Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.
In situ hybridisatie (ISH) is een belangrijke techniek die onderzoekers in staat stelt om mRNA-distributie in situ te bestuderen en al tientallen jaren een kritische techniek in ontwikkelingsbiologie is. Traditioneel, de meeste genexpressie studies gebaseerd op visuele evaluatie van het ISH-signaal, een methode die gevoelig is voor bias, met name in gevallen waarin monster identiteiten bekend zijn a priori. We hebben eerder gerapporteerd over een methode om deze bias te omzeilen en een nauwkeurigere kwantificering van ISH-signalen te bieden. Hier presenteren we een eenvoudige gids om deze methode toe te passen om de expressieniveaus van genen van belang in MET ISH bevlekte embryo’s te kwantificeren en dat te correleren met hun overeenkomstige genotypen. De methode is bijzonder nuttig om ruimtelijk beperkte genexpressiesignalen te kwantificeren in monsters van gemengde genotypen en biedt een onbevooroordeeld en nauwkeurig alternatief voor de traditionele visuele scoringsmethoden.
De introductie van genoombewerkingstechnologieën (ZFN, TALENs en meer recent, CRISPR/Cas9) heeft geleid tot een enorme toename van het aantal laboratoria over de hele wereld die gebruik maken van deze systemen om de functie van specifieke genen in vivo te bestuderen. Met name zebravissen zijn vatbaar voor genetische manipulatie en er zijn in het recente verleden veel mutanten gegenereerd1,2. Voor ontwikkelingsbiologen is een van de meest voorkomende methoden om de fenotypische gevolgen van genmutaties in de embryonale ontwikkeling te beoordelen in situ hybridisatie (ISH). Bij afwezigheid van duidelijke morfologische gebreken die homozygoot mutanten scheiden van hun wilde type of heterozygoot broers en zussen, is het essentieel om verschillende genotypen nauwkeurig te kunnen identificeren.
Het klassieke ISH baseert zich op kwalitatieve analyses van signaalintensiteiten om conclusies te trekken over regulerende interacties tussen het gen van belang en geselecteerde markergenen. Hoewel nuttig, deze analyses lijden aan technische variatie en kan worden beïnvloed door de verwachtingen van onderzoekers. Zo werd een methode ontwikkeld om genexpressie te kwantificeren na beeldvorming van ISH-gekleurde embryo’s, zonder voorkennis van het overeenkomstige genotype. Dit werd gevolgd door een efficiënte DNA-extractie en genotypering die ons in staat stelde om het genotype kwantitatief te correleren met genexpressie3. Hoewel de genotypering van embryo’s na ISH vóór4,5is gebruikt, is op beeld gebaseerde kwantificering van ISH-patronen niet op grote schaal gebruikt, afgezien van een paar studies6,7. De meest populaire alternatieven vertrouwen op visuele score of telling van ISH-gekleurde cellen8,9,10, zowel gevoelig voor slechte reproduceerbaarheid en onderzoeker bias. Deze methode is vooral nuttig om veranderingen in genen te bestuderen met expressiepatronen die ruimtelijk beperkt zijn, zoals runx1 of gata2b, beide uitgedrukt in een beperkte subset van aortabodemcellen, het hemogene endotheel11,12.
Hier streven we ernaar om een praktische gids te geven voor de implementatie van de kwantificering door beeldanalyse met behulp van Fiji13,evenals het DNA-extractie- en genotyperingsprotocol. Dit is bedoeld om onze eerder gepubliceerde methode3visueel te illustreren. Onze methode maakt een nauwkeurige weergave van de variatie in genexpressie gedetecteerd door ISH en een onpartijdige toewijzing van genexpressieniveaus aan specifieke genotypen.
