Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.
In situ hibridizasyon (ISH), araştırmacıların mRNA dağılımını yerinde incelemelerini sağlayan ve on yıllardır gelişim biyolojisinde kritik bir teknik olan önemli bir tekniktir. Geleneksel olarak, çoğu gen ekspresyonu çalışması, özellikle örnek kimliklerin a priori olarak bilinen durumlarda önyargıya yatkın bir yöntem olan ISH sinyalinin görsel değerlendirmesine dayanıyordu. Daha önce bu önyargıyı aşmak ve ISH sinyallerinin daha doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için bir yöntem rapor ettik. Burada, ISH lekeli embriyolara ilgi genlerinin ifade düzeylerini ölçmek ve buna karşılık gelen genotiplerle ilişkilendirmek için bu yöntemi uygulamak için basit bir kılavuz sayılacağız. Yöntem, karışık genotip örneklerinde mekansal olarak kısıtlı gen ekspresyonu sinyallerini ölçmek için özellikle yararlıdır ve geleneksel görsel puanlama yöntemlerine tarafsız ve doğru bir alternatif sağlar.
Genom düzenleme teknolojilerinin (ZFN, TALENs ve daha yakın zamanda CRISPR/Cas9) piyasaya sürülmesi, vivo’daki belirli genlerin işlevini incelemek için dünya çapında bu sistemlerden yararlanan laboratuvar sayısında büyük bir artışa yol açmıştır. Özellikle zebra balığı genetik manipülasyon için münasip ve birçok mutantlar yakın geçmiş1,2üretilmiştir. Gelişimsel biyologlar için, embriyonik gelişimde gen mutasyonlarının fenotipik sonuçlarını değerlendirmenin en yaygın yöntemlerinden biri yerinde hibridizasyondur (ISH). Homozigot mutantları yabani tiplerinden veya heterozigot kardeşlerinden ayıran bariz morfolojik kusurların yokluğunda, farklı genotipleri doğru bir şekilde tanımlayabilmek gerekir.
Klasik ISH, ilgi geni ile seçilen marker genleri arasındaki düzenleyici etkileşimler hakkında sonuçlar elde etmek için sinyal yoğunluklarının nitel analizlerine dayanır. Yararlı olsa da, bu analizler teknik farklılıklardan muzdariptir ve araştırmacı beklentilerine göre önyargılı olabilir. Böylece, ilgili genotip önceden bilgisi olmadan, ISH lekeli embriyolar görüntüleme sonra gen ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bunu etkili bir DNA çıkarma ve genotipleme izledi ve bu da gen ekspresyonu ile genotipi kantitatif olarak ilişkilendirmemizi sağladı3. Embriyosonrası ISH genotipleme önce kullanılmış olsa da4,5, ISH desenleri görüntü tabanlı niceleme yaygın çalışmaları bir çift dışında kullanılmamıştır6,7. En popüler alternatifler görsel puanlama veya ISH lekeli hücrelerin sayma güveniyor8,9,10, her ikisi de kötü tekrarlanabilirlik ve araştırmacı önyargı eğilimli. Bu yöntem, runx1 veya gata2bgibi mekansal olarak kısıtlanmış ifade desenleri ile genlerdeki değişiklikleri incelemek için özellikle yararlıdır , her ikisi de hemojenik endotel denilen aort taban hücrelerinin sınırlı bir alt kümesi ifade11,12.
Burada, Fiji13kullanarak görüntü analizi ile niceleme nin uygulanması için pratik bir kılavuz sağlamayı ve DNA çıkarma ve genotipleme protokolünü sağlamayı hedefliyoruz. Bu görsel olarak daha önce yayınlanmış yöntem3göstermek içindir. Yöntemimiz, ISH tarafından saptanan gen ekspresyonundaki varyasyonun doğru bir şekilde temsil edilmesine ve gen ekspresyonu düzeylerinin belirli genotiplere tarafsız bir şekilde atanmasına olanak sağlar.
