סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

1. הכנת תבניות מיקרופלייט הערה: התקשורת המשמשת לניסויים אלה חייבת להיות סטרילית ובטמפרטורת החדר (RT) עבור תרבות התא. הכינו 2% תבניות. התמוססות 2 גרם של טמפרטורת ההיתוך נמוכה agarose לתוך 100 mL של מים מזוקקים מעוקר. חום בזהירות במיקרוגל עם מרווח רועד להתמוסס לחלוטין. הוסף 520 μL של מומס נמס לתבנית 256-היטב פורמט ולעזוב כדי לגבש. העבר כל מיקרוצלחת הצמח לתוך באר אחת של 12-היטב צלחת. הוסף 1.5 mL של מלוחים באגירה של 1 x דולפי (DPBS) עם Ca2 +/Mg2 + כל טוב ולהסיר את בועות האוויר מן המיקרוגל על ידי pipetting בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות קצה P1000. הדבר מבוצע כדי להבטיח שזריעת תאים אחידה.הערה: ניתן לאחסן מיקרופלטות בנפח של עד 6 חודשים ב -4 ° c ב-1x DPBS. 2. זריעת האדם בתאי גזע רב עוצמה לתוך לוחות למיקרוגל הכנת השעיית תאים מנושף את המדיום מתרבות מובחן של hPSCs כפי שתוארה בעבר8.הערה: hPSCs הם מתורבתים ב-in-521 ב mTeSR1 עם המדיום השתנה כל 24 שעות, ו החוצה באופן סדיר פעם התאים להגיע 75% כדי 85% השטף כמתואר בעבר8. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של RT 1x DPBS ללא Ca2 +/Mg2 + ולהסיר את המאגר. הוסף 5 מ ל של 1x מגיב דיסוציאציה של תא 1 (טבלת חומרים) לתאים ולאפשר הדיסוציאציה של התא על ידי מריטינג תאים ב 37 ° c עבור 6-8 דקות.הערה: , כדי לעצור את התגובה. בדוק ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ התאים צריכים להיות מנותקים חלקית מלוחית. הארך את הדגירה עבור 1-2 דקות נוספות אם נדרש זמן רב יותר. להפסיק את התגובה על ידי הסרת מגיב הדיסוציאציה של התא ולהוסיף 5 מ ל mTeSR1 בינונית טריים בתוספת עם 10 μM Rho-הקשורים בY27632 קינאז (רוק) מעכב מדכא לתאים. הנתק תאים על-ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות טיפ P1000. לספור את התאים הקיימא באמצעות מחלת הומוציטוטומטר וטריקון כחול מכתים. לאחר מכן, הכן את התא הבולם בריכוז הנדרש. חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים. עבור 3d hepatosphere בידול, הזרע 3.84 x 105 תאים לכל agarose מיקרוצלחת לייצר spheroids עם 100-150 יקרומטר קוטר. להעביר את המספר הרצוי של תאים לתוך סטרילי 15 מ”ל או 50 mL צנטריפוגה שפופרת צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות ב RT כדי גלולה התאים. מרוב ולמחוק את supernatant ולהשעות את התאים מחדש ב mTeSR1 בינונית ועוד 10 μM סלע מעכבי Y27632. לדלל את הגלולה תא בנפח המתאים של בינוני לריכוז הסופי של 2.1 x 106 תאים/mL. זריעת התאים למיקרו-צלחות מוכנותהערה: אם נעשה שימוש במקרר מאוחסן מיקרולוחות מיקרו, למקם אותם בחממה תא ב 37 ° c לפחות שעה לפני השימוש ומכה את DPBS 1x מן הבאר לפני זריעת התאים. הוסף 190 μL של השעיית התא לתוך המיקרוגל. לאחר זריעה, להחזיר את הצלחות לחממה התא ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 עבור 2 h כדי לאפשר לתאים להתיישב. לאחר 2 h, להוסיף 1 מ ל של טרי וחמים mTeSR1 בינוני בתוספת עם 10 μM סלע מעכב Y27632 כל טוב. החזר את הלוחות לאינקובטור התא ב-37 ° c ו-5% CO2 עבור 24 שעות ובדוק את היווצרות הספירות ביום שלמחרת כדי לאפשר לתאים להתחבר. 