RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

1. Büyüme ve tiyo etiketleme NOT: Protokolün bu bölümünün tamamlanma süresi, hücre büyüme hızına bağlı olarak son derece değişkendir. Thio-labelling’den önce çözümleri ve ekipmanları hazırlamasına 1 saat ve numuneleri işlemek için 30 dk etiketleme sonrası izin verin. S. cerevisiae suşunun hücreiçine 4tU ithalatınıartırmak için permaz (Tablo 1) kodlayan bir plazmid içerdiğinden emin olun.NOT: İthalatçı olmadan, 2 dakikadan daha az etiketlemenin başarılı olması olası değildir11 (Bkz. Ek Şekil1). 4tU birleşme büyüme urasil olmadan orta ise daha verimlidir, bu nedenle zorlanma URA3+olmalıdır; Tablo 1’deki plazmidlerin bir çoğu URA3’ü işaretleyici olarak taşır. Eğer bu protokol β-est AID tükenmesi7ile birlişecekse, ek gerinim modifikasyonları gereklidir. Amino asitler olmadan 6,9 g maya azot tabanı, 20 g glikoz ve 1,92 g SCSM tek açılır−ura(MalzemeTablosu) ilave ederek YMM urasil içermeyen ortamı 1 L suya hazırlayın. Otoklav veya filtre kullanmadan önce büyüme ortamısterilize.NOT: Filtre sterilizasyonu, numune toplamada kullanılan metanoldeki hücrelerle birlikte çökeltme ile üretilen peptit/şeker kompleksleri olarak tercih edilir. YMM urasil içermeyen ortamda mayayı 600 nm (OD600)0,6−0,8 optik yoğunluğa yetiştirin. Kültürün günlük aşamasında büyüdüğünü ve en az iki katına çıktığını sağlayın. 30 °C’de büyüme normalde tavsiye edilir, ancak diğer sıcaklıklar, örneğin, ısıya duyarlı suşlar için kullanılabilir.NOT: Gerinim, büyüme koşulları ve RNA verime bağlı olarak yaklaşık 30 mL numune hacmine ihtiyaç duyulacaktır. Bu tutar protokol boyunca kabul edilecektir. Kültürün 30 mL metanol 20 mL ile 50 mL santrifüj tüp içine sığacak en, bu yüzden optimizasyon başlatmak için uygun bir hacimdir. RNA iyileşmesini artırmak için erken zaman noktaları için daha fazla numune hacmi kullanmayı düşünün, 2000 mL’ye kadar çok kısa etiketleme zamanlarında (<1 dk) yavaş büyüyen hücreler için kullanılmıştır. Buz üzerinde H2O yaklaşık 50 mL chill. Her numune için 2 mL vidalı tüpe 200 μL zirkon boncuk ekleyin ve buz üzerinde soğutun. Ayrıca 50 mL santrifüj tüpler içine 20 mL metanol (DİkKAT) koyun ve kuru buz (DİkKAT) üzerine yerleştirin. Metanol 1/3 için 2/3 örnek hacmi olmalıdır.DİkKAT: Metanol inhalasyon, temas ve tüketim ile toksiktir. Bir duman kaputunda büyük hacimlerde dağıtın ve metanol nitril laboratuvar eldivennüfuz gibi eldiven iki çift giymek. Metanol son derece yanıcı, ateşleme tüm kaynaklardan uzak tutun.NOT: Kuru buz temasta soğuk yanıklara neden olabileceği ve asfik gaz ürettiği için, iyi havalandırılan bir alanda eldiven kullanın ve kullanın.NOT: Bu noktada boncukların eklenmesi, tüp kuruduğundan ve hücre peletinden aşağı doğru dönerken, boncukların da tüp ipliğinden biraz zaman kazandırdığı için numune eklendiğinden daha kolaydır. Ayrıca, bu örnek eklenmeden önce boncuk soğumasını sağlar. Bir S. pombe başak kültüre eklenecekise (daha sonra değil), iyice buz ve girdap üzerinde tiolated S. pombe hücrelerinin bir aliquot çözülme, en az 30 s, sonra kültürekleyebilirsiniz. Aşağıdaki talimatlara göre hazırlanırsa, bir S. pombe aliquot 400 mL kültür için yeterlidir (on iki 30 mL numune için yeterli artı biraz işleme hataları için izin vermek için). Az ya da çok kültür kullanılıyorsa, kültüre eklenen S. pombe’nin hacmini ayarlayın. S. cerevisiaeiçin protokolde açıklandığı gibi OD600 için 0,8 tam olarak 1 L Pombe kültür grow . Adım 1.7 olarak Thio-etiket, ama 10 dakika için. Temelde adım 1.9 açıklandığı gibi, kuru buz üzerinde 400 mL metanol kullanarak tüm kültürü düzeltin. 