الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي
Summary
وقد مكنت تقنيات تحرير الجينات الباحثين من توليد طفرات حمار وحشي للتحقيق في وظيفة الجينات بسهولة نسبية. هنا، نقدم دليلا ً لإجراء الجينة المتوازية للجنين والقياس الكمي لإشارات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي. ويوفر هذا النهج غير المتحيز دقة أكبر في التحليلات الظاهرية القائمة على التهجين في الموقع.
Abstract
التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية هامة تمكن الباحثين من دراسة توزيع مرنا في الموقع وكانت تقنية حاسمة في علم الأحياء التنموي لعقود. تقليدياً، اعتمدت معظم دراسات التعبير الجيني على التقييم البصري لإشارة ISH، وهي طريقة عرضة للتحيز، لا سيما في الحالات التي تكون فيها هويات العينة معروفة مسبقاً. لقد سبق لنا أن أبلغنا عن طريقة للتحايل على هذا التحيز وتوفير كمية أكثر دقة لإشارات ISH. هنا، نقدم دليلبسيط لتطبيق هذه الطريقة لتحديد مستويات التعبير من الجينات ذات الاهتمام في الأجنة الملطخة بـ ISH وربط ذلك مع الأنماط الجينية المقابلة لها. وهذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لقياس إشارات التعبير الجيني المقيدة مكانياً في عينات من الأنماط الجينية المختلطة، كما أنها توفر بديلاً غير متحيز ودقيقاً لأساليب التهديف البصرية التقليدية.
Introduction
وقد أدى إدخال تكنولوجيات تحرير الجينوم (ZFN، TALENs ومؤخرا، CRISPR/Cas9) إلى زيادة هائلة في عدد المختبرات في جميع أنحاء العالم التي تستخدم هذه النظم لدراسة وظيفة جينات محددة في الجسم الحي. حمار وحشي على وجه الخصوص قابلة للتلاعب الجيني وقد تم إنشاء العديد من المسوخ في الماضي القريب1،2. بالنسبة لعلماء الأحياء التطوري، فإن إحدى الطرق الأكثر شيوعًا لتقييم العواقب الظاهرية للطفرات الجينية في التطور الجنيني هي التهجين في الموقع (ISH). في غياب عيوب مورفولوجية واضحة تفصل المسوخ المتجانسة عن نوعها البري أو الأشقاء المتغايرين ، فمن الضروري أن تكون قادرًا على تحديد الأنماط الجينية المختلفة بشكل صحيح بدقة.
تعتمد الـ ISH الكلاسيكية على التحليلات النوعية لكثافة الإشارة لاستخلاص استنتاجات حول التفاعلات التنظيمية بين جين الاهتمام وجينات العلامات المختارة. وعلى الرغم من أن هذه التحليلات مفيدة، فإن هذه التحليلات تعاني من الاختلاف التقني وقد تكون متحيزة من قبل توقعات الباحثين. وهكذا، تم تطوير طريقة لقياس التعبير الجيني بعد تصوير الأجنة الملطخة بـ ISH، دون معرفة مسبقة بالنمط الجيني المقابل. وأعقب ذلك استخراج الحمض النووي الفعال والجينية التي سمحت لنا لربط كميا النمط الجيني مع التعبير الجيني3. في حين أن الجينوجية من الأجنة بعد ISH قد استخدمت قبل4،5، صورة على أساس القياس الكمي من أنماط ISH لم تستخدم على نطاق واسع وبصرف النظر عن اثنين من الدراسات6،7. البدائل الأكثر شعبية تعتمد على تسجيل البصرية أو عد الخلايا الملطخة ISH8،9،10، على حد سواء عرضة لضعف الاستنساخ وتحيز الباحث. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة التغيرات في الجينات ذات أنماط التعبير المقيدة مكانًا ، مثل runx1 أو gata2b، وكلاهما يعبر عنه في مجموعة فرعية مقيدة من خلايا الأرضية الأبهرية تسمى بطانة الأيفيجينية11،12.
