Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

1. bereiding van agarose-microplaat mallen Opmerking: Voor deze experimenten gebruikte media moeten steriel zijn en bij kamertemperatuur (RT) voor celkweek. Bereid 2% agarose mallen voor. Los 2 g van de lage smelttemperatuur agarose op in 100 mL gesteriliseerd gedestilleerd water. Verwarm voorzichtig in een magnetron met interval schudden om volledig op te lossen. Voeg 520 μL gesmolten agarose toe aan een 256-well formaat schimmel en laat het stollen. Breng elke agarose-microplaat over in een enkele put van een 12-put-plaat. Voeg 1,5 mL 1x Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met CA2 +/mg2 + toe aan elk putje en verwijder de luchtbelletjes uit de micro putjes door meerdere malen zachtjes op en neer te pipetteren met een P1000 pipetpunt. Dit wordt uitgevoerd om een uniforme celseeding te garanderen.Opmerking: Agarose microplaten kunnen tot 6 maanden bij 4 °C worden bewaard in 1x DPBS. 2. het zaaien van menselijke pluripotente stamcellen in agarose-Microwell-platen Voorbereiding van celsuspensie Aspirate het medium van een ongedifferentieerde cultuur van hPSCs zoals eerder beschreven8.Opmerking: hpscs worden gekweekt op LN-521 in mTeSR1, waarbij het medium om de 24 uur is veranderd en regelmatig wordt overgeprikt zodra de cellen 75% tot 85% van de confluentie bereiken zoals eerder beschreven8. Spoel de cellen af met 5 mL RT 1x DPBS zonder CA2 +/mg2 + en verwijder de buffer. Voeg 5 mL 1x celdissociatie reagens (tabel met materialen) toe aan de cellen en laat celdissociatie door cellen te incuberen bij 37 °c gedurende 6-8 min.Opmerking: Om de reactie te stoppen, onderzoeken celloslating onder de Microscoop. De cellen moeten gedeeltelijk van de plaat worden losgemaakt. Verleng de incubatie voor een extra 1-2 min als langere tijd nodig is. Stop de reactie door het celdissociatie reagens te verwijderen en voeg 5 mL vers mTeSR1 medium toe, aangevuld met 10 μM Rho-geassocieerde kinase (GESTEENTE) remmer Y27632 aan de cellen. Dissocieren cellen door meerdere malen omhoog en omlaag te pipetteren met behulp van een P1000 pipetpunt. Tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypeen blauwe kleurings uitsluiting. Daarna bereidt u de celsuspensie voor op de vereiste concentratie. Bereken het totale aantal benodigde cellen. Voor 3D hepatosphere differentiatie, zaad 3,84 x 105 cellen per agarose microplaat voor het genereren van sferoïden met 100-150 μm in diameter. Breng het gewenste aantal cellen over in een steriele centrifugebuis van 15 mL of 50 mL en centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te pellet. Aspireren en gooi de supernatant en respenderen cellen in mTeSR1 medium plus 10 μM ROTSREMMER Y27632. Verdun de celpellet in de juiste hoeveelheid medium tot een eindconcentratie van 2,1 x 106 cellen/ml. Het zaaien van de cellen naar de bereide agarose microplatenOpmerking: als u de met koelkast opgeslagen agarose-microplaten gebruikt, plaats ze dan in de celincubator bij 37 °c gedurende ten minste een uur voorafgaand aan gebruik en aspireren de 1x DPBS van de put voordat de cel wordt seeding. Voeg 190 μL celsuspensie toe aan de agarose microwell. Na het zaaien, de platen terug naar de cel incubator bij 37 ° c en 5% CO2 voor 2 h om de cellen te laten vestigen. Voeg na 2 uur 1 mL vers en warm mTeSR1 medium toe, aangevuld met 10 μM ROTSREMMER Y27632 aan elk goed. Breng de platen terug naar de cel incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur en onderzoek de vorming van bollen de volgende dag om de cellen toe te voegen. 3. differentiëren van hPSCs naar 3D-Hepatosferen op agarose-micro putten Bereiding van poly 2-hydroxyethyl methacrylaat (poly-HEMA) gecoate putten Los 2 g poly-HEMA op in 100 mL 95% ethanol. Roer de oplossing ‘s nachts door een kookplaat bij 55 °C. Voeg 250 μL poly-HEMA oplossing per put van een 24-put plaat toe en droog ‘s nachts bij 60 °C met behulp van een oven. Voorbereiding van het differentiatie medium Bereid een 1, 000x stamoplossing van humaan activine a door het oplossen van menselijke activine een gelyofiliseerd eiwit in steriele 0,2% boviene serumalbumine (BSA)/DPBS tot een eindconcentratie van 100 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000. Bereid een 1, 000x stockoplossing van Wnt3a door het oplossen van de muis Wnt3a gelyofiliseerd eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Gebruik op 1:200. Bereid een 1, 000x stamoplossing van humane hepatocyten groeifactor (HGF) door het oplossen van humaan HGF gelyofiliseerd eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000. Bereid een 1, 000x stamoplossing van oncostatine M (OSM) voor door OSM in steriele 