Bij het gebruik van deze methode moet rekening worden gehouden met enkele factoren om genexpressie te kwantificeren. De beeldvormingsomstandigheden moeten gedurende het hele experiment (bijvoorbeeld verlichting, belichtingstijden en embryopositionering) worden gehandhaafd om de variabiliteit tussen metingen te verminderen. Een kritiek punt is om overvlekken van de monsters te voorkomen, omdat verschillen in kleuring tussen monsters kunnen worden gemaskeerd. Zo kon de afname van vegfa-expressie bij afwezigheid van Eto2 in Xenopus laevis embryo’s30 alleen worden gedetecteerd door de kleuring gedurende een periode van 24 uur zorgvuldig te controleren. Zo is het een goede gewoonte om empirisch te bepalen adequate kleuring niveaus voor elk gen dat het beste vertegenwoordigen zijn expressie, zonder het bereiken van verzadiging. Overstaining verhoogt ook kunstmatig de intensiteit van de achtergrondpixel in de geconverteerde 8-bits grijswaardenafbeeldingen en scheeftrekken de kwantificeringsresultaten. In extreme gevallen kan het achtergrondniveau in embryonale weefsels hoger zijn dan het ISH-signaal in de geselecteerde ROI en moeten deze monsters van de analyse worden uitgesloten. Een soortgelijk verschijnsel werd waargenomen toen we de geschiktheid van de onbevlekte dooier testten op achtergrondcorrectie (figuur 4). Na inversie en conversie naar 8-bits worden de donkere pixels in het dooiergebied helderder dan het ISH-signaal in het embryo en maken de achtergrond gecorrigeerde waarden negatief. Vermijd dus het gebruik van de dooier voor achtergrondcorrectie. Het meten van het achtergrondsignaal in gepigmenteerde gebieden in het embryo (bijvoorbeeld de ogen of het rugdeel van de stam vanaf 26/28 pkf) zal de kwantificeringsresultaten eveneens scheeftrekken en ook worden vermeden. Er zijn protocollen beschikbaar voor het bleken van zebravisembryo’s, voor of na ISH18 en het bleken van embryo’s ouder dan 24 pk f voordat beeldvorming wordt aanbevolen.
Omdat deze methode is gebaseerd op het meten van de pixelintensiteit in een bepaald gebied tegen een achtergrondpixelintensiteit in een gelijkwaardig niet-gekleurd gebied, is het niet geschikt voor het kwantificeren van alomtegenwoordige of bijna alomtegenwoordig uitgedrukte genen zoals het is. In plaats daarvan is het zeer geschikt voor het meten van expressie van genen met een ruimtelijk beperkte verdeling waar een gebied voor het meten van de pixelintensiteit op de achtergrond gemakkelijk kan worden geïdentificeerd. Onze aanvullende analyse suggereert nu dat het gebruik van een kleiner gebied (3-4x kleiner) voor achtergrondcorrectie vergelijkbare resultaten oplevert als het gebruik van een gelijkwaardig gebied als dat van de ROI. Dit breidt de toepasbaarheid van de methode uit op genen uitgedrukt in bredere ruimtelijke domeinen (en dus grotere ROI’s nodig voor intensiteitsmetingen), zolang men duidelijk ongekleurde gebieden van het embryo kan gebruiken voor achtergrondcorrectie.
Ten slotte stellen we voor dat de genotypering parallel of na de beeldkwantificatie wordt uitgevoerd om de bias van de onderzoeker te minimaliseren. Het vragen van een tweede experimentator om de kwantificering op geanonimiseerde monsters te herhalen en te vergelijken met de eerste reeks metingen zal ook helpen bij het verminderen van experimentatorbias. Als de te kwantificeren beelden afkomstig zijn van een vergelijking tussen behandelingen waarvoor geen genotype vereist is (bijvoorbeeld wild type vs chemische remmer of wild type vs. MO knockdown), moet de experimentator die de metingen uitvoert, worden verblind door de identiteit van de Monster.
The authors have nothing to disclose.
We willen het personeel van Biomedical Services in Oxford en Birmingham bedanken voor een uitstekende zebravishouderij. T.D. werd gefinancierd door een Wellcome Trust Chromosoom en Ontwikkelingsbiologie PhD Scholarship (#WT102345/Z/13/Z). R.M. en M.K. werden gefinancierd door de British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) en zijn dankbaar voor hun genereuze steun. R.M. erkent de steun van het BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
Excel | Microsoft | ||
F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
Fiji | |||
Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
Thermocycler | Thermofisher |