Gen ekspresyonunu ölçmek için bu yöntemi kullanırken birkaç faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Ölçümler arasındaki değişkenliği azaltmak için görüntüleme koşulları deney boyunca (örneğin aydınlatma, maruz kalma süreleri ve embriyo konumlandırması) korunmalıdır. Numuneler arasındaki boyama farklılıkları maskelenebileceğinden, numunelerin aşırı boyanmasını önlemek için kritik bir nokta dır. Örneğin, Xenopus laevis embriyolarında Eto2 yokluğunda VegfA ekspresyonundaki azalma30 ancak 24 saatlik bir süre içinde dikkatlice izleyerek tespit edilebilir. Bu nedenle, doygunluğa ulaşmadan, ifadesini en iyi temsil eden her gen için yeterli boyama düzeylerini ampirik olarak belirlemek iyi bir uygulamadır. Overstaining ayrıca dönüştürülmüş 8 bitlik gri tonlama görüntülerinde arka plan pikselinin yoğunluğunu yapay olarak artıracak ve niceliklendirme sonuçlarını çarpıtacaktır. Ekstrem durumlarda, embriyonik dokularda arka plan düzeyi seçilen YG’deki ISH sinyalinden daha yüksek olabilir ve bu örnekler analizdışında tutulmalıdır. Benzer bir fenomen, lekesiz sarının arka plan düzeltmesi için uygunluğunu test ettiğimizde gözlenmiştir(Şekil 4). Ters çevirme ve 8-bit’e dönüştürmeden sonra, sarısı bölgesindeki koyu pikseller embriyodaki ISH sinyalinden daha parlak hale gelir ve arka plandaki düzeltilmiş değerleri negatif hale getirir. Böylece, arka plan düzeltme için sarısı kullanmaktan kaçının. Embriyodaki pigmentli alanlarda arka plan sinyalinin ölçülmesi (örneğin, gözler veya gövdenin sırt kısmı 26/28 hpf’den itibaren) nicel sonuçları eşit şekilde çarpıtacak ve ayrıca kaçınılmalıdır. Zebra balığı embriyolarının ISH18’den önce veya sonra beyazlatma protokolleri ve görüntüleme tavsiye edilmeden önce 24 hpf’den büyük embriyoların beyazlatma protokolleri vardır.
Bu yöntem, tanımlanmış bir alandaki piksel yoğunluğunu eşdeğer lekesiz bir alanda arka plan piksel yoğunluğuna göre ölçmeye dayandığından, her yerde bulunan veya her yerde ifade edilen genlerin olduğu gibi nicel olarak ölçülmesi için uygun değildir. Bunun yerine, arka plan piksel yoğunluğunu ölçmek için bir alanın kolayca tespit edilebildiği mekansal olarak sınırlı bir dağılıma sahip genlerin ekspresyonunu ölçmek için uygundur. Ek analizlerimiz şimdi, arka plan düzeltmesi için daha küçük bir alan (3-4kat daha küçük) kullanmanın, Yatırım Getirisi’ninkine eşdeğer bir alan kullanmaya benzer sonuçlar verdiğini göstermektedir. Bu, arka plan düzeltmesi için embriyonun açıkça lekelenmemiş alanlarını kullanabildiği sürece, yöntemin daha geniş uzamsal alanlarda ifade edilen genlere uygulanabilirliğini (ve dolayısıyla yoğunluk ölçümleri için daha büyük ROI’lar gerektiren) genişletir.
Son olarak, deneyci önyargısını en aza indirmek için genotiplemenin paralel olarak veya görüntü niceliği sonrasında yapılmasını öneriyoruz. İkinci bir deneyciden anonimleştirilmiş numuneler üzerindeki niceliği tekraretmesini ve ilk ölçüm kümesiyle karşılaştırmasını istemek de deneyci önyargısını azaltmaya yardımcı olacaktır. Ölçülecek görüntüler genotipleme gerektirmeyen tedaviler (örneğin, yabani tip vs kimyasal inhibitör veya vahşi tip vs MO nakavt) arasındaki bir karşılaştırmadan geliyorsa, ölçümleri yapan deneyci nin kimliği kör edilmelidir. Örnek.
The authors have nothing to disclose.
Oxford ve Birmingham’daki Biyomedikal Hizmetleri personeline mükemmel zebra balığı yetiştiriciliği için teşekkür ederiz. T.D. Wellcome Trust Kromozomu ve Gelişim biyolojisi doktora bursu (#WT102345/Z/13/Z) tarafından finanse edilmiştir. R.M. ve M.K. İngiliz Kalp Vakfı (BHF IBSR Bursu FS/13/50/30436) tarafından finanse edildi ve cömert destek için müteşekkir. R.M. BHF Araştırma Mükemmelliği Merkezi’nin (RE/13/1/30181), Oxford’dan destek aldığını kabul eder.
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
Excel | Microsoft | ||
F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
Fiji | |||
Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
Thermocycler | Thermofisher |