Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

1. Herstellung von Agarose Mikroplattenformen HINWEIS: Die für diese Experimente verwendeten Medien müssen steril und bei Raumtemperatur (RT) für die Zellkultur sein. Bereiten Sie 2% Agarose-Formen vor. 2 g Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in 100 ml sterilisiertes destilliertes Wasser auflösen. Vorsichtig in einer Mikrowelle mit Intervallschütteln erhitzen, um sich vollständig aufzulösen. 520 L geschmolzene Agarose zu einer 256-Well-Form hinzufügen und erstarren lassen. Übertragen Sie jede Agarose-Mikroplatte in einen einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte. Fügen Sie 1,5 ml 1x 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) mit Ca2+/Mg2+ zu jedem Brunnen hinzu und entfernen Sie die Luftblasen aus den Mikrobrunnen, indem Sie mit einer P1000 Pipette-Spitze mehrmals sanft nach oben und unten pfeifen. Dies wird durchgeführt, um eine gleichmäßige Zellaussaat zu gewährleisten.HINWEIS: Agarose Mikroplatten können bis zu 6 Monate bei 4 °C in 1x DPBS gelagert werden. 2. Aussaat humaner pluripotenter Stammzellen in Agarose Microwell Platten Vorbereitung der Zellsuspension Aspirieren Sie das Medium aus einer undifferenzierten Kultur von hPSCs, wie zuvor beschrieben8.ANMERKUNG: hPSCs werden auf LN-521 in mTeSR1 kultiviert, wobei das Medium alle 24 h gewechselt wird, und regelmäßig durchgedrungen, sobald die Zellen 75% bis 85% der Konfluenz erreichen, wie zuvor beschrieben8. Spülen Sie die Zellen mit 5 ml RT 1x DPBS ohne Ca2+/Mg2+ und entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie den Zellen 5 ml 1x Zelldissoziationsreagenz (Materialtabelle) hinzu und lassen Sie die Zelldissoziation durch Inkubation von Zellen bei 37 °C für 6-8 min zu.HINWEIS: Um die Reaktion zu stoppen, untersuchen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Die Zellen sollten teilweise von der Platte gelöst werden. Verlängern Sie die Inkubation um zusätzliche 1-2 min, wenn längere Zeit erforderlich ist. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Zelldissoziationsreagenz entfernen und 5 ml frisches mTeSR1-Medium, ergänzt durch 10 M Rho-assoziierte Kinase (ROCK)-Hemmer Y27632, zu den Zellen hinzufügen. Trennen Sie Zellen, indem Sie mithilfe einer P1000-Pipettenspitze mehrmals nach oben und unten pfeifen. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung Ausschluss. Anschließend bereiten Sie die Zellsuspension in der erforderlichen Konzentration vor. Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen. Zur 3D-Hepatosphärendifferenzierung, Samen 3,84 x 105 Zellen pro Agarose Mikroplatte, um Sphäroide mit 100-150 m Durchmesser zu erzeugen. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein steriles 15 ml oder 50 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min bei RT, um die Zellen zu pellet. Aspirieren und entsorgen Sie die Überstands- und Resuspendzellen in mTeSR1 medium plus 10 ‘M ROCK-Hemmer Y27632. Das Zellpellet im entsprechenden Mediumvolumen auf eine Endkonzentration von 2,1 x 106 Zellen/ml verdünnen. Aussaat der Zellen an die vorbereiteten Agarose-MikroplattenHINWEIS: Wenn Sie kühl gelagerte Agarose-Mikroplatten verwenden, legen Sie sie mindestens eine Stunde vor der Verwendung bei 37 °C in den Zellinkubator und saugen Sie die 1x DPBS vor der Zellaussaat aus dem Brunnen ab. Fügen Sie 190 l der Zellsuspension in den Agarose-Mikrowell ein. Nach der Aussaat die Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 2 h in den Zellinkubator zurück, damit sich die Zellen absetzen können. Nach 2 h 1 ml frisches und warmes mTeSR1-Medium hinzufügen, ergänzt mit 10 ‘M ROCK-Hemmer Y27632 zu jedem Brunnen. Geben Sie die Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h in den Zellinkubator zurück und untersuchen Sie die Bildung von Kugeln am nächsten Tag, damit sich die Zellen anheften können. 