هنا ، ونحن نهدف إلى توفير دليل عملي لتنفيذ القياس الكمي عن طريق تحليل الصور باستخدام فيجي13، فضلا عن استخراج الحمض النووي وبروتوكول الجينوبة. والمقصود من هذا هو توضيح بصريا لدينا طريقة نشرت سابقا3. تسمح طريقتنا بتمثيل دقيق للاختلاف في التعبير الجيني الذي تم اكتشافه بواسطة ISH وتعيين غير متحيز لمستويات التعبير الجيني لأنماط جينية محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وينبغي النظر في عدد قليل من العوامل عند استخدام هذه الطريقة لقياس التعبير الجيني. يجب الحفاظ على ظروف التصوير طوال التجربة (على سبيل المثال الإضاءة وأوقات التعرض وتحديد موضع الجنين) للحد من التباين بين القياسات. نقطة حرجة هي تجنب تلطيخ العينات ، حيث قد تكون الاختلافات في تلطيخ بين العينات ملثمين. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن انخفاض في التعبير VegfA في غياب Eto2 في أجنة زينوبوس laevis 30 فقط عن طريق مراقبة تلطيخ بعناية على مدى فترة 24 ساعة. وبالتالي، فمن الممارسات الجيدة لتحديد تجريبي مستويات تلطيخ كافية لكل جين التي تمثل التعبير على أفضل وجه، دون الوصول إلى التشبع. كما سيؤدي التلطيخ المفرط إلى زيادة كثافة بكسل الخلفية بشكل مصطنع في الصور الرمادية المحولة 8 بت وانحراف نتائج الكمية. في الحالات القصوى، قد يكون مستوى الخلفية في الأنسجة الجنينية أعلى من إشارة ISH في عائد الاستثمار المحدد ويجب استبعاد هذه العينات من التحليل. ولوحظت ظاهرة مماثلة عندما اختبرنا مدى ملاءمة صفار غير ملطخ لتصحيح الخلفية(الشكل 4). بعد الانعكاس والتحويل إلى 8 بت تصبح البيكسلات الداكنة في منطقة الصفار أكثر إشراقًا من إشارة ISH في الجنين وتجعل القيم المصححة في الخلفية سلبية. وبالتالي، تجنب استخدام صفار لتصحيح الخلفية. قياس إشارة الخلفية في المناطق المصطبغة في الجنين (على سبيل المثال، العينين أو الجزء الظهري من الجذع من 26/28 hpf فصاعدا) سوف يؤدي بنفس القدر إلى انحراف نتائج الكمية وينبغي أيضا تجنبها. هناك بروتوكولات متاحة لتبييض أجنة حمار وحشي، إما قبل أو بعد ISH18 وتبييض الأجنة الأكبر من 24 hpf قبل الموصى به التصوير.
لأن هذه الطريقة تعتمد على قياس كثافة بكسل في منطقة محددة على كثافة بكسل الخلفية في منطقة غير ملطخة مكافئة، فإنه ليس من المناسب لكمية الجينات في كل مكان أو ما يقرب من كل مكان كما هو. بدلاً من ذلك، فإنه مناسب تماماً لقياس التعبير عن الجينات مع توزيع مقيد مكانياً حيث يمكن تحديد منطقة لقياس كثافة بكسل الخلفية بسهولة. يشير تحليلنا الإضافي الآن إلى أن استخدام مساحة أصغر (3-4x أصغر) لتصحيح الخلفية يؤدي إلى نتائج مماثلة لاستخدام مساحة مكافئة لمساحة عائد الاستثمار. وهذا يوسع نطاق انطباق الطريقة على الجينات المعرب عنها في مجالات مكانية أوسع (وبالتالي تتطلب المزيد أكبر من ROل قياسات الكثافة)، طالما يمكن للمرء أن يستخدم مناطق غير ملطخة بوضوح من الجنين لتصحيح الخلفية.
وأخيراً، نقترح أن يتم تنفيذ الجينوبة بالتوازي أو بعد كمية الصورة لتقليل التحيز المجرب. كما أن الطلب من مجرب ثانٍ لتكرار الكمية على عينات مجهولة الهوية ومقارنتها بالمجموعة الأولى من القياسات سيساعد أيضًا في تقليل تحيز المجرب. إذا كانت الصور التي سيتم قياسها كمياً هي من مقارنة بين العلاجات التي لا تتطلب الجينوغرافيا (على سبيل المثال، النوع البري مقابل المثبط الكيميائي أو النوع البري مقابل الضربة القاضية MO)، يجب أن يعمي المجرب الذي يقوم بالقياسات عن هوية عينه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الموظفين في الخدمات الطبية الحيوية في أكسفورد وبرمنغهام لتربية حمار وحشي ممتازة. تم تمويل T.D. من قبل منحة دكتوراه في علم الأحياء التطوري ويلكوم الاستئماني (#WT102345/Z/13/Z). تم تمويل R.M. و M.K. من قبل مؤسسة القلب البريطانية (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) وهما ممتنان لدعمهما السخي. تقر ر. م. بالدعم المقدم من مركز التميز البحثي في البوسنة والهرسك (RE/13/1/30181)، أكسفورد.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
References
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
- Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
- Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
- Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
- Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
- Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
- Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
- Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
- Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
- Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
- El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
- Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).
