Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

1. Рост и тмио-маркировка ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения этого раздела протокола весьма переменно, в зависимости от темпов роста клеток. Разрешить 1 ч, чтобы подготовить решения и оборудование до thio-маркировки и 30 мин после маркировки для обработки образцов. Убедитесь, что штамм S. cerevisiae содержит плазмид, кодирующиперскую пермяку (Таблица1), чтобы увеличить импорт 4tU в ячейку.ПРИМЕЧАНИЕ: Без импортера, маркировка менее 2 мин вряд ли будет успешным11 (см. Дополнительная рисунок 1). 4tU включение является более эффективным, если рост в среде без uracil, так что штамм должен быть URA3 некоторые из плазмидов в таблице 1 нести URA3 в качестве маркера. Если этот протокол должен быть объединен с истощением7-EST AID, необходимы дополнительные изменения деформации. Приготовьте среду без YMM, добавив 6,9 г дрожжевой азотной базы без аминокислот, 20 г глюкозы и 1,92 г сксМ-одного отсева (Таблица Материалов) до 1 л воды. Автоклав или фильтр стерилизовать среду роста перед использованием.ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр стерилизации является предпочтительным в качестве пептида / сахара комплексов, производимых автоклавирования совместного осадка с клетками в метаноле, используемом в сборе образцов. Выращивайте дрожжи в среде без уронила YMM до оптической плотности при 600 нм (OD600) от 0,6 до 0,8. Убедитесь, что культура находится в росте фазы журнала и была, по крайней мере, в два раза. Рост при температуре 30 градусов обычно рекомендуется, но другие температуры могут быть использованы, например, для чувствительных к температуре штаммов.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от нагрузки, условий роста и урожайности РНК потребуется около 30 мл пробы. Эта сумма будет излагаться на протяжении всего протокола. 30 мл культуры является наиболее, что будет вписываться в 50 мл центрифуги трубки с 20 мл метанола, так что это удобный объем, чтобы начать оптимизацию. Рассмотрите возможность использования большего объема выборки для ранних точек времени для увеличения восстановления РНК, до 2000 мл используется для более медленных растущих клеток в очень короткое время маркировки (1 мин). Охладите около 50 мл H2O на льду. Для каждого образца добавьте 200 qL шариков zirconia к трубке 2 mL винт-крышки и охладите на льду. Также положите 20 мл метанола (ПРЕДГВИ), в 50 мл центрифуговых труб, и поместите на сухой лед (CAUTION). Метанол должен быть 1/3 до 2/3 объем образца.ВНИМАНИЕ: Метанол токсичен при вдыхании, контакте и потреблении. Распределите большие объемы в дымовом капюшоне, и носить две пары перчаток, как метанол может проникнуть нитрила лабораторных перчаток. Метанол легко воспламеняется, держитесь подальше от всех источников зажигания.ПРИМЕЧАНИЕ: Как сухой лед может вызвать холодные ожоги при контакте и производит asphixiant газа, использовать перчатки при обработке и использовании в хорошо проветриваемом пространстве.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление бисера в этот момент легче, чем после того, как образец был добавлен, как трубка сухая и при спиннинг вниз клетки гранулы бисер также вращаться подальше от трубки нить экономии некоторое время. Кроме того, это позволяет бусины остыть, прежде чем образец добавляется. Если s. pombe шип должен быть добавлен в культуру (а не позже), оттаять аликот thiolated S. pombe клеток на льду и вихре тщательно, по крайней мере 30 с, а затем добавить к культуре. Если подготовлено в соответствии с инструкциями ниже, один S. pombe aliquot достаточно для 400 мл культуры (достаточно для двенадцати 30 мл образцов плюс немного, чтобы позволить ошибки в обращении). Если используется более или менее культура, отрегулируйте объем S. pombe, добавленного в культуру. Вырастите 1 L культуры S. pombe до OD600 до 0.8 точно как описано в протоколе для S. cerevisiae. Тио-метка как шаг 1.7, но в течение 10 мин. Исправить всю культуру, используя 400 мл метанола на сухом льду, по существу, как описано в шаге 1.9. Пелле клетки центрифугации при 3000 х г в течение 3 мин. Откажитесь от супернатанта и