3 dk için 3000 x g santrifüj ile hücre pelet. Supernatant atın ve H2O 3.3 mL hücre pelet resuspend. Her biri 80 μL’lik aliquots’a bölün. -80 °C’de saklayın. 400 mL kültür veya 30 mL numune başına 10 μL için bir aliquot’un tümlerini kullanın.NOT: RNAseq performans 1 /10 başak hacmini azaltın. Aliquots’u yeniden kullanmayın; kullanılmayan herhangi bir çivi atın. Bu başak normalleştirmek ve zaman noktaları ve deneyler arasında sonuçları karşılaştırmak için yararlıdır. Kesintili etiketleme için, gerekli metabolik tedirginliği (örneğin, büyüme koşulları, gen indüksiyonu veya β-est AID7 (Şekil2 ve Ek Şekil2) gibi tükenmesi gibi, kültürü bölerek ikna edin. Tüm şişelerin ve ortamların istenilen sıcaklıkta olduğundan emin olun ve mümkünse kültürü eklemeden önce ortamı aerate edin. 10 μM’lik bir konsantrasyona kültüre 4tU ekleyinve şiddetle karıştırın (1 /1000 mM 4tU kültür hacminin 1 M NaOH içinde çözünmüş). 15 s 5 dk için Thiol-etiket.NOT: Otuz saniye iyi bir başlangıç noktasıdır. 20’den az s için thio-etiketleme zaman baskısı altında kültür manipüle zorluklar nedeniyle daha değişken sonuçlar verir. Ancak, 1 dakikadan fazla etiketleme tekniğin zamansal çözünürlüğünü azaltır. Bir takip denemesi yapılacaksa; 20−30 s için tiyo-etiketleme izin sonra 5 mM son konsantrasyona 1 / 200 kültür hacmi 1/200 kültür hacmi ekleyerek (thiolated değil), izin.NOT: Uridin daha az suda çözünür olduğu için idrar takibi için urasil tercih edilir ve böylece hücrelerin büyümesinde daha az rahatsızlık vardır. Zaman kursunun sonuna kadar düzenli aralıklarla (en az 15 s) kültür örnekleri alın. Bundan daha kısa örnekleme aralıklarının güvenilir bir şekilde gerçekleşdirilmesi zordur. Adım 1.4 hazırlanan kuru buz üzerinde metanol örnek ekleyin. Kolaylık sağlamak için, 20 mL metanol içeren 50 mL’lik bir tüpe 30 mL kültür ekleyin.NOT: Karbondioksit soğukolduğunda metanolde çözünür; bu, numunenin eklenmesi yle çözeltiden çıkar ve karıştırma üzerine köpükler şiddetle ortaya çıkar―numune kaybına neden olan. Bunu önlemek için metanolü <-70 °C'ye kadar sıkıca kapatılmış bir tüpte, gerektiği zamana yakın bir şekilde soğutun ve kuru buza aktarın. Tüpü kapatın ve sallayarak iyice karıştırın. Örnekleri buza yerleştirin. Örneklerin hiçbirinin dondurulmaz mı kontrol edin; eğer öyleyse, hafifçe elinde sıcak, sürekli ters. Bu en iyi örnek sıcaklığı değerlendirilebilir olarak elde yapılır, her zaman soğuk hissetmesi gerekir. Buzun üzerine yerleştirin. Bu bir duraklama noktası değildir; bir kez tüm örnek sıvı bir sonraki adıma geçin. Hücreleri peletlemek için 2 dakika (mümkünse 4 °C’de) için 3000 x g’de döndürün. Sıvıyı dökün ve peleti en az 1 mL buz gibi suda hafifçe yukarı ve aşağı borular dökerek yeniden askıya alın.NOT: Örnek peletteki artık metanol yeniden askıya alınmasına yardımcı olur. Adım 1.4’te hazırlanan 2 mL vidalı kapak borularına aktarın. Hücreleri yeniden peletlemek için >13.000 x g’de kısaca (örn. 10 s toplam süre) döndürün, buzun üzerine yerleştirin ve sıvıyı çıkarın.NOT: Hücre peleti -70 ila -80 °C’de birkaç ay saklanabilir. 