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 20 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000. Bereid een 1000x stamoplossing van de epitheliale groeifactor (EFG) uit door het gevriesdrooseerde eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000. Bereid een 1, 000x stamoplossing van de basis fibroblast-groeifactor (bFGF) uit door het gelyofiliseerde eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000. Bereid een 1, 000x stamoplossing van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in door het gelyofiliseerde eiwit in 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000. Maak endoderm-differentiatie medium bestaande uit Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium aangevuld met 2% B27 supplement (50x, zonder insuline) en 1% penicileen/streptomycine (eindconcentraties: 100 IE/mL en 100 μg/mL, respectievelijk). Tenzij aangegeven, bij elke gemiddelde verandering, het vereiste volume aanvullen met Wnt3a en activine a bij een eindconcentratie van respectievelijk 50 ng/mL en 100 ng/mL.Opmerking: Bewaren bij 4 °C en binnen twee weken gebruiken. Maak hepatoblast differentiatie medium bestaande uit knock-out Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (KO-DMEM) met 20% Knockout serum vervanging (KOSR) en aangevuld met 0,5% van een alternatieve aanvulling op L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,1 mM Beta-mercaptoethanol, 1% dimethylsulfoxide (DMSO), en 1% penicillaire/streptomycine (eindconcentraties bij respectievelijk 100 I.E./ml en 100 μg/mL). Filter onder vacuüm.Opmerking: Bewaren bij 4 °C en binnen twee weken gebruiken. Maken van hepatocyte rijpings medium bestaande uit hepatocyten medium aangevuld met 1% van een alternatieve aanvulling op L-glutamine, 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinaat natriumzout (HCC), 1% penicillaire/streptomycine (eindconcentraties bij 100 IE/mL en respectievelijk 100 μg/mL). Voor elke gemiddelde verandering, het vereiste volume aanvullen met OSM en HGF (eindconcentraties bij respectievelijk 20 ng/mL en 10 ng/mL).Opmerking: Bewaar de kolf op 4 °C en gebruik deze binnen twee weken. Maak hepatocyten onderhouds medium bestaande uit William’s E medium aangevuld met 10% Knockout serum vervanging, bestaande uit 1% van een alternatieve aanvulling op L-glutamine, 1% penicileen/streptomycine (eindconcentraties bij 100 IE/mL en 100 μg/mL, respectievelijk). Voor elke gemiddelde verandering, het vereiste volume aanvullen met HGF, EGF, bFGF en VEGF (eindconcentratie van elke groeifactor op 10 ng/mL).Opmerking: Bewaar de kolf op 4 °C en gebruik deze binnen twee weken. Controleer hepatosphere Formation 24 h post zaaien en initiëren hepatocyte differentiatie. Verwijder voorzichtig het mTeSR1 medium en vervang het door 1 mL vers endoderm differentiatie medium aangevuld met 100 ng/mL activine A en 50 ng/mL Wnt3a. Verandering aangevuld endoderm priming medium elke 24 h voor 3 dagen voor hESCs. Als u met hiPSCs werkt, Verleng deze fase dan nog eens 2 dagen om de media aan te vullen met activine a (100ng/mL) alleen. Na definitieve endoderm inductie, overschakelen naar hepatoblast differentiatie medium voor hepatoblast specificatie gedurende 5 dagen vervangen van het medium om de 2 dagen en voer de laatste wijziging op de laatste dag van de hepatoblast specificatie. Breng hepatosferen over in de poly-HEMA gecoate putten. Was de cellen eenmaal met hepatocyte maturatie medium zonder supplementen na het verwijderen van KSR/DMSO medium en voeg 1 mL hepatocyte maturatie medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM. Til met behulp van een P1000-Pipet de hepatosferen van de agarose-microplaat op door de oplossing meerdere malen omhoog en omlaag te pipetteren. Breng het medium met de hepatosferen over naar een poly-HEMA gecoat goed. Was de agarose-microplaat met 1 mL hepatocyte maturatie medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM en breng het medium over naar de poly-HEMA gecoat goed. Herhaal stap 3.6.4 zo vaak mogelijk om alle hepatosferen van de agarose-microplaat over te brengen.Opmerking: Het is van cruciaal belang om de oplossing met de hepatosferen voorzichtig omhoog en omlaag te pipetteren om beschadiging ervan te voorkomen. Voorzichtig aspireren overtollig medium zonder het verwijderen van hepatosferen met behulp van een P100 pipet tot ~ 1 mL medium met de hepatospheres blijft in de poly-HEMA gecoat goed. Verander het medium elke 48 h gedurende 12 dagen. Op dag 20 bij het werken met hESCs of dag 22 als u met hiPSCs werkt, schakelt u het medium in op hepatocyte Maintenance medium. Verwijder hepatocyte maturatie medium en spoel cellen eenmaal met hepatocyte onderhoudsmiddel zonder de supplementen. Voeg 