Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

1. Preparazione di muffe agarose micropiastra NOT:</ I supporti utilizzati per questi esperimenti devono essere sterili e a temperatura ambiente (RT) per la coltura cellulare. Preparare 2% stampi agarose. Sciogliere 2 g di agarose a bassa temperatura di fusione in 100 mL di acqua distillata sterilizzata. Riscaldare con attenzione in un forno a microonde con agitazione a intervalli per sciogliersi completamente. Aggiungere 520 l di agarose fuso a uno stampo di formato 256-well e lasciare solidificare. Trasferire ogni micropiastra di agarose in un unico pozzo di una piastra di 12 pozze. Aggiungete 1,5 mL di 1x salina con buffer fosfatidi (DPBS) con Ca2o/Mg2 a ciascun pozzo e rimuovete le bolle d’aria dai micropozzi pipettando delicatamente su e giù più volte utilizzando una punta di pipetta P1000. Questa operazione viene eseguita per garantire una semina uniforme delle cellule. NOT:</ Le microplacche di Agarose possono essere conservate fino a 6 mesi a 4 gradi centigradi in 1x DPBS. 2. Semina cellule staminali Pluripotenti umane in piastre di microwell di Agarose Preparazione della sospensione cellulare Aspirare il mezzo da una cultura indifferenziata di hPSC come descritto in precedenza8.NOTA: gli hPSC sono coltivati su LN-521 in mTeSR1 con il mezzo cambiato ogni 24 h, e passati regolarmente una volta che le cellule raggiungono 75% a 85% di confluenza come descritto in precedenza8. Sciacquare le celle con 5 mL di RT 1x DPBS senza Ca2o Mg2 e rimuovere il buffer. Aggiungere alle cellule 5 mL di reagente di dissociazione 1x (Tabella dei materiali) e consentire la dissociazione cellulare incubando le cellule a 37 gradi centigradi per 6-8 min. NOT:</ Per fermare la reazione, esaminare il distacco cellulare al microscopio. Le cellule devono essere parzialmente staccate dalla piastra. Estendere l’incubazione per un extra 1-2 min se è richiesto più tempo. Interrompere la reazione rimuovendo il reagente di dissociazione cellulare e aggiungere 5 mL di mTe mL fresco mTeSR1 medio integrato con 10 M Rho-associated chinase (ROCK) inibitore Y27632 alle cellule. Dissociare le cellule pipettando su e giù più volte utilizzando una punta pipetta P1000. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e l’esclusione di colorazione blu trypan. A seguito di questo, preparare la sospensione cellulare alla concentrazione richiesta. Calcolare il numero totale di celle necessarie. Per la differenziazione dell’epatosfera 3D, seme 3,84 x 105 cellule per microplacca agarosa per generare sferoidi con 100-150 m di diametro. Trasferire il numero desiderato di cellule in uno sterile tubo centrifuga di 15 mL o 50 mL e centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min a RT per pellet le cellule. Aspirare e scartare le cellule sovratallore e risospendere in mTeSR1 medio più 10 – M inibitore ROCK Y27632. Diluire il pellet cellulare nel volume appropriato di media per una concentrazione finale di 2,1 x 106 celle / mL. Semina le cellule alle microplacche ad agarose preparateNOTA: Se si utilizzano microplacini di agarose conservati in frigorifero, metterli nell’incubatrice cellulare a 37 gradi per almeno un’ora prima dell’uso e aspirare il DPBS 1x dal ben prima della semina cellulare. Aggiungere 190 l della sospensione cellulare nel micropo di agarose. Dopo la semina, riportare le piastre all’incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 2 h per consentire alle cellule di stabilirsi. Dopo 2 h, aggiungere 1 mL di mTeSR1 fresco e caldo medio integrato con 10 s M inibitore ROCK Y27632 ad ogni pozzo. Riportare le piastre all’incubatrice cellulare a 37 e 5% di CO2 per 24 h ed esaminare la formazione di sfere il giorno successivo per consentire alle cellule di attaccarsi. 3. Differenziazione degli hPSC alle epatite 3D su Agarose Microwells Preparazione di pozze rivestiti in poli-idrossito (poli-HEMA) Sciogliere 2 g di poli-HEMA in 100 mL del 95% di etanolo. Mescolare la soluzione per una notte con una piastra calda a 55 gradi centigradi. Aggiungete 250 gradi di soluzione poli-HEMA per pozzo di una piastra da 24 pozzetti e asciugate pernottamento a 60 gradi centigradi con un forno. Preparazione del mezzo di differenziazione Preparare una soluzione stock di 1.000 volte dell’attivivita A sciogliendo l’attivino a reddititta umana Una proteina liofilizzata nello sterile 0,2% di albumina di siero bovino (BSA)/DPBS ad una concentrazione finale di 100 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000. Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte di Wnt3a sciogliendo la proteina linofilizzata Wnt3a del topo nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare all’1:200. Preparare una soluzione di 1.000 x del fattore di crescita umano dell’epatocito (HGF) sciogliendo la proteina liofilizzata HGF umana nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000. Preparare una soluzione di stock 1.000x di oncostatinM (OSM) sciogliendo OSM in sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 20 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000. Preparare una soluzione di stock 1000x del fattore di crescita epiteliale (EGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000. Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte il fattore di crescita del fibroblasto di base (bFGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello zerfo 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000. Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000. Rendere il mezzo di differenziazione dell’endodermico costituito da Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) mezzo basale integrato con 2% B27 supplemento (50x, senza insulina), e 1% penicillina / streptomicina (concentrazioni finali: 100 IU/mL e 100 g/mL, rispettivamente). A meno che indicato, ad ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con Wnt3a e activin A ad una concentrazione finale di 50 ng/mL e 100 ng/mL, rispettivamente. NOT:</ Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro due settimane. Rendere il mezzo di differenziazione dell’epatoblasto costituito dal mezzo Eagle modificato di Dulbecco (KO-DMEM) di knockout con la sostituzione del siero da urlo del 20% (KOSR) e integrato con lo 0,5% di un integratore alternativo alla glutammina, l’1% di amminoacidi non essenziali (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo, 1% di solfuro dimetilo (DMSO) e 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali rispettivamente a 100 IU/mL e 100 g/mL). Filtrare sotto vuoto. NOT:</ Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro due settimane. Rendere il mezzo di maturazione dell’epatocite costituito da mezzo epatocite integrato con l’1% di un integratore alternativo a L-glutamine, 10 hydrocortisone 21-emisucciato sale di sodio (HCC), 1% penicillina / streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e rispettivamente 100 g/mL. Per ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con OSM e HGF (concentrazioni finali a 20 ng/mL e 10 ng/mL, rispettivamente). NOT:</ Conservare il brodo a 4 gradi centigradi e utilizzarlo entro due settimane. Rendere il mezzo di manutenzione dell’epatocite costituito da Un mezzo e l’epatocite di William’s E, integrato con la sostituzione del siero al 10%, costituito dall’1% di un integratore alternativo a L-glutamine, 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 g/mL, rispettivamente). Per ogni variazione media, integrare il volume richiesto con HGF, EGF, bFGF e VEGF (concentrazione finale di ogni fattore di crescita a 10 ng/mL). NOT:</ Conservare il brodo a 4 gradi centigradi e utilizzarlo entro due settimane. Controllare la formazione dell’epatosfera 24 h post seeding e avviare la differenziazione degli epatociti. Rimuovere con attenzione il mezzo mTeSR1 e sostituirlo con 1 mL di mezzo di differenziazione endodermi fresco integrato con 100 ng/mL activin A e 50 ng/mL Wnt3a. Cambio integrato endoderm priming medium ogni 24 h per 3 giorni per hESCs. Quando si lavora con hiPSC, estendere questa fase per altri 2 giorni integrando i media con activin A (100ng/mL) da solo. Dopo l’induzione definitiva dell’endodermi, passare al mezzo di differenziazione dell’epatoblasto per la specifica dell’epatoblasto per 5 giorni sostituendo il mezzo ogni 2 giorni ed eseguire l’ultimo cambiamento l’ultimo giorno della specifica dell’epatoblasto. Trasferire epatosfere nei pozze rivestite poli-HEMA. Lavare le cellule una volta con il mezzo di maturazione dell’epatocite senza integratori dopo aver rimosso il mezzo KSR/DMSO medio e aggiungere 1 mL di mezzo di maturazione epatite integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM. Utilizzando una pipetta P1000, sollevare le epatosfere dalla micropiastra agarose pipetting su e giù per la soluzione più volte. Trasferire il mezzo contenente le epatosfere in un pozzo poli-HEMA rivestito. Lavare la micropiastra di agarose utilizzando 1 mL di mezzo di maturazione dell’epatocito integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM e trasferire il mezzo al pozzo rivestito poli-HEMA. Ripetere il passaggio 3.6.4 più volte possibile per trasferire tutte le epatosfere dalla microplacca agarose. NOT:</ È fondamentale pipetta con attenzione su e giù per la soluzione contenente le epatosfere per evitare di danneggiarle. Aspirare con attenzione il mezzo in eccesso senza rimuovere le epatosfere utilizzando una pipetta P100 fino a 1 mL di mezzo contenente le epatosfere rimane nel pozzo poli-HEMA rivestito. Cambiare il mezzo ogni 48 h per 12 giorni. Al giorno 20 quando si lavora con hESC o giorno 22 se si lavora con hiPSC, passare il mezzo a supporto di manutenzione epatocitico. Rimuovere il mezzo di maturazione dell’epatocite e lavare le cellule una volta con il mezzo di manutenzione