Production sans sérum d'hépatosphères humaines tridimensionnelles à partir de cellules souches pluripotentes

1. Préparation des moules à microplaques Agarose REMARQUE: Les médias utilisés pour ces expériences doivent être stériles et à température ambiante (RT) pour la culture cellulaire. Préparer 2% moules agarose. Dissoudre 2 g d’agarose à basse température de fonte en 100 ml d’eau distillée stérilisée. Chauffer soigneusement au micro-ondes avec des secousses d’intervalle pour dissoudre complètement. Ajouter 520 l’agarose fondue dans un moule de format de 256 puits et laisser se solidifier. Transférer chaque microplaque d’agarose dans un seul puits d’une assiette de 12 puits. Ajoutez 1,5 ml de saline tamponnée de phosphate (DPBS) de 1x Dulbecco avec Ca2/Mg2 à chaque puits et retirez les bulles d’air des micropuits en faisant doucement monter et descendre plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette P1000. Ceci est effectué pour assurer l’ensemencement cellulaire uniforme.REMARQUE: Les microplaques d’Agarose peuvent être stockées jusqu’à 6 mois à 4 oC dans 1x DPBS. 2. Ensemencement de cellules souches pluripotentes humaines dans des plaques de micropuits d’Agarose Préparation de la suspension cellulaire Aspirer le médium d’une culture indifférenciée de hPSCs comme précédemment décrit8.REMARQUE: hPSCs sont cultivés sur LN-521 en mTeSR1 avec le milieu changé tous les 24 h, et passages régulièrement une fois que les cellules atteignent 75% à 85% de la confluence comme précédemment décrit8. Rincer les cellules avec 5 ml de RT 1x DPBS sans Ca2/Mg2 et enlever le tampon. Ajouter 5 ml de réagent de dissociation cellulaire 1x (tableaudes matériaux)aux cellules et permettre la dissociation cellulaire en couvant des cellules à 37 oC pendant 6-8 min.REMARQUE: Pour arrêter la réaction, examinez le détachement cellulaire au microscope. Les cellules doivent être partiellement détachées de la plaque. Prolonger l’incubation pendant 1-2 min supplémentaire si un temps plus long est nécessaire. Arrêtez la réaction en enlevant le réactif de dissociation cellulaire et ajoutez 5 mL de milieu mTeSR1 frais complété par 10 M Rho-associé kinase (ROCK) inhibiteur Y27632 aux cellules. Dissocier les cellules en faisant monter et descendre plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette P1000. Comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion de coloration bleu trypan. Après cela, préparer la suspension cellulaire à la concentration requise. Calculez le nombre total de cellules nécessaires. Pour la différenciation de l’hépatosphère 3D, les graines 3,84 x 105 cellules par microplaque d’agarose pour générer des sphéroïdes de 100 à 150 m de diamètre. Transférer le nombre désiré de cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml ou 50 ml et centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min à RT pour granuler les cellules. Aspirer et jeter les cellules supernatant et resuspendre dans le milieu mTeSR1 plus 10 ‘M inhibiteur ROCK Y27632. Diluer la pastille cellulaire dans le volume approprié de milieu à une concentration finale de 2,1 x 106 cellules/mL. Ensemencement des cellules aux microplaques d’agarose préparéesREMARQUE : Si vous utilisez des microplaques d’agarose entreposées au réfrigérateur, placez-les dans l’incubateur cellulaire à 37 oC pendant au moins une heure avant d’être utilisés et aspirez le 1x DPBS du puits avant l’ensemencement cellulaire. Ajouter 190 l de la suspension cellulaire dans le micropuits d’agarose. Après l’ensemencement, remettre les plaques à l’incubateur cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 2 h pour permettre aux cellules de se déposer. Après 2 h, ajouter 1 ml de milieu mTeSR1 frais et chaud complété par un inhibiteur de 10 M ROCK Y27632 à chaque puits. Remettre les plaques à l’incubateur cellulaire à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h et examiner la formation des sphères le lendemain pour permettre aux cellules de se fixer. 