отрепримите клеточные гранулы в 3,3 мл H2O. Разделите на aliquots по 80 л каждый. Хранить при -80 градусах по Цельсию. Используйте все одно аликот для культуры 400 мл или 10 л на 30 мл образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите объем шипа до 1/10 при выполнении РНК. Не используйте aliquots; отбросить любой неиспользованный шип. Этот всплеск полезен для нормализации и сравнения результатов в различных временных точках и экспериментах. Для прерывистой маркировки, вызвать необходимые метаболические возмущения (например, условия роста, индукции генов или истощения, такие как q-est AID7 (Рисунок2 и Дополнительная рисунок2), а затем разделить культуру. Убедитесь, что все колбы и носители находятся при необходимой температуре и, по возможности, анейируют среду перед добавлением культуры. Добавьте 4tU к культуре до концентрации 10 мкми тщательно перемешайте (1 /10000 от объема культуры 100 мМ 4tU, растворенного в 1 M NaOH). Тиол-метка от 15 до 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Тридцать секунд является хорошей отправной точкой. Thio-маркировка для меньш чем 20 s дает больше переменных результатов из-за затруднений манипулируя культурой под давлением времени. Однако маркировка более 1 мин уменьшает временное разрешение техники. Если погоня эксперимент должен быть выполнен; позволяют тио-маркировки для 20’30 s затем погони, добавив 1/200 объем культуры 1 M uridine (не thiolated), до окончательной концентрации 5 мМ.ПРИМЕЧАНИЕ: Уридин предпочтительнее uracil для погони, как уридин является более растворимым для воды позволяет меньший объем, который будет добавлен в культуру и поэтому меньше нарушений роста клеток. Возьмите образцы культуры через регулярные промежутки времени (не менее 15 с), до конца курса времени. Интервалы выборки короче, чем это трудно выполнить надежно. Добавьте образец в метанол на сухом льду, приготовленный в шаге 1.4. Для удобства добавьте 30 мл культуры в трубку 50 мл, содержащую 20 мл метанола.ПРИМЕЧАНИЕ: Углекислый газ растворяется в метаноле при холоде; это выходит из раствора на добавление образца и пены энергично при смешивании, в результате чего в пробе потери. Чтобы избежать этого, охладите метанол до злт;-70 градусов по Цельсию в плотно запечатанной трубке до тех пор, пока не будет необходимо, а затем перенесите на сухой лед. Печать трубки и тщательно перемешать, встряхивая. Поместите образцы на лед. Убедитесь, что ни один из образцов не заморожен; если это так, мягко тепло в руке, инвертируя постоянно. Это лучше всего сделать в руке, так как температура образца может быть оценена, он всегда должен чувствовать себя холодно. Место на льду. Это не точка паузы; как только весь образец жидкости перейти к следующему шагу. Спин на 3000 х г в течение 2 мин (при 4 градусах по Цельсию, если это возможно), чтобы гранулы клетки. Слейте жидкость и resuspend гранулы, по крайней мере 1 мл ледяной воды, мягко pipetting вверх и вниз.ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный метанол в образце гранул способствует повторной приостановке. Передача на 2 мл винтовая крышка труб, подготовленных в шаге 1.4. Спин кратко (например, 10 с общей время) на йgt;13000 х г, чтобы повторно гранулы клетки, место обратно на лед и удалить жидкость.ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут храниться при от -70 до -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев. 2. Подготовка общей РНК ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения составляет 90 минут. Используйте диэтил-пиробубонат (DEPC) обработанные растворы для защиты РНК от деградации. Aliquot решения с использованием фильтра пипетки советы и носить перчатки в любое время. К раствору добавьте 1/1000 объем DEPC и перемешать энергичной встряхивания. Оставьте при комнатной температуре (RT) на 24 ч, затем автоклав. Решения с группами амина (например, трис) не могут быть обработаны DEPC. Aliquot порошок и хранить специально для работы РНК. Используйте ранее DEPC обработанных H2O, чтобы сделать решение.