כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה
Summary
טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.
Abstract
היברידיזציה באתרו (ISH) היא טכניקה חשובה המאפשרת לחוקרים ללמוד התפלגות mRNA באתרו והייתה טכניקה קריטית בביולוגיה התפתחותית במשך עשורים. באופן מסורתי, רוב המחקרים ביטוי גנים הסתמך על הערכה חזותית של האות ISH, שיטה הנוטה הטיה, במיוחד במקרים שבהם זהויות לדוגמה ידועים בפריורי. אנו דיווחו בעבר על שיטה לעקוף הטיה זו ולספק כימות מדויקות יותר של אותות ISH. כאן, אנו מציגים מדריך פשוט כדי להחיל שיטה זו כדי לכמת את רמות הביטוי של גנים של עניין עוברים ויטראז ולתאם את זה עם גנוסוגים המתאימים שלהם. השיטה היא שימושית במיוחד כדי לכמת ביטוי מוגבל של גנים מוגבלים בדגימות של גנוטיפים מעורבים והוא מספק חלופה משוחדת ומדויקת לשיטות הניקוד המסורתי ויזואלי.
Introduction
המבוא של טכנולוגיות עריכת הגנום (ZFN, TALENs ולאחרונה, CRISPR/Cas9) הובילה לעלייה מסיבית במספר מעבדות ברחבי העולם העושים שימוש במערכות אלה כדי ללמוד את הפונקציה של גנים ספציפיים vivo. Zebrafish במיוחד הם לקלה מניפולציה גנטית ומוטציות רבות נוצרו בעבר האחרון1,2. עבור ביולוגים התפתחותיים, אחת השיטות הנפוצות ביותר כדי להעריך את ההשלכות הפנותיות של מוטציות גנים בפיתוח עובריים הוא באתרו היברידיזציה (ISH). בהעדר פגמים מורפולוגיים ברורים המפרידים בין מוטציות homozygous מסוג פראי שלהם או heterozygous אחים, זה חיוני כדי לזהות כראוי גנוטיפים שונים במדויק.
ה-ISH הקלאסי מסתמך על ניתוחים איכותניים של עוצמות האות כדי לגזור מסקנות בנוגע לאינטראקציות רגולטוריות בין גן הריבית והגנים המסומנים בסמן. למרות שהיא שימושית, מנתח זה סובל מווריאציה טכנית ועשוי להיות מוטה בציפיות החוקרים. לפיכך, פותחה שיטה לכמת ביטוי גנים לאחר שעברו הדמיה של העוברים ויטראז ‘, ללא ידע מוקדם של גנוטיפ המקביל. זה היה לאחר הפקת דנ א יעיל והקלדה שאפשרו לנו גנוטיפ כמותית עם ביטוי גנים3. בעוד את ה-גנופיקציה של העוברים פוסט ish כבר בשימוש לפני4,5, התמונה מבוסס הכמת של תבניות ISH לא היה בשימוש נרחב מלבד כמה מחקרים6,7. החלופות הפופולריות ביותר מסתמכות על הניקוד החזותי או על הספירה של תאים מוכתמים בעלי ערך8,9,10, שניהם נוטים להיות מוכתמים ירודים וחוקר הטיה. שיטה זו שימושית במיוחד כדי ללמוד שינויים בגנים עם דפוסי הביטוי כי הם מוגבלים מרחב, כגון runx1 או gata2b, שניהם מבוטא מערכת מוגבלת של תאי הרצפה של אבי העורקים המכונה המוגלובין אנדותל11,12.