3. Différencier les hPSC des hépatosphères 3D sur les micropuits d’Agarose Préparation de puits enduits poly 2-hydroxyethyl (poly-HEMA) Dissoudre 2 g de poly-HEMA dans 100 ml d’éthanol à 95%. Remuer la solution pendant la nuit à l’aide d’une plaque chauffante à 55 oC. Ajouter 250 l de solution poly-HEMA par puits d’une assiette de 24 puits et sécher toute la nuit à 60 oC à l’aide d’un four. Préparation du milieu de différenciation Préparer une solution de stock 1000x de l’activine humaine A en dissolvant l’activine humaine Une protéine lyophilisée dans l’albumine stérile de sérum bovin 0.2% (BSA)/DPBS à une concentration finale de 100 ‘g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000. Préparer une solution de stock 1000x de Wnt3a en dissolvant la souris Wnt3a protéine lyophilisée en stérile 0,2% BSA/DPBS à une concentration finale de 10 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:200. Préparer une solution de stock 1000x du facteur de croissance humain d’hépatocyte (HGF) en dissolvant la protéine lyophilisée humaine de HGF dans le BSA/DPBS stérile de 0.2% à une concentration finale de 10 ‘g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000. Préparer une solution d’actions 1 000x d’oncostatin M (OSM) en dissolvant l’OSM en BSA/DPBS stérile de 0,2 % à une concentration finale de 20 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000. Préparer une solution de stock 1000x du facteur de croissance épithéliale (EGF) en dissolvant la protéine lyophilisée en bSA/DPBS stérile de 0,2 % à une concentration finale de 10 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000. Préparer une solution de 1 000 x stock du facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF) en dissolvant la protéine lyophilisée en BSA/DPBS stérile de 0,2 % à une concentration finale de 10 g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000. Préparer une solution de stock 1000x du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) en dissolvant la protéine lyophilisée dans 0.2% BSA/DPBS à une concentration finale de 10 ‘g/mL. Conserver à -20 oC dans de petits aliquots. Utilisation à 1:1,000. Faire le milieu de différenciation d’endoderm composé de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) milieu basal complété par 2% de supplément B27 (50x, sans insuline), et 1% pénicilline/streptomycine (concentrations finales: 100 UI/mL et 100 g/mL, respectivement). Sauf indication, à chaque changement moyen, compléter le volume requis avec Wnt3a et activinE A à une concentration finale de 50 ng/mL et 100 ng/mL, respectivement.REMARQUE: Conserver à 4 oC et l’utiliser dans les deux semaines. Faire le milieu de différenciation d’hépatoblaste se composant du milieu modifié d’aigle de Knockout dulbecco (KO-DMEM) avec le remplacement de sérum de KO de 20% (KOSR) et complété avec 0.5% d’un supplément alternatif à L-glutamine, 1% acides aminés non essentiels (NEAA), 0,1 mM de bêta-mercaptoéthanol, 1 % de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et 1 % de pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 g/mL, respectivement). Filtrer sous vide.REMARQUE: Conserver à 4 oC et l’utiliser dans les deux semaines. Faire le milieu de maturation d’hépatocyte se composant du milieu d’hépatocyte complété avec 1% d’un supplément alternatif à L-glutamine, 10 -M hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium sel (HCC), 1% pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 IU/mL et 100 g/mL, respectivement). Pour chaque changement moyen, compléter le volume requis avec OSM et HGF (concentrations finales à 20 ng/mL et 10 ng/mL, respectivement).REMARQUE: Conserver le bouillon à 4 oC et l’utiliser dans les deux semaines. Faire le milieu d’entretien d’hépatocyte se composant du milieu d’E de William complété avec le