epatocite senza gli integratori. Aggiungere 1 mL di mezzo di manutenzione epatocite integrato con 10 ng/mL di HGF, EGF, FGF e VEGF. Cambiare il mezzo per il mezzo di manutenzione epatocite fresco ogni 48 h. 4. Analisi funzionale delle epatie 3D coltivate a lungo termine Passare al mezzo di maturazione dell’epatocito integrato rispettivamente con 10 M di HCC, L-glutamine, 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100g/mL, rispettivamente) e 10 ng/mL HGF 48 h prima di eseguire l’analisi funzionale. Analizzare la funzione metabolica dell’epatocito utilizzando i saggi citocromatici (CYP) P450. Sostituire il substrato medio con 1 mL di maturazione dell’epatocito fresco integrato con un substrato di etere lucidferina-6′-pentafluoro-benzyl (luciferin-PFBE) per rilevare l’attività basale CYP3A o il substrato di 100 etere luciferina-metilare (luciferin-ME) per rilevare CYP1A2 attività basale (numero di repliche n. 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo. NOT:</ Al fine di evitare la reattività incrociata, si consiglia di non utilizzare gli stessi pozzi contenenti epatosfere 3D per testare diverse attività CYP P450 ma di eseguirle in singoli pozzi. Incubano le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi. Raccogliere i supernatanti utilizzando una punta di pipetta P100 ed eseguire il saggio come da istruzioni del produttore. Misurare i livelli relativi di attività basale e normalizzare per proteina mg come determinato dal saggio di acido bicinchoninico (BCA). Testare la produzione di proteine del siero utilizzando un test dell’immunosorbent sfondanti enzimatico (ELISA). Sostituire medio con 1 mL di medio di maturazione epatocito fresco integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM (numero di repliche : 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo. Incubano le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi. Raccogliere il supernatante utilizzando una punta pipetta P100 e misurare i livelli relativi di produzione di proteine del siero come da istruzioni del produttore. Normalizzare per proteine per mg come determinato dal saggio BCA. 5. Immunocitochimica Preparazione di sezioni di paraffina contenenti epatosfere. Lavare le epatosfere tre volte con 1x DPBS. Fissare le epatosfere con metanolo ghiacciato per 30 min. Lavare tre volte con 1x DPBS. Incorporare le epotosfere in 300 gradi di una soluzione temperata del 2% di agarose sciolta in H2O utilizzando un pozzo vuoto di una piastra di 24 piani come stampo e lasciarla solidificare per 30 min. Incorporare l’agarose contenente epatosfere in paraffina. Sezionare il blocco di paraffina contenente epatosfere fisse in sezioni spesse 4 m utilizzando un microtoma. De-ceretta e reidratazione delle sezioni.NOTA: utilizzare soluzioni fresche ogni volta che è possibile. Non utilizzare soluzioni che sono state sul trogolo di colorazione per più di una settimana. Posizionare le sezioni in un rack di diapositive. Immergere il rack scorrevole contenente sezioni in una macchiatura contenente 300 mL di xilene per 5 min. Ripetere il passaggio 5.2.2. Immergiti nell’etanolo assoluto per 20 s. Immergiti nel 95% di etanolo per 20 s. Immergiti nel 90% di etanolo per 20 s. Immergiti nell’80% di etanolo per 20 s. Immergiti nel 70% di etanolo per 20 s. Reidratare le sezioni con acqua per 5 min. NOT:</ Mantenere le diapositive nello stesso rack di diapositive e spostarlo da una barra di colorazione a quella successiva. Il volume utilizzato (in genere 300 mL) dipende dalle dimensioni della depressione di colorazione. Recupero di antigeni di sezioni di paraffina contenenti epatosfere. Le sezioni di calore decerate e reidratate in 1x soluzione cuscinetto 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 per 15 minuti in un microonde a 800 W. Raffreddare i campioni immergendoli nell’acqua del rubinetto per 5 min. Immunostaining. Incuba diapositive con soluzione di blocco in PBS con 0,1% di polisoro20 (PBS/T)/10% BSA per 1 h a RT. Sostituire la soluzione di blocco con l’anticorpo primario appropriato diluito in PBS/T/1% BSA e incubare a 4 gradi centigradi con agitazione delicata durante la notte. Lavare le cellule con PBS/T per 5 min e ripetere tre volte. Incubare con l’anticorpo secondario appropriato diluito in PBS/T/1% BSA e incubare al buio a RT per 1 h con agitazione delicata. NOT:</ Gli anticorpi primari e secondari ottimizzati sono elencati in Tabella dei materiali. Lavare le cellule con PBS/T per 5 min e ripetere tre volte. Aggiungere 4′,6-diamidino-2-fenilitinal (DAPI) alle cellule secondo le istruzioni del produttore e posizionare delicatamente un coperchio di vetro per ridurre le bolle d’aria. Mantenere le celle fisse a 4 gradi centigradi al buio. Osservare la colorazione al microscopio con un filtro appropriato e una lampada fluorescente.NOTA: Conservare le piastre a 4 gradi centigradi al buio fino all’imaging.