3. הבחנה בין hPSCs ל-3D הפטלוספירות על הצמח הכנת בארות מצופות פולי 2-הידרוטקסיל (פולי-HEMA) התמוססות 2 גרם של פולי HEMA ב 100 mL של 95% אתנול. מערבבים את התמיסה בלילה באמצעות פלטה חמה ב-55 ° c. הוסף 250 μL של הפתרון פולי-HEMA לבאר של 24-באר ויבש בן לילה ב-60 ° צ’ באמצעות תנור. הכנת מדיום בידול הכנת פתרון מניות 1, 000x של הפעילות האנושית על ידי המסת הפעילות האנושית חלבון ליאופה1 ב סטרילי 0.2% סרום שור (BSA)/dpbs לריכוז הסופי של 100 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000. להכין 1, 000x פתרון מלאי של Wnt3a על ידי המסת העכבר Wnt3a ליאופ, חלבון סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. . השתמש ב-1:200 הכנת 1, 000x פתרון מניות של גורם הגדילה האנושי hepatocyte (HGF) על ידי המסת חלבון HGF האדם ליאופפיהיפיהילי ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000. להכין 1, 000x פתרון מלאי של אונסטטין M (OSM) על ידי המסת OSM סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 20 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000. הכינו פתרון מניות של 1000x של מקדם האפיתל (EGF) על ידי המסת החלבון ליאופהולן ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000. הכנת 1, 000x פתרון מניות של גורם גדילה בסיסית הפיצוץ בסיסי (bFGF) על ידי המסת החלבון הלינו, ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000. להכין פתרון מניות 1, 000x של כלי הדם גורם מקדם גידול (באמצעות) על ידי המסת החלבון ליאופה1 ב 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000. להפוך בינוני אנדועור בינונית המורכבת פארק רוזוול הזיכרון המכון 1640 (RPMI 1640) בינונית בתוספת עם 2% B27 תוספת (50x, ללא אינסולין), ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוזים הסופיים: 100 IU/mL ו100 μg/mL, בהתאמה). אלא אם צוין, בכל שינוי בינוני, להוסיף את העוצמה הנדרשת עם Wnt3a והפעלות A בריכוז סופי של 50 ng/mL ו 100 ng/mL, בהתאמה.הערה: החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים. הפוך hepatoblast חוז בידול בינוני המורכב של מדיום שונה של Dulbecco הנשר (KO-DMEM) עם 20% החלפת סרום (KOSR) ושיושלם עם 0.5% של תוסף חלופי ל-L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1 מ”מ ביתא-mercaptoethanol, 1% diמתיל סולפוקסיד (DMSO), ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזי הסופי ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). מסנן תחת ואקום.הערה: החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים. הפוך hepatocyte התבגרות בינונית המורכבת של hepatocyte בינונית בתוספת עם 1% של תוסף חלופי ל-גלוטמין, 10 μM הידרוקורטיזון מלחים מלח נתרן (HCC), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוזים הסופיים ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). עבור כל שינוי בינוני, להוסיף את העוצמה הנדרשת עם OSM ו HGF (ריכוזי הסופי ב 20 ng/mL ו-10 ng/mL, בהתאמה).