remplacement de sérum de KO de 10%, se composant de 1% d’un supplément alternatif à l’alglutamine, 1% de pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 ‘g/mL, respectivement). Pour chaque changement moyen, compléter le volume requis avec HGF, EGF, bFGF et VEGF (concentration finale de chaque facteur de croissance à 10 ng/mL).REMARQUE: Conserver le bouillon à 4 oC et l’utiliser dans les deux semaines. Vérifier la formation de l’hépatosphère 24 h après l’ensemencement et initier la différenciation des hépatocytes. Retirez soigneusement le milieu mTeSR1 et remplacez-le par 1 mL de milieu frais de différenciation endoderm complété par 100 ng/mL activin A et 50 ng/mL Wnt3a. Changer le milieu d’amorçage d’endoderm complété tous les 24 h pendant 3 jours pour des hESCs. Lorsque vous travaillez avec des hiPSC, prolongez cette étape pendant 2 jours supplémentaires en complétant les médias avec l’activine A (100ng/mL) seule. Après l’induction définitive d’endoderm, passez au milieu de différenciation d’hépatoblaste pour la spécification d’hépatoblaste pendant 5 jours remplaçant le milieu tous les 2 jours et exécutez le dernier changement le dernier jour de la spécification d’hépatoblast. Transférer les hépatosphères dans les puits enduits poly-HEMA. Laver les cellules une fois avec le milieu de maturation d’hépatocyte sans suppléments après avoir enlevé le milieu de KSR/DMSO et ajouter 1 mL de milieu de maturation d’hépatocyte complété avec 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM. À l’aide d’une pipette P1000, soulever les hépatosphères de la microplaque de l’agarose en faisant monter et descendre la solution plusieurs fois. Transférer le milieu contenant les hépatosphères dans un puits poly-HEMA enduit. Laver la microplaque d’agarose à l’aide de 1 ml de milieu de maturation des hépatocytes complété avec 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM et transférer le milieu au poly-HEMA bien enduit. Répétez l’étape 3.6.4 autant de fois que possible afin de transférer toutes les hépatosphères de la microplaque agarose.REMARQUE: Il est essentiel de soigneusement pipette de haut en bas de la solution contenant les hépatosphères pour éviter de les endommager. Aspirez soigneusement l’excès de milieu sans enlever les hépatosphères à l’aide d’une pipette P100 jusqu’à ce que 1 ml de milieu contenant les hépatosphères reste dans le poly-HEMA bien enduit. Changer le milieu tous les 48 h pendant 12 jours. Au jour 20 lorsque vous travaillez avec des HESC ou le jour 22 si vous travaillez avec des hiPSC, passez le milieu au milieu d’entretien d’hépatocyte. Enlever le milieu de maturation d’hépatocyte et laver des cellules une fois avec le milieu d’entretien d’hépatocyte sans les suppléments. Ajouter 1 mL de milieu d’entretien d’hépatocyte complété avec 10 ng/mL de HGF, EGF, FGF et VEGF. Changer le milieu pour le milieu frais d’entretien d’hépatocyte tous les 48 h. 4. Analyse fonctionnelle des hépatosphères 3D cultivées à long terme Passer au milieu de maturation des hépatocytes complété par 10 M HCC, L-glutamine, 1% pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 ‘g/mL, respectivement) et 10 ng/mL HGF 48 h avant d’effectuer l’analyse fonctionnelle. Analyser la fonction métabolique des hépatocytes à l’aide de tests Cytochrome (CYP) P450. Remplacer le milieu par un milieu de maturation d’hépatocyte frais complété par un substrat d’éther de luciferin-6′-pentafluoro-benzyl (luciferin-PFBE) pour détecter l’activité basale de CYP3A ou un substrat de 100 ether luciferin-méthyle (luciferin-ME) pour détecter CYP1A2 l’activité basale (nombre de répliques 3). Utilisez les médias de culture tissulaire comme un contrôle négatif.REMARQUE: Afin d’éviter la réactivité croisée, il est recommandé de ne pas utiliser les mêmes puits contenant des hépatosphères 3D pour tester différentes activités CYP P450, mais de les effectuer dans des puits individuels. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC. Recueillir les supernatants à l’aide d’une pointe de pipette P100 et effectuer le résultat selon les instructions du fabricant. Mesurer les niveaux relatifs d’activité basale et normaliser à la protéine mg selon l’analyse de l’acide bicinchoninique (BCA). Testez la production de protéines sériques à l’aide d’analyses immunosorbent liées aux enzymes (ELISA). Remplacer le milieu par 1 ml de milieu de maturation des hépatocytes frais complété par 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM (nombre de répliques 3). Utilisez les médias de culture tissulaire comme un contrôle négatif. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 oC. Recueillir le supernatant à l’aide d’une pointe de pipette P100 et mesurer les niveaux relatifs de production de protéines sériques selon les instructions du fabricant. Normaliser à la protéine par mg tel que déterminé par l’assay BCA. 5. Immunocytochimie Préparation de sections de paraffine contenant des hépatosphères. Laver les hépatosphères trois fois avec 1x DPBS. Fixer les hépatosphères avec du méthanol glacé pendant 30 min. Laver trois fois avec 1x DPBS. Intégrez les hépatosphères dans 300 L d’une solution tempérée de 2% d’agarose dissoute en H2O à l’aide d’un puits vide d’une plaque de 24 puits comme moule et laissez-le se solidifier pendant 30 min. Intégrer l’agarose contenant des hépatosphères dans la paraffine. Sectiondure le bloc de paraffine contenant des hépatosphères fixes dans des sections de 4 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome. Décirage et réhydratation des sections.REMARQUE : Utilisez des solutions nouvelles chaque fois que c’est possible. N’utilisez pas de solutions qui sont sur le creux de coloration depuis plus d’une semaine. Placer les sections dans un toboggan. Immerger le toboggan contenant des sections dans une auge de coloration contenant 300 ml de xylène pendant 5 min. Répétez l’étape 5.2.2. Plongez dans l’éthanol absolu pendant 20 s. Immerger dans 95 % d’éthanol pendant 20 s. Immerger dans 90% d’éthanol pendant 20 s. Immerger dans 80% d’éthanol pendant 20 s. Immerger dans 70% d’éthanol pendant 20 s. Réhydrater les sections avec de l’eau pendant 5 min.REMARQUE: Maintenez les glissières dans le même support de glissière et déplacez-la d’un creux de coloration à l’autre. Le volume utilisé (généralement 300 ml) dépend de la taille de l’abreuvoir de coloration. Récupération d’antigène des sections de paraffine contenant des hépatosphères. Chauffer les sections désépilées et réhydratées dans la solution tampon 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 pendant 15 min au micro-ondes à 800 W. Refroidir les échantillons en les immergeant dans l’eau du robinet pendant 5 min. Immunomarquage. Incuber les diapositives avec solution de blocage faite de PBS avec 0,1% polysorbate 20 (PBS/T)/10% BSA pour 1 h à RT. Remplacez la solution de blocage par l’anticorps primaire approprié dilué dans le PBS/T/1% BSA et incubez à 4 oC par une douce agitation pendant la nuit. Laver les cellules avec PBS/T pendant 5 min et répéter trois fois. Incuber avec l’anticorps secondaire approprié dilué dans PBS/T/1% BSA et incuber dans l’obscurité à RT pendant 1 h avec une agitation douce.REMARQUE: Les anticorps primaires et secondaires optimisés sont répertoriés dans tableau des matériaux. Laver les cellules avec PBS/T pendant 5 min et répéter trois fois. Ajouter 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) aux cellules selon les instructions du fabricant et placer un bordereau en verre doucement pour réduire les bulles d’air. Maintenir les cellules fixes à 4 oC dans l’obscurité. Observez la coloration sous un microscope avec le filtre approprié et la lampe fluorescente.REMARQUE: Conserver les plaques à 4 oC dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.