2. Toplam RNA hazırlanması NOT: Tamamlanma süresi 90 dk’dır. RNA’yı bozulmadan korumak için dietil pirokarbonat (DEPC) ile işlenmiş çözeltiler kullanın. Aliquot filtreler pipet uçları kullanarak çözümleri ve her zaman eldiven giymek. Bir çözüm için DEPC 1/1000 hacim ekleyin ve güçlü sallayarak karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 24 saat bekletin, sonra otoklav. Amin gruplarına (tris gibi) sahip çözümler DEPC’ye işlenemez. Aliquot toz ve rna iş için özel saklamak. Çözümü yapmak için daha önce depc işlem görmüş H2O’yu kullanın.NOT: RNA üzerindeki tiyo grubu fotoaktiz olduğundan, bu noktadan itibaren UV ışığına maruz kalma en aza indirin. Depolama karanlıkta olmalı ve kuluçka en iyi bir kapaklı bir PCR makinede yapılır. Bir S. pombe başak hücre pelet yerine kültür (her ikisini de yapmayın) eklenecek ise, şimdi ekleyin. Pelet eklemeden önce, buz ve girdap üzerinde thiolated S. pombe hücrelerinin bir aliquot iyice, en az 30 s, çözülme.NOT: 1.5.1−1.5.7 adımlarına göre hazırlanırsa, 30 mL kültürden elde edilen bir pelet için 10 μL S. pombe aliquot gereklidir. Kapağı takmadan önce, kapak ve tüp arasında hiçbir zirkon boncuk sıkışmadığından emin olmak için 1−2 s için çok kısa bir süre döndürün, bu da tüpten örnek ve fenol sızıntısına neden olabilir. 400 μL asetat EDTA (AE) tampon (50 mM sodyum asetat pH 5.3, 10 mM EDTA pH 8.0) hücreleri şiddetle girdap ile yeniden askıya alın. (w/v) sodyum dodecyl sülfat (SDS) 40 μL ekleyin. SDS köpük olacak gibi girdap etmeyin. Β-est AID 4U protokolü kullanılacaksa, protein analizi için hücre süspansiyonunun 40°L’sini alın7. Hacmi 400 μL’ye kadar geri yapmak için 40 μL AE ekleyin. 10 s için düşük pH ve girdap 800 μL fenol (DİkKAT) ekleyin.DİkKAT: Fenol inhalasyon ve temas ile toksik ve aşındırıcı. Her zaman bir duman kaputfenol içeren prosedürleri gerçekleştirmek ve eldiven iki çift giymek. Hücreleri homogenizer (örn. MalzemeTablosu) en düşük güç ayarında üç 2 dakikalık patlamaiçin inceleyin. Homojenizasyon darbeleri arasında 2 dakika buz üzerinde örnekleri bırakın.NOT: Diğer homogenizers kullanıyorsanız koşulları optimize edin. Yetersiz titreme kötü verimlere neden olurken, aşırı titreme 260 nm (A260)absorbance tarafından belirlendiği gibi, belirgin daha yüksek verim ile sonuçlanır, ancak RNA bozulabilir. Homojener tercih edilir, ancak sıcak fenol RNA arınma12 kullanılabilir. 5 dakika boyunca kuru buz üzerine lysed örnek yerleştirin, katılanıncaya kadar, bu rna içine genomik DNA taşıma azaltır. Örnek çözülmeyeceği için çok uzun süre donmayın. Spin 5 dk mikrofuge de >13,000 x g RT at; numune/fenol karışımı düşük sıcaklıkta yapılırsa spin boyunca katı kalacağından, 4 °C’de bunu yapmak için cazip olmayın.NOT: Eğer numune dönüş sonunda hala donmuşsa, numune tamamen çözülene kadar 5 dakika daha yeniden döndürün. Fenol/kloroform ekstresi daha sonra eşit hacimli (yaklaşık 600 μL) fenol ile kloroform özü:kloroform 5:1 sonra kloroform (DİkKAT). Üst fazı fenol içeren başka bir tüpe aktarın:kloroform 5:1 veya kloroform. Vortex, sonra RT bir mikrofuge 5 dakika boyunca spin. Daha sonra üst fazı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.DİkKAT: Kloroform inhalasyon ve temas ile toksiktir. Her zaman bir duman kaputunda kloroform içeren prosedürleri gerçekleştirmek ve eldiven iki çift giymek. 