הערה: אחסן את המניה ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים. להפוך hepatocyte תחזוקה בינונית המורכבת של E בינונית של ויליאם השלימה עם 10% החלפת סרום, המורכב 1% של תוספת חלופית L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים סופיים ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). עבור כל שינוי בינוני, הוסף את העוצמה הנדרשת עם HGF, EGF, bFGF ו-וורף (הריכוז הסופי של כל גורם גדילה ב-10 ng/mL).הערה: אחסן את המניה ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים. בדוק את מערך ה-hepatosphere 24 שעות שלאחר זריעה והתחל בבידול. בזהירות להסיר את המדיום mTeSR1 ולהחליף אותו עם 1 מ ל של בינוני חדש בידול עור בתוספת עם 100 ng/mL הפעילות A ו 50 ng/mL Wnt3a. שינוי בינונית לטרמה בתוספת עור כל 24 שעות עבור 3 ימים עבור hESCs. בעבודה עם hiPSCs, הארך את השלב במשך יומיים נוספים הכוללים את המדיה באמצעות הפעילות (100ng/mL) בלבד. בעקבות האינדוקציה האנדופאתית הסופית, לעבור לתוך מחוז hepatoblast ידול בינוני עבור מפרט hepatoblast חוז עבור 5 ימים החלפת המדיום כל 2 ימים ולבצע את השינוי האחרון ביום האחרון של המפרט hepatoblast חוז. העבר את הספירות לתוך הבארות הצופות בפולי-HEMA. שטוף את התאים פעם אחת עם התבגרות ההבשלה בינונית ללא תוספי מזון לאחר הסרת KSR/DMSO בינונית ולהוסיף 1 מ ל של התבגרות ההבשלה של hepatocyte שיושלם עם 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM. תוך שימוש בפיפטה P1000, הרם את הספירות מתוך המיקרו-ליטוף של התמיסה מספר פעמים. העבר את המדיום המכיל את הספירות לבאר מצופה פולי HEMA. לשטוף את מיקרוצלחת הצמח באמצעות 1 מ ל של התבגרות ההבשלה בינונית בתוספת 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM ולהעביר את המדיום כדי פולי HEMA מצופה היטב. חזור על השלב 3.6.4 פעמים רבות ככל האפשר על מנת להעביר את כל כדורי hepatospheres המיקרו לוחית.הערה: זה קריטי לפיפטה בזהירות למעלה ולמטה את הפתרון המכיל את כדורי hepatospheres להימנע מפגיעה בהם. הקפדה בזהירות על המדיום עודף מבלי להסיר hepatospheres באמצעות מP100 בצנרת עד ~ 1 מ ל של בינוני המכיל את הספירות האלה נשאר ב פולי-HEMA מצופה היטב. לשנות את המדיום כל 48 h עבור 12 ימים. ביום 20 כאשר עובדים עם hESCs או יום 22 אם עובדים עם hiPSCs, העבר את המדיום למדיום תחזוקה hepatocyte. הסרת hepatocyte התבגרות בינונית ולשטוף את התאים פעם אחת עם מדיום תחזוקה hepatocyte ללא תוספי. להוסיף 1 מ ל של מדיום תחזוקה hepatocyte שיושלם עם 10 ng/mL של HGF, EGF, FGF ו-ואגף. לשנות את המדיום עבור תחזוקה מדיום טרי החציט כל 48 h. 4. ניתוח פונקציונלי של מתורבת לטווח ארוך תלת-ממד כדורים החפאאלים עבור אל hepatocyte התבגרות בינונית בתוספת עם 10 μM HCC, L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזי הסופי ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה) ו 10 ng/mL HGF 48 h לפני ביצוע ניתוח פונקציונלי. ניתוח של הפונקציה המטבולית של hepatocyte באמצעות ציטוכרום (CYP) P450 assays. להחליף בינוני עם 1 מ ל של ההבשלה התבגרות טריים בינונית בתוספת עם 50 μM לluciferin-6′-פנטטאורו-בנזיל אתר (לוציפראב-PFBE) מצע לזיהוי פעילות CYP3A בסיס או 100 μM לוציפראב-מתיל אתר (לוציפראב-ME) מצע לזהות CYP1A2 פעילות בסיס (מספר המשכפלת = 3). השתמש במדיה של תרבות הרקמה כשליטה שלילית.