כאן, אנו שואפים לספק מדריך מעשי ליישום הקוונפיקציה על ידי ניתוח תמונה באמצעות פיג’י13, כמו גם את הפקת ה-DNA ואת פרוטוקול גנוהקלדה. זה נועד להמחיש חזותית שיטה שפורסמה בעבר שלנו3. השיטה שלנו מאפשרת ייצוג מדויק של הווריאציה ביטוי הגנים שזוהו על ידי ISH ו הקצאה משוחדת של רמות ביטוי גנים לגנוסוגים ספציפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לשקול מספר גורמים כאשר משתמשים בשיטה זו לכמת את הביטוי הגנטי. יש לשמור על תנאי ההדמיה במהלך הניסוי (לדוגמה, תאורה, זמני חשיפה ומיצוב העובר) כדי לצמצם את השונות בין המידות. נקודה קריטית היא להימנע מצביעת הדגימות, מכיוון שהבדלים בין הדגימות עשויים להיות רעולי פנים. למשל, הירידה בביטוי של ולפה בהעדר Eto2 ב קסנפוס זריזה העוברים30 ניתן להבחין רק על ידי כתמים ניטור בזהירות על פני תקופה של 24 שעות. לכן, זה אימון טוב כדי מדעית לקבוע רמות מכתים הולם עבור כל הגן הטוב ביותר לייצג את הביטוי שלה, מבלי להגיע לרוויה. כתמים מיותר גם להגדיל באופן מלאכותי את עוצמת פיקסלים ברקע בתמונות בגווני אפור שהומרו 8-bit ולהטות את תוצאות הקוונרה. במקרים קיצוניים, רמת הרקע ברקמות עובריים עשויה להיות גבוהה יותר מאשר האות ISH ב-ROI שנבחר ואין לכלול בדוגמאות אלה מהניתוח. תופעה דומה נצפתה כאשר בדקנו את התאמתו של החלמון הבלתי מוכתם לתיקון רקע (איור 4). לאחר היפוך והמרה של 8-bit פיקסלים כהים באזור החלמון להיות בהירים יותר מאשר אות ISH בעובר ולהפוך את הרקע מתוקן ערכים שליליים. כך, למנוע את השימוש בחלמון לתיקון רקע. מדידת אות הרקע באזורי פיגמנט בעובר (למשל, את העיניים או את החלק המאחור של הגזע מ 26/28 hpf ואילך) יהיה להטות באופן שווה את תוצאות כימות וצריך גם להימנע. ישנם פרוטוקולים זמינים עבור עוברי הלבנת דגים, או לפני או אחרי ISH18 ו עוברים הלבנת מעלה 24 hpf לפני מומלץ הדמיה.
מאחר ששיטה זו מסתמכת על מדידת עוצמת הפיקסלים באזור מוגדר כנגד עוצמת פיקסלים ברקע באזור שאינו מוכתם באופן שווה, אין זה מתאים לכמת של גנים מסוימים או כמעט בלתי-מוגדרים. במקום זאת, הוא מתאים היטב למדידת ביטוי של גנים עם התפלגות מוגבלת מרחב שבו אזור למדידת עוצמת פיקסל ברקע ניתן לזהות בקלות. הניתוח הנוסף שלנו מרמז כעת כי באמצעות שטח קטן יותר (3-4x קטן יותר) עבור תיקון רקע תשואות תוצאות דומות לשימוש באזור שווה ערך לזה של ההחזר. זה מרחיב את הישימות של השיטה לגנים הביע תחומים רחבים יותר (ובכך דורשים ROIs גדול יותר עבור מדידות אינטנסיביות), כל עוד אפשר להשתמש באזורים ברורים בלתי מוכתמים של העובר לתיקון הרקע.
בסופו של דבר, אנו מציעים שהגנוטיפים יבוצעו במקביל או לאחר כימות התמונה כדי למזער את הטיית הניסויים. בקשת ניסויים שנייה כדי לחזור על הפחתת הדגימה על דגימות אנניטיות ולהשוות עם הערכה הראשונה של המידות תסייע גם להפחית את ההטיה באמצעות מזהה. אם התמונות שניתן לכמת הן מהשוואה בין טיפולים שאינם דורשים גנוטיפ (למשל, סוג פראי לעומת מעכב כימי או סוג פראי לעומת MO הסתרה), הניסויים לבצע את המידות צריך לעוור את זהותו של ה דוגמה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוני להודות לצוות השירותים הביו-רפואיים באוקספורד וברמינגהאם עבור גידול דגים מעולה. T.D. היה ממומן על ידי כרומוזום אמון ברוכים ה#WT102345 בביולוגיה התפתחותית מלגה לדוקטורט (בשנת המאה השלוש/13/Z). עקב חומרי גלם ו-מ. מ. מומן על ידי קרן הלב הבריטית (BHF IBSR מלגת/13/50/30436) ומודים על תמיכתם הנדיבה. עקב חומרי גלם מכיר תמיכה ממרכז BHF של מצוינות מחקר (RE/13/1/30181), אוקספורד.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
References
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
- Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
- Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
- Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
- Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
- Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
- Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
- Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
- Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
- Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
- El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
- Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).