10 M LiCl’lik üçüncü ila yarım hacim (yaklaşık 300°L) ekleyin ve RNA’yı çökeltmek için karıştırın. Numune hemen bulutlu gitmeli, ancak en az 10 dakika buz üzerinde veya 4 °C’de (donacağı için -20 °C’nin altında saklamayın) veya çökeltme olana kadar bekletilmelidir. Bir mikrofuge >13.000 x g 5 dakika için spin. Sıvıyı çıkarın, kısa bir süre yeniden döndürün ve dregs kaldırın. 300−500 μL etanol ile pelet yıkayın, kısa bir süre spin ve kalan etanol kaldırın.NOT: Bu yıkıntılar sırasında ilk dönüş olarak tüpün aynı tarafında pelet tutmak, bu şekilde pelet hareket etmez ve kırmak; Eğer kırılırsa RNA’nın bir kısmı kazara kaybolabilir.NOT: Peleti kurutmayın; sıvının çoğu çıkarıldığı sürece sonraki adımlara müdahale etmez. RNA bu aşamada -20 °C’de birkaç ay veya uzun süreli depolama için -70 ila -80 °C arasında saklanabilir. RNA peletini 90 μL TE pH 7.0 (10 mM Tris HCl pH 7.0, 1 mM EDTA pH 8.0) halinde 65 °C’de ısıtarak yeniden çözün. RNA daha yüksek sıcaklıklarda bozulduğu için bu işlem en fazla 5 dakika olmalıdır. Tam RNA çözünürasyon için kontrol edin ve sonra 0.2 mL tüp aktarın. Pipet örnek yukarı ve aşağı; hiçbir “topaklar” olmalıdır ve sıvı yükselmesi ve ucu sorunsuz düşmesi gerekir. Bu çözelti viskozdur, bu nedenle son pipetleme hareketi yavaş olmalıdır.NOT: RNA bu aşamada karanlıkta -20 °C’de saklanabilir; Bu da RNA çözünürlük için yararlı olabilir. 3. Biyotinylasyon NOT: Tamamlanma süresi 60 dkdır. Aşağıdaki adımlar, girdapta açma eğilimi ayrı kapaklı şeritlere göre daha az olduğu için, integral kapaklı bir tüp şeridinde rahatlıkla yapılır. 5 mM HPDP-biotin çözeltisinin (MTS-biotin HPDP-biotin ile aynı şekilde kullanılabilir) 10 μL(1/10 son hacim) ekleyerek RNA’ya biyotinylate ve iyice karıştırın. Biotin’i eklemeden önce RNA’yı 65 °C’de en fazla birkaç saniye Önceden ısıtın. Karanlıkta maksimum 30 dakika 15 dakika için 65 °C’de kuluçka.NOT: Bazı HPDP toplu işleri RNA örneğinde RT’de çökeltisi olduğundan bu ısıtma gereklidir. Isıtmalı kapaklı bir PCR bloğu bunun için idealdir. Küçük bir reçine hacmi, boyutdışlama sütunu (Tablo Malzemeler) unincorporated biotin hariç hazırlayın. Sütunun alt etiketini çıkarın ve kapağı gevşetin, 2 mL’lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tamponu temizlemek için 1 500 x g’de döndürün ve 0,3 mL TE’yi yavaşça sütunun üstüne ekleyin ve tekrar döndürün. Toplam 3 yıkama için yıkamayı ve iki kez daha döndürün. Son olarak yıkanmış kolonu 1,5 mL’lik taze bir tüpe aktarın. Örnek kuluçka (adım 3.1) tamamlandıktan sonra, örneği sütunun üst bölümüne ekleyin. 2 dk için 1500 x g spin. Biyotinylated RNA örneği şu anda tüpün dibinde.NOT: 1 dk dönüş tüm numuneyi çıkarmak için yeterli değildir. 