הערה: כדי למנוע הצלבה, מומלץ לא להשתמש באותם בארות המכילים 3D hepatospheres כדי לבדוק פעילויות שונות CYP P450 אלא לבצע אותם בבארות נפרדות. התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° C. לאסוף את הסופרנטנים על-ידי טיפ P100 מתוך ולבצע את השיטה לפי הוראות היצרן. למדוד את הרמות היחסיות של פעילות בסיס ולנרמל ל-mg חלבון כפי שנקבע על ידי שיטת החומצה הבינותית (BCA). סרום לבדיקת חלבון משתמש בשיטת חיסוני מקושרת אנזימים (אליסה). החלף בינוני עם 1 מ ל של התבגרות החלציט טרי מדיום בתוספת 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM (מספר משכפל = 3). השתמש במדיה של תרבות הרקמה כשליטה שלילית. התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° C. לאסוף את supernatant באמצעות עצה P100 tte ולמדוד את הרמות היחסיות של ייצור חלבון הסרום לפי הוראות היצרן. הנורמליזציה לחלבון mg לפי הקביעה שנקבעה על-ידי שיטת BCA. 5. אימונוציטוכימיה הכנת חתכי פרפין המכילים כדורים. שטוף את הכדורים שלוש פעמים. עם כדורי הרנטגן תקן את הכדורים עם מתנול קר קרח במשך 30 דקות. שטוף שלוש פעמים עם 1x DPBS. הטמע the hepatospheres ב 300 μL של פתרון מחוסמת של 2% agarose מומס H2O באמצעות באר ריקה של צלחת 24-היטב כתבנית ולהשאיר אותו לגבש עבור 30 דקות. הטמע את הצמח המכיל את הספירות בפרפין. סעיף בלוק פרפין המכיל hepatospheres קבוע ב 4 יקרומטר סעיפים עבים באמצעות microtome. דה-שעווה והסבה של הסעיפים.הערה: השתמש בפתרונות רעננים בכל פעם שניתן. אין להשתמש בפתרונות שהיו על שוקת הצביעת במשך יותר משבוע. מקם מקטעים במדף שקופיות. לטבול מתלה שקופיות המכיל סעיפים באבוס מכתים המכיל 300 mL של קסילן עבור 5 דקות. חזור על שלב ה5.2.2. לטבול באתנול מוחלט עבור 20 s. לטבול ב 95% אתנול עבור 20 s. לטבול ב 90% אתנול עבור 20 s. לטבול ב 80% אתנול עבור 20 s. לטבול ב 70% אתנול עבור 20 s. להשקות מחדש את הסעיפים עם מים עבור 5 דקות.הערה: שמור על השקופיות באותו מדף שקופיות והעבר אותה מאבוס כתמים אחד לשני. הנפח המשמש (בדרך כלל ~ 300 mL) תלוי בגודל של שוקת הצביעת. לאחזור אנטיגן של מקטעי פרפין המכילים כדורי hepatospheres חום דה-שעווה מקטעים מחדש ב-1x טריס-EDTA (TE) pH 9.0 מאגר פתרון עבור 15 דקות במיקרוגל ב 800 W. לצנן את דגימות על ידי האישר אותם במי ברז עבור 5 דקות. כתמים חיסוני. דגירה שקופיות עם פתרון חסימה העשוי PBS עם 0.1% polysorbate 20 (PBS/T)/10% BSA עבור 1 h בשעה RT. החלפת פתרון חסימת עם הנוגדן העיקרי המתאים מדולל ב-PBS/T/1% BSA ו-דגירה ב 4 ° צ’ עם עצבנות עדינה בן לילה. שטוף תאים עם PBS/T עבור 5 דקות וחזור שלוש פעמים. דגירה עם הנוגדן המשני המתאים מדולל ב-PBS/T/1% BSA ו-דגירה בחושך ב-RT במשך 1 h עם עצבנות עדינה.הערה: הנוגדנים העיקריים והמשניים הממוטבים מפורטים ברשימת החומרים. שטוף תאים עם PBS/T עבור 5 דקות וחזור שלוש פעמים. להוסיף 4 ‘, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) לתאים לפי הוראות היצרן והמקום שמיכות זכוכית בעדינות כדי להפחית בועות אוויר. שמרו על תאים קבועים ב -4 ° c בחשכה. שימו לב לצביעת תחת מיקרוסקופ עם מסנן מתאים ומנורה פלואורסצנטית.הערה: הצלחות מאחסנות ב -4 ° c בחשכה עד להדמיה.