3. Unterscheidung von hPSCs zu 3D-Hepatosphären auf Agarose Microwells Herstellung von Poly 2-Hydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) beschichteten Brunnen 2 g Poly-HEMA in 100 ml 95% Ethanol auflösen. Die Lösung über Nacht mit einer Kochplatte bei 55 °C umrühren. Fügen Sie 250 l Poly-HEMA-Lösung pro Bohrung einer 24-Well-Platte hinzu und trocknen Sie sie über Nacht bei 60 °C mit einem Ofen. Vorbereitung des Differenzierungsmediums Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung von humanem Aktivin A vor, indem Sie humanes Aktivin Ein lyophilisiertes Protein in sterilem 0,2% Rinderserumalbumin (BSA)/DPBS auf eine Endkonzentration von 100 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung von Wnt3a vor, indem Sie die Maus Wnt3a lyophilisiertes Protein in sterilem 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung um 1:200. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des humanen Hepatozytenwachstumsfaktors (HGF) vor, indem Sie das humane HGF-lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000. Bereiten Sie eine 1.000-fache Lagerlösung von Oncostatin M (OSM) vor, indem Sie OSM in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 20 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000. Bereiten Sie eine 1000-fache Stammlösung des epithelialen Wachstumsfaktors (EGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000. Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000. Endoderm Differenzierungsmedium bestehend aus Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Basalmedium ergänzt mit 2% B27 Ergänzung (50x, ohne Insulin) und 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen: 100 I.E./ml und 100 g/ml, bzw.). Sofern nicht angegeben, wird bei jeder mittleren Veränderung das erforderliche Volumen mit Wnt3a und Aktivin A bei einer Endkonzentration von 50 ng/ml bzw. 100 ng/ml ergänzt.HINWEIS: Bei 4 °C lagern und innerhalb von zwei Wochen verwenden. Herstellung eines Hepatoblast-Differenzierungsmediums bestehend aus dem modifizierten Eagle-Medium (KO-DMEM) von Knockout Dulbecco mit 20% Knockout-Serumersatz (KOSR) und ergänzt durch 0,5% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol, 1% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml bzw. 100 g/ml). Filter unter Vakuum.HINWEIS: Bei 4 °C lagern und innerhalb von zwei Wochen verwenden. Herstellung von Hepatozytenreifungsmedium bestehend aus Hepatozytenmedium, ergänzt durch 1% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 10 M Hydrocortison 21-Hemisuccinat-Natriumsalz (HCC), 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml und 100 g/ml). Für jede mittlere Veränderung das benötigte Volumen mit OSM und HGF (Endkonzentrationen bei 20 ng/ml bzw. 10 ng/ml) ergänzen.HINWEIS: Lagern Sie den Lagerbestand bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von zwei Wochen. Hepatozyten-Wartungsmedium, bestehend aus Williams E-Medium, ergänzt durch 10% Knockout-Serum-Ersatz, bestehend aus 1% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml und 100 g/ml, bzw.). Für jede mittlere Veränderung das erforderliche Volumen mit HGF, EGF, bFGF und VEGF (Endkonzentration jedes Wachstumsfaktors bei 10 ng/ml) ergänzen.HINWEIS: Lagern Sie den Lagerbestand bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von zwei Wochen. Überprüfen Sie die Hepatosphärenbildung 24 h nach der Aussaat und initiieren Sie die Hepatozytendifferenzierung. Entfernen Sie das mTeSR1 Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Endoderm-Differenzierungsmedium, ergänzt durch 100 ng/ml Activin A und 50 ng/ml Wnt3a. Änderung ergänzt Endoderm Grundierung Medium alle 24 h für 3 Tage für hESCs. Bei der Arbeit mit hiPSCs, verlängern Sie diese Phase um weitere 2 Tage und ergänzen Sie die Medien allein mit Aktivin A (100ng/ml). Nach der endgültigen Endoderm-Induktion, wechseln Sie auf Hepatoblast Differenzierungsmedium für Hepatoblast Spezifikation für 5 Tage ersetzen das Medium alle 2 Tage und führen Sie die letzte Änderung am letzten Tag der Hepatoblast Spezifikation. Übertragen Sie Hepatosphären in die poly-HEMA beschichteten Brunnen. Waschen Sie die Zellen einmal mit Hepatozyten reifung Medium ohne Ergänzungen nach dem Entfernen KSR / DMSO Medium und fügen Sie 1 ml Hepatozyten reifung Medium ergänzt mit 10 ng/ mL HGF und 20 ng/mL OSM. Heben Sie mit einer P1000 Pipette die Hepatosphären von der Agarose-Mikroplatte an, indem Sie die Lösung mehrmals auf und ab pfeifen. Übertragen Sie das Medium, das die Hepatosphären enthält, auf einen poly-HEMA-beschichteten Brunnen. Waschen Sie die Agarose-Mikroplatte mit 1 ml Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 ng/ml HGF und 20 ng/ml OSM, und übertragen Sie das Medium auf das poly-HEMA beschichtete Gut. Wiederholen Sie Schritt 3.6.4 so oft wie möglich, um alle Hepatosphären von der Agarose-Mikroplatte zu übertragen.HINWEIS: Es ist wichtig, die Lösung, die die Hepatosphären enthält, sorgfältig nach oben und unten zu pipette, um zu vermeiden, dass sie beschädigt werden. Sorgsam überschüssiges Medium ansaugen, ohne Hepatosphären zu entfernen, indem man eine P100-Pipette verwendet, bis 1 ml Medium, das die Hepatosphären enthält, gut in der Poly-HEMA beschichtet bleibt. Wechseln Sie das Medium alle 48 stunden für 12 Tage. Wechseln Sie an Tag 20 bei der Arbeit mit hESCs oder tag 22 bei Arbeiten mit hiPSCs das Medium auf Hepatozyten-Wartungsmedium. Entfernen Hepatozyten Reifung Medium und waschen Zellen einmal mit Hepatozyten-Wartungsmedium ohne die Ergänzungen. Fügen Sie 1 ml Hepatozyten-Wartungsmedium mit 10 ng/ml HGF, EGF, FGF und VEGF ergänzt. Ändern Sie das Medium für frische Hepatozyten-Wartungsmedium alle 48 h. 4. Funktionelle Analyse von langzeitgecultureten 3D-Hepatosphären Wechseln Sie auf Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 M HCC, L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml bzw. 100 g/ml) und 10 ng/ml HGF 48 h vor der Durchführung einer funktionellen Analyse. Analysieren Sie die metabolische Funktion von Hepatozyten mit Cytochrom (CYP) P450-Assays. Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml frisches Hepatozyten-Reifungsmedium, ergänzt durch 50 -M-Luciferin-6′-Pentafluor-Benzyl-Ether (Luciferin-PFBE)-Substrat zum Nachweis der CYP3A-Basalaktivität oder 100 -M-Luciferin-Methylether(Luciferin-ME)-Substrat zum Nachweis von CYP1A2 Basalaktivität (Anzahl der Replikationen = 3). Verwenden Sie Gewebekulturmedien als Negativkontrolle.HINWEIS: Um Kreuzreaktivität zu vermeiden, wird empfohlen, nicht die gleichen Brunnen mit 3D-Hepatosphären zu verwenden, um verschiedene CYP P450-Aktivitäten zu testen, sondern sie in einzelnen Brunnen durchzuführen. Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C. Sammeln Sie die Überräube mit einer P100 Pipettenspitze und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Messen Sie die relative Basalaktivität und normalisieren Sie sich auf pro mg-Protein, wie durch den Bicinchoninsäure-Assay (BCA) bestimmt. Testen Sie die Serumproteinproduktion mit enzymgebundenem Immunsorbent Assay (ELISA). Ersetzen Sie Medium durch 1 ml frischehe Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 ng/ml HGF und 20 ng/ml OSM (Anzahl der Replikationen = 3). Verwenden Sie Gewebekulturmedien als Negativkontrolle. Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C. Sammeln Sie den Überstand mit einer P100 Pipettenspitze und messen Sie die relativen Mengen der Serumproteinproduktion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Normalisieren Sie auf pro mg-Protein, wie durch den BCA-Assay bestimmt. 5. Immunzytochemie Herstellung von Paraffinabschnitten, die Hepatosphären enthalten. Waschen Sie die Hepatosphären dreimal mit 1x DPBS. Fixieren Sie die Hepatosphären mit eiskaltem Methanol für 30 min. Waschen Sie dreimal mit 1x DPBS. Die Hepatosphären in 300 l einer gehärteten Lösung von 2% Agarose, die inH2O gelöst ist, mit einem leeren Brunnen einer 24-Well-Platte als Form einbetten und 30 min verfestigen lassen. Einbetten sie die Agarose mit Hepatosphären in Paraffin. Abschnitt des Paraffinblocks mit festen Hepatosphären in 4 m dicken Abschnitten mit einem Mikrotome. De-Waxing und Rehydratation der Abschnitte.HINWEIS: Verwenden Sie neue Lösungen, wann immer es möglich ist. Verwenden Sie keine Lösungen, die länger als eine Woche auf dem Färberrog waren. Platzieren Sie Abschnitte in einem Schiebeträger. Eintauchen Sie das Schielengestell mit Abschnitten in einen Färbetrog mit 300 ml Xylol für 5 min. Wiederholen Sie Schritt 5.2.2. Tauchen Sie in absolutes Ethanol für 20 s ein. Tauchen Sie in 95% Ethanol für 20 s ein. Tauchen Sie in 90% Ethanol für 20 s ein. Tauchen Sie in 80% Ethanol für 20 s ein. Tauchen Sie in 70% Ethanol für 20 s ein. Rehydrieren Sie die Abschnitte mit Wasser für 5 min.HINWEIS: Bewahren Sie die Dias im selben Schiebeträger auf und verschieben Sie sie von einem Färberrog zum nächsten. Das verwendete Volumen (in der Regel 300 ml) hängt von der Größe des Färbetrogs ab. Antigen-Retrieval von Paraffinabschnitten, die Hepatosphären enthalten. Entwachste und rehydrierte Abschnitte in 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 Pufferlösung für 15 min in einer Mikrowelle bei 800 W erhitzen. Abkühlen von Proben, indem Sie sie 5 min in Leitungswasser eintauchen. Immunostaining. Inkubieren Sie Dias mit Blockierlösung aus PBS mit 0,1% Polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA für 1 h bei RT. Ersetzen Sie die Blockierlösung durch den entsprechenden Primärantikörper, der in PBS/T/1% BSA verdünnt ist, und inkubieren Sie bei 4 °C mit sanfter Rührung über Nacht. Waschen Sie Zellen mit PBS/T für 5 min und wiederholen Sie es dreimal. Mit dem entsprechenden sekundären Antikörper in PBS/T/1% BSA inkubieren und im Dunkeln bei RT 1 h mit sanfter Rührung inkubieren.HINWEIS: Die optimierten primären und sekundären Antikörper sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Waschen Sie Zellen mit PBS/T für 5 min und wiederholen Sie es dreimal. Fügen Sie 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu den Zellen nach den Anweisungen des Herstellers hinzu und legen Sie einen Glasdeckel vorsichtig, um Luftblasen zu reduzieren. Fixzellen bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren. Beobachten Sie die Färbung unter dem Mikroskop mit entsprechender Filter- und Leuchtstofflampe.HINWEIS: Platten bei 4 °C im Dunkeln bis zur Bildgebung aufbewahren.