1 mL hepatocyten onderhoudsmiddel toe, aangevuld met 10 ng/mL HGF, EGF, FGF en VEGF. Verander het medium voor vers hepatocyten onderhouds medium elke 48 h. 4. functionele analyse van lange termijn gekweekte 3D-Hepatosferen Overschakelen naar het maturatie medium van hepatocyten, aangevuld met 10 μM HCC, L-glutamine, 1% penicileen/streptomycine (eindconcentraties bij respectievelijk 100 I.E./ml en 100 μg/mL) en 10 ng/mL HGF 48 h voorafgaand aan het uitvoeren van de functionaalanalyse. Analyseer hepatocyte metabole functie met behulp van cytochroom (CYP) P450 assays. Vervang medium door 1 mL vers hepatocyte maturatie medium aangevuld met 50 μM luciferin-6’-pentafluoro-BENZYL ether (luciferin-PFBE) substraat om CYP3A basale activiteit te detecteren of 100 μM luciferin-methyl ether (luciferin-ME) substraat om CYP1A2 te detecteren basale activiteit (aantal replicaten = 3). Gebruik weefselkweek media als een negatieve controle.Opmerking: Om te voorkomen dat Kruisreactiviteit, het is aanbevolen om niet te gebruiken dezelfde putten met 3D-hepatosferen om verschillende CYP P450 activiteiten te testen, maar om ze uit te voeren in individuele putten. Incuberen de cellen voor 24 uur bij 37 ° C. Verzamel de supernatanten met een P100 pipetpunt en voer de test uit volgens de instructies van de fabrikant. Meet de relatieve niveaus van de basale activiteit en Normaliseer tot per mg eiwit zoals bepaald door de bicinchoninic acid assay (BCA). Test serumeiwit productie met behulp van enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Vervang medium door 1 mL vers hepatocyte maturatie medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM (aantal replicaten = 3). Gebruik weefselkweek media als een negatieve controle. Incuberen de cellen voor 24 uur bij 37 ° C. Verzamel de supernatant met behulp van een P100 pipetpunt en meet de relatieve niveaus van de serumproteïne productie volgens de instructies van de fabrikant. Normaliseren tot per mg eiwit zoals bepaald door de BCA-test. 5. immunocytochemie Bereiding van paraffine secties met lever bolletjes. Was de hepatosferen drie keer met 1x DPBS. Bevestig de hepatosferen met ijskoude methanol gedurende 30 minuten. Was drie keer met 1x DPBS. Sluit de hepatosferen in 300 μL van een getemperde oplossing van 2% agarose opgelost in H2O met behulp van een lege put van een 24-put plaat als een mal en laat het stollen gedurende 30 minuten. Integreer de agarose met hepatosferen in paraffine. Sectie het paraffine blok met vaste hepatosferen in 4 μm dikke delen met behulp van een microtoom. De-waxen en rehydratatie van de secties.Opmerking: gebruik verse oplossingen wanneer dat mogelijk is. Gebruik geen oplossingen die langer dan een week op de kleurings goot zijn geweest. Plaats secties in een diaprek. Dompel het schuif rooster onder met secties in een kleurenbak met 300 mL xyleen gedurende 5 min. Herhaal stap 5.2.2. Dompel je onder in absolute ethanol voor 20 sec. Dompel onder in 95% ethanol voor 20 sec. Dompel onder in 90% ethanol voor 20 sec. Dompel onder in 80% ethanol voor 20 sec. Dompel onder in 70% ethanol voor 20 sec. Hydrateer de delen met water gedurende 5 min.Opmerking: Houd de dia’s in hetzelfde schuif rooster en verplaats deze van de ene kleurenbak naar de volgende. Het gebruikte volume (over het algemeen ~ 300 mL) is afhankelijk van de grootte van de kleurings goot. Antigeen opvraging van paraffine secties met lever bolletjes. Verwarm de-gewaxt en gerehydrateerde delen in 1x tris-EDTA (TE) pH 9,0 bufferoplossing gedurende 15 minuten in een magnetron bij 800 W. Laat de monsters afkoelen door ze gedurende 5 minuten in kraanwater te dompelen. Immunokleuring. Inincuberen van dia’s met blokkerende oplossing van PBS met 0,1% Polysorbaat 20 (PBS/T)/10% BSA voor 1 uur bij RT. Vervang de blokkerende oplossing door het juiste primaire antilichaam verdund in PBS/T/1% BSA en inincuberen bij 4 °C met zachte opwinding ‘s nachts. Spoel cellen met PBS/T gedurende 5 minuten en herhaal drie keer. Inincuberen met het geschikte secundaire antilichaam, verdund in PBS/T/1% BSA en inincuberen in het donker bij RT voor 1 uur met zachte opwinding.Opmerking: De geoptimaliseerde primaire en secundaire antilichamen staan in de lijst van materialen. Spoel cellen met PBS/T gedurende 5 minuten en herhaal drie keer. Voeg 4 ‘, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe aan de cellen volgens de instructies van de fabrikant en plaats een glazen dekglaasje zachtjes om luchtbellen te verminderen. Houd vaste cellen bij 4 °C in het donker. Observeer de kleuring onder een microscoop met de juiste filter-en fluorescentielamp.Opmerking: Bewaar de platen bij 4 °c in het donker tot beeldvorming.