遺伝子編集技術により、研究者はゼブラフィッシュ変異体を生成して遺伝子機能を比較的容易に調べることができます。ここでは、ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーションシグナルの並列的な胚ジェノタイピングおよび定量化を行うガイドを提供する。この公平なアプローチは、in situハイブリダイゼーションに基づくフェノタイプ解析においてより高い精度を提供します。
in situ ハイブリダイゼーション (ISH) は、研究者が mRNA 分布を研究することを可能にする重要な技術であり、何十年もの間、発生生物学において重要な技術となっています。従来、ほとんどの遺伝子発現研究は、イシュシグナルの視覚的評価に依存していましたが、特にサンプルアイデンティティが先験的に知られている場合には、偏りが起こりやすい方法です。このバイアスを回避し、ISH信号をより正確に定量する方法について以前に報告しました。ここでは、この方法を適用して、ISH染色された胚に関心のある遺伝子の発現レベルを定量化し、その発現レベルを対応する遺伝子型と相関させる簡単なガイドを提示する。この方法は、混合遺伝子型のサンプル中の空間的に制限された遺伝子発現シグナルを定量化するのに特に有用であり、従来の視覚的スコアリング方法に代わる公平で正確な代替手段を提供する。
ゲノム編集技術(ZFN、TALEN、そして最近ではCRISPR/Cas9)の導入により、これらのシステムを利用して生体内の特定の遺伝子の機能を研究する世界中の研究室が大幅に増加しました。ゼブラフィッシュは特に遺伝子操作に適しており、最近では過去1,2で多くの変異体が生成されている。発生生物学者にとって、胚発生における遺伝子変異のフェノタイプな結果を評価する最も一般的な方法の1つは、その中でハイブリダイゼーション(ISH)である。ホモ接合体変異体を野生型または異種兄弟から分離する明らかな形態学的欠陥がない場合、異なる遺伝子型を正確に正確に識別できることが不可欠である。
従来のISHは、シグナル強度の質的分析に依存して、目的の遺伝子と選択されたマーカー遺伝子との間の調節相互作用に関する結論を導き出します。有用ですが、これらの分析は技術的な変動に苦しんでおり、研究者の期待に偏っている可能性があります。従って、イシュ染色胚をイメージングした後、対応する遺伝子型の予備知識なしに遺伝子発現を定量する方法が開発された。その後、遺伝子型と遺伝子発現3を定量的に相関させる効率的なDNA抽出とジェノタイピングが行われました。イシュ後の胚のジェノタイピングは4,5以前に使用されているが、画像ベースのISHパターンの定量は、いくつかの研究6、7とは別に広く用いられていない。最も一般的な選択肢は、ISH染色された細胞8、9、10の視覚的スコアリングまたはカウントに依存し、再現性と研究者バイアスが低い傾向があります。この方法は、runx1またはgata2bのような空間的に制限された発現パターンを有する遺伝子の変化を研究するのに特に有用であり、両方とも血原性内皮11,12と呼ばれる大動脈床細胞の制限されたサブセットで発現する。
ここでは、フィジー13を用いた画像解析による定量化の実用ガイドと、DNA抽出とジェノタイピングプロトコルを提供することを目指す。これは、以前に公開された方法3を視覚的に示すことを目的としたものです。我々の方法は、ISHによって検出された遺伝子発現の変動と、特定の遺伝子型への遺伝子発現レベルの偏った割り当てを正確に表すことを可能にする。
遺伝子発現を定量化するためにこの方法を使用する場合、いくつかの要因を考慮する必要があります。測定間の変動を低減するために、イメージング条件は実験全体(照明、露光時間、胚位置など)を維持する必要があります。重要な点は、サンプル間の染色の違いがマスクされる可能性があるため、サンプルの過剰染色を避けることです。例えば、ゼノプス・レービス胚30におけるEto2の不在時のVegfA発現の減少は、24時間にわたる染色を注意深くモニタリングすることによってのみ検出することができた。したがって、その発現を最もよく表す各遺伝子の適切な染色レベルを、飽和状態に達することなく経験的に決定することが良い習慣です。オーバーステインは、変換された 8 ビットグレースケール画像の背景ピクセル強度を人工的に増加させ、定量結果を歪めます。極端な場合、胚組織のバックグラウンドレベルは、選択されたROIのISHシグナルよりも高く、これらのサンプルは分析から除外されるべきである。同様の現象が見られたのは、未染色の黄身の背景補正の適合性をテストした場合です(図4)。反転して8ビットに変換すると、黄身領域の暗いピクセルは胚のISHシグナルよりも明るくなり、背景補正された値を否定的にレンダリングします。したがって、背景補正のために黄身の使用を避けてください。胚の色素領域(例えば、26/28 hpf以降の目または胴体の背側部分)のバックグラウンドシグナルを測定することは、定量結果を均等に歪め、また避けるべきである。イシュ18の前または後にゼブラフィッシュ胚を漂白するためのプロトコルがあり、イメージングが推奨される前に24 hpfより古い胚を漂白する。
この方法は、定義された領域のピクセル強度を、同等の非染色領域の背景ピクセル強度に対して測定する必要があるため、ユビキタスまたはほぼユビキタスに発現した遺伝子の定量には適切ではない。その代わり、背景ピクセルの強度を測定する領域を容易に同定できる空間的に制限された分布を持つ遺伝子の発現を測定する場合に適しています。今回の追加分析では、バックグラウンド補正に小さい面積(3~4倍小さい)を使用すると、ROIと同等の面積を使用する場合と同様の結果が得られます。これは、バックグラウンド補正のために胚の明らかに染色されていない領域を使用できる限り、より広い空間ドメインで発現される遺伝子に対する方法の適用性を拡張する(したがって、強度測定のためにより大きなROIを必要とする)。
最後に、実験者のバイアスを最小限に抑えるために、ジェノタイピングを並列または画像定量後に実行することを提案する。2人目の実験者に匿名化されたサンプルの定量を繰り返し、最初の測定値と比較するように依頼すると、実験者のバイアスを減らすのにも役立ちます。定量化する画像がジェノタイピングを必要としない治療(例えば、野生型対化学阻害剤または野生型対MOノックダウン)の比較からである場合、測定を行う実験者は、その同一性に目がくらむべきである。サンプル。
The authors have nothing to disclose.
オックスフォードとバーミンガムのバイオメディカルサービスのスタッフに、素晴らしいゼブラフィッシュの夫に感謝したいと思います。T.D.はウェルカムトラスト染色体および発生生物学博士課程奨学金(#WT102345/Z/13/Z)によって資金提供されました。R.M.とM.K.は英国心臓財団(BHF IBSRフェローシップFS/13/50/30436)から資金提供を受けており、彼らの寛大な支援に感謝しています。R.M.は、オックスフォードのBHFリサーチ・エクセレンス・センター(RE/13/1/30181)からの支援を認めています。
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
Excel | Microsoft | ||
F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
Fiji | |||
Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
Thermocycler | Thermofisher |