなしで肝細胞成熟培地で細胞を一度洗浄し、10 ng/mL HGFおよび20 ng/mL OSMを添加した肝細胞成熟培地を1mL添加する。 P1000ピペットを使用して、溶液を上下に数回ピペットでアガロースマイクロプレートから肝球を持ち上げます。 肝球を含む培地を十分に被覆されたポリHEMAに移す。 10 ng/mL HGFおよび20 ng/mL OSMを補充した肝細胞成熟培地の1mLを用いてアガロースマイクロプレートを洗浄し、培地をポリHEMAコーティングによく移す。 アガロースマイクロプレートからすべての肝球を転送するために、ステップ3.6.4を可能な限り何度も繰り返します。注:肝球を含む溶液を慎重に上下にピペットし、損傷を避ける必要があります。 P100ピペットを用いて肝球を除去せずに過剰培地を慎重に吸引し、肝球を含む培地の〜1mLがポリHEMAに十分に被覆されたままになるまで。 12日間48時間ごとに媒体を変更します。 hiPSCを使用する場合は20日目または22日目に、培地を肝細胞維持培地に切り替える。 肝細胞成熟培地を除去し、サプリメントなしで肝細胞維持培地で一度細胞を洗浄します。HGF、EGF、FGFおよびVEGFの10 ng/mLを補充した肝細胞維持培地の1 mLを添加する。 新鮮な肝細胞維持培地の培地を48時間ごとに変更します。 4. 長期培養3D肝球の機能解析 機能分析を行う前に、10 μM HCC、L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ100 IU/mLおよび100 μg/mLでの最終濃度)および10 ng/mL HGF 48hを補充した肝細胞成熟培地に切り替える。 サイトクロム(CYP)P450アッセイを用いて肝細胞代謝機能を分析する。 50 μMルシフェリン-6′-ペンタフルオロベンジルエーテル(ルシフェリン-PFBE)基板を補充した新鮮な肝細胞成熟培地の1mLで培地を置き換え、CYP3A基底活性または100μMルシフェリンメチルエーテル(ルシフェリン-ME)を検出する。基底活動(反復数= 3)。組織培養培養培養培養を陰性対照として使用する。注:クロス反応性を避けるために、異なるCYP P450活性をテストするために3D肝球を含む同じウェルを使用せず、個々のウェルでそれらを実行することをお勧めします。 37°Cで24時間細胞をインキュベートする。 P100ピペットチップを使用して上清を収集し、メーカーの指示に従ってアッセイを行います。 基底活性の相対レベルを測定し、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)によって決定されるmgタンパク質当たりに正規化する。 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて血清タンパク質産生を試験する。 10 ng/mL HGFおよび20 ng/mL OSM(反復数=3)を補充した新鮮な肝細胞成熟培地の1 mLで培地を置き換える。組織培養培養培養培養を陰性対照として使用する。 37°Cで24時間細胞をインキュベートする。 P100ピペットチップを使用して上清を収集し、メーカーの指示に従って血清タンパク質産生の相対的なレベルを測定します。 BCAアッセイによって決定されるmgタンパク質当たりに正規化する。 5. 免疫細胞化学 肝球を含むパラフィンセクションの調製。 1x DPBSで肝球を3回洗います。 肝球を氷冷メタノールで30分間固定します。 1x DPBSで3回洗浄します。 24ウェルプレートの空の井戸を金型として使用してH2Oに溶解した2%アガロースの強化溶液の300μLに肝球を埋め込み、30分間固化させるためにそれを残します。 肝球を含むアガロースをパラフィンに埋め込みます。 固定肝圏を含むパラフィンブロックをマイクロトームを用いて4μm厚いセクションに切り分ける。 セクションの脱ワックスおよび水分補給。注:可能な場合はいつでも新しいソリューションを使用してください。1週間以上染色トラフにあった溶液を使用しないでください。 断面をスライド ラックに配置します。 300 mLのキシレンを含む染色トラフに5分間、断面を含むスライドラックを浸します。 手順 5.2.2 を繰り返します。 絶対エタノールを20sに浸します。 95%エタノールを20sで浸します。 90%エタノールを20sで浸します。 80%エタノールを20sで浸します。 70%のエタノールを20sで浸します。 5分間水でセクションを水分補給します。注:スライドを同じスライドラックに保持し、1 つの染色トラフから次のスライド ラックに移動します。使用される体積(一般に〜300 mL)は、染色トラフの大きさに依存する。 肝球を含むパラフィンセクションの抗原検索。 800 Wの電子レンジで15分間1xトリス-EDTA(TE)pH 9.0バッファ溶液でワックスを脱ワックスおよび再水和したセクションを熱します。 5分間水道水に浸してサンプルを冷却します。 免疫染色。 RTで0.1%ポリソルベート20(PBS/T)/10%BSAでPBS製のブロッキング溶液でスライドをインキュベートします。 ブロッキング溶液をPBS/T/1%BSAで希釈した適切な一次抗体に置き換え、4°Cで一晩穏やかな撹拌でインキュベートします。 PBS/Tで5分間洗浄し、3回繰り返します。 PBS/T/1%BSAで希釈した適切な二次抗体を用いてインキュベートし、穏やかな撹拌で1時間RTで暗闇の中でインキュベートする。注:最適化された一次抗体および二次抗体は、材料の表に記載されています。 PBS/Tで5分間洗浄し、3回繰り返します。 4′,6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を製造元の指示に従ってセルに追加し、ガラスカバースリップを穏やかに配置して気泡を減らします。暗いところで4°Cで固定細胞を保管してください。適切なフィルターと蛍光灯で顕微鏡下で染色を観察します。注:イメージングまで暗闇の中で4°Cでプレートを保存します。