10 M LiCl’lik üçüncü ila yarım hacim (yaklaşık 40°L) ekleyin, RNA’yı adım 2.10 olarak yeniden çökeltmek için karıştırın. Örnek hemen bulutlu gitmeli ama en az 5 dakika buz üzerinde veya 4 °C veya çökelti flocculates kadar bırakın; -20 °C’nin altında donacağı için saklamayın. Bir mikrofuge >13.000 x g 5 dakika için örnek santrifüj. etanol, ≤1 saat döner. Mümkün olduğunca sıvı kaldırmak için adım 2.11 prosedürü izleyin.NOT: HPDP-biotin etanolde çok çözünür olduğundan, bu ek bir arınma adımıdır. Mümkün olduğunca çok un-incorporated biotin kaldırmak için% 80 etanol yıkama tekrarlayın.NOT: RNA bu aşamada karanlıkta -20 °C’de de saklanabilir. 4. Yeni sentezlenen RNA saflaştırma NOT: Tamamlanma süresi 2 saattir. RNA’yı 200 μL DEPC ile işlenmiş H2O (65 °C kuluçka, adım 2.12’deki prosedüre benzer şekilde kullanılabilir) yeniden eritin. RNA konsantrasyonu Bir spektrofotometre kullanarakA 260’ta ölçün; spektrofotometrenin doğrusal aralığı içinde elde etmek için numunenin 1/10 seyreltilmesi gerekebilir. Girdap bu seyreltme en az 10 s viskoz RNA eşit çözünmüş olduğundan emin olmak için.NOT: Gerekirse biyotinylasyonun etkinliği nokta blot13 ile değerlendirilebilir. Taze bir tüpe eşit miktarda RNA ekleyin ve DEPC ile işlenmiş H2O’da 200 μL’a kadar makyaj yapın.NOT: Elektronik tablo 4tU deneme şablonu.xlsx bu hesaplamaya yardımcı olacak bir forma sahiptir. Numune RT’de yken, 10 x NaTM tamponunun 25°L’sini ekleyin (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μL 1 M NaPi pH 6,8 (0,5 M NaH2PO4 0,5 M Na2HPO4) ve SDS’nin 2,5 μL’si. Iyice karıştırın ve hafifçe döndürün (<30 s; yaklaşık 100 x g).NOT: SDS ve tuzların yağışını önlemek için numuneler 4.13 adıma kadar aşağıdaki işlemler boyunca RT’de tutulmalıdır. 1x NaTM arabelleği, 0,1 M NaPi ve %0,1 SDS, numune başına 2 mL içeren boncuk arabelleği yapın. Gerekli miktarda H2Oilk ve SDS son ekleyin. Bu 24 saat sonra bir çökelti formları olarak her zaman taze yapılmalıdır.NOT: Çökelti oluşumunu önlemek için boncuk tamponu aşağıdaki işlemler boyunca RT’de tutulmalıdır. DEPC tedavi veya otoklav etmeyin. Düşük tutma 1.5 mL tüp e 50 μL streptavidin boncuk ekleyin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin, boncukların yerleşmesini bekleyin ve sıvıyı çıkarın Streptavidin boncuklarını yıkayın. Boncuk pelet tamamen askıya alınana kadar boncuk tampon ve girdap 200 μL ekleyin. Genellikle 3−5 s gerekli olan tek şey. RNA örneği eklenmeden önce yapılan yıkarlar için tüpleri yuvarlak çevirmek yeterlidir, böylece boncuklar tüpün diğer tarafına doğru hareket eder. Sonra tüpleri orijinal tarafa çevirin, böylece boncuklar bir kez daha tüpün içinden geçsin. Tüpü düşük hızda (yaklaşık 100 x g) maksimum 5 s sıvıyı aşağı döndürmek için döndürün, ancak boncukları döndürmeyin. Boncukmıknatıs tarafından yakalanan izin vermek için manyetik raf yerleştirin. Az sayıda numune için aspirasyon ile sıvıçıkarın; sıvı dökün eğer çok örnek.NOT: Çok sayıda numune ile, tüm sıvının tamamen aspirasyonla çıkarılması sorunlu olabilir, çünkü ilk numunedeki boncuklar son numune bitmeden kurutulabilir, bu arka planı arttırır. Yıkama mıknatıs üzerinde iken aynı anda tüm numunelerden sıvı dökülerek hızlandırılabilir. Onlar dökmeden önce mıknatıs üzerinde biraz daha uzun bırakılmalıdır ve kalan sıvı nın küçük miktarda uzak aspire edilmesi gerekir ama, genel olarak, mıknatıs üzerinde daha az zaman ve sıvı olmadan anlamına gelir. Bu şekilde, hızlı bir şekilde 24 veya daha fazla ekstraksiyon yapmak mümkündür. 200 μL boncuk tampon, 10 μL 20 mg/mL glikojen ve 2.5 μL 5 mg/mL tRNA, RT’de orta hızda 20 dk dönen uç ile blok. Rotasyon boncukları süspansiyonda tutmak. Engelleme tamamlandıktan sonra 4.7.2−4.7.4 adımları olarak sıvıyı çıkarın ve bölüm 4.7’deki adımlar gibi tekrar yıkayın. Örnekteki boncukları askıya alın. 30 dk dönme ile RT’de kuluçka. Kuluçka sırasında, her numune için 1,5 mL’lik taze bir tüp hazırlayın. 3 M sodyum asetat pH 5.3 ve 20 g glikojen 1/10 hacim (yaklaşık 10 μL) ekleyin ve 3 s. Bir rafta gerekli kadar saklayın yaklaşık 100 x g spin. 4.7.2−4.7.4 adımolarak, bağlanmamış RNA’yı boncuklardan çıkarın. Bağlanmamış RNA taze bir tüp içinde sebat edilebilir, ancak tuzlar ve SDS arındırmak için çok zor olun. Daha sonra, bölüm 4.7 girdap ile, en az 3 ila 5 kez en fazla boncukyı yıkayın. Son yıkamadan sonra tüm sıvı aspire etmek için özel dikkat; her tüpe dönün ve tamponun dregs bir kez daha aspire. RNA’yı eleştirmek için, boncuklara 50°L taze hazırlanmış 0,7 M β-mercaptoetanol(βME) ekleyin (ticari olarak sağlanan stok çözeltisinin 1/20 seyreltilmesi). Girdap ve kısa bir süre spin, adımlar 4.7.1 ve 4.7.2 olarak. Bulamacı manyetik rafa ve pipete yerleştirin RNA çözeltisini içeren 4.10 adımda hazırlanan 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Boncuklardan artık RNA’yı kurtarmak ve bu boncuklardan gelen ilk elüasyonu içeren tüpe eluted örneğini eklemek için 4.13. Numuneyi manyetik rafa geri yerleştirerek ve sıvıyı taze, düşük bağlayıcı 0,5 mL santrifüj tüpe aktararak artık boncukları eluted RNA’dan çıkarın. Numuneyi karıştırın ve 2.5x hacim (280 μL) etanol ekleyerek nsRNA’yı çökeltin ve bir kez daha karıştırın. -20 °C’de geceye kadar 1 saat bekletin. Maksimum hızda 20 dakika (en az 13.000 x g)önceden soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) spin. -20 °C’de etanol ile iyice yıkayın. Kalıntı βME aşağı akım uygulamalarını inhibe edeceği için, dregs mümkün olduğunca kaldırmak için her adımda spin; sonunda örnek βME kokusu olmamalıdır. DEPC ile işlenmiş 1x TE’nin 10−20 μL’lik kısmını 0,005 μL RNase inhibitörüeşdeğeri ile yeniden çözün.NOT: Sonraki tüm aşamalar buz üzerinde yapılmalıdır. RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün. A260 ve A225’i düşük numune hacmi spektrofotometresinde ölçün.NOT: Λ = 225 nm’ye yakın bir emicilik boncuklardan kaçınılmaz bir kirleticidir. RNA yokluğunda kirletici sinyal λ = 260 nm’de ‘e düşer. Bu nedenle, RNA gerçek miktarı formül ile yaklaşık: (A260-(A225*0.35))*40 ng/μL. Alternatif olarak, biyoanalizör gibi bir mikro-akışkan elektroforez sistemi üzerinde örnek analiz.NOT: Bu analiz, RNA bütünlüğü değerlendirilebildiği, kirleticinin nicelliği etkilememesi ve daha az numune alınması gerektiği için spektrofotometre kullanılmasıtercih edilir. nsRNA’yı analiz edin.NOT: Örneğin, belirli RNA’lar standart ters transkriptaz qPCR teknikleri ile ölçülebilir. RNA bu şekilde hazırlanan RNA-seq için kütüphane hazırlama ile uyumludur. RRNA kaldırma 5 dk.’dan az etiketleme süreleri için gerekli değildir.