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку тио-группа рнковой РНК фотоактивируется, свести к минимуму воздействие УФ-излучения с этого момента. Хранение должно быть в темноте и инкубации лучше всего делать в машине ПЦР с крышкой. Если шип S. pombe должен быть добавлен в клетку гранулы, а не культуры (не делать и то и другое), добавить его сейчас. Оттепель aliquot thiolated S. pombe клеток на льду и вихре тщательно, по крайней мере 30 с, прежде чем добавить в гранулы.ПРИМЕЧАНИЕ: Если подготовлено в соответствии с шагами 1.5.1’1.5.7, 10 qL S. pombe aliquot требуется для одной гранулы, полученной из 30 мл культуры. Перед тем, как надеть крышку, вращайтесь очень кратко в течение 1 х 2 с, чтобы гарантировать, что ни один серкония бисера не оказались в ловушке между крышкой и трубкой, что может привести к утечке образца и фенола из трубки. Повторное приостановку клеток в 400 qL ацетата EDTA (AE) буфер (50 мм натрия ацетат рН 5,3, 10 мм EDTA pH 8.0), путем вихря энергично. Добавьте 40 кл. 10% (w/v) сульфат натрия (SDS). Не вихрь, как SDS будет пениться. Если протокол q-est AID 4U будет использоваться, возьмите 40 qL клеточной суспензии для анализа белка7. Добавьте 40 зЛ АЕ, чтобы сделать объем обратно до 400 л. Добавьте 800 л фенола (ПРЕЕСТЕРИ) при низком рН и вихре в течение 10 с.ВНИМАНИЕ: Фенол является токсичным и коррозионным при вдыхании и контакте. Всегда выполняйте процедуры с участием фенола в дымовом капюшоне и носите две пары перчаток. Вылажь клетки в гомогенизаторе (например, таблица материалов) в течение трех 2-минутных очередей при самой низкой настройке мощности. Оставьте образцы на льду на 2 мин между импульсами гомогенизации.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация условий при использовании других гомогенизаторов. Недостаточное встряхивание приведет к плохой урожайности, в то время как чрезмерное встряхивание приводит к очевидной более высокой урожайности, как это определено поглощением на 260 нм (A260), но РНК может быть деградирована. Предпочтительным является гомогенизатор, но горячая очищение РНК 12. Поместите лисизированный образец на сухой лед в течение 5 мин, пока он не затвердеет, это уменьшает геномную ДНК переноса в РНК. Не замораживайте слишком долго, так как образец не будет оттаивать. Спин 5 мин в микрофуге на 13000 х г на RT; не поддавайтесь искушению сделать это при температуре 4 градусов по Цельсию, так как смесь образца/фенола останется твердой на протяжении всего спина, если она проводится при низкой температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец все еще заморожен в конце спина, повторно спина еще на 5 минут, пока образец полностью размороженные. Экстракт фенола/хлороформа затем экстракт хлороформа с равным объемом (приблизительно 600 л.с.) фенола: хлороформ 5:1 затем хлороформ (ПРЕСТЕР). Перенесите верхнюю фазу в другую трубку, содержащую фенол: хлороформ 5:1 или хлороформ. Вихрь, затем спина в течение 5 минут в микрофуге на RT. Затем перенесите верхнюю фазу на новую трубку объемом 1,5 мл.ВНИМАНИЕ: Хлороформ токсичен при вдыхании и контакте. Всегда выполняйте процедуры с участием хлороформа в капоте дыма и носите две пары перчаток. Добавьте от трети до половины объема (примерно 300 л) 10 М ЛиКла, и перемешайте, чтобы осаждать РНК. Образец должен идти облачно немедленно, но оставить, по крайней мере 10 мин на льду или на 4 кв (не храните ниже -20 градусов по Цельсию, как он замерзнет), или до осажденного flocculates. Спин в течение 5 мин на йgt;13000 х г в микрофуге. Удалите жидкость, кратко повторно спина и удалить отбросы. Вымойте гранулы с 300-500 л 70% этанола, спина кратко и удалить оставшиеся этанола.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этих смоекдержать держать гранулы на той же стороне трубки, как первый спин, таким образом, гранулы не будет двигаться и ломаться; если он нарушает некоторые РНК могут быть потеряны случайно.ПРИМЕЧАНИЕ: Не сушите гранулы; до тех пор, как большая часть жидкости была удалена она не будет вмешиваться в последующие шаги. РНК также может храниться на этом этапе при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев или от -70 до -80 градусов по Цельсию для длительного хранения. Повторно растворить гранулы РНК в 90 л TE pH 7.0 (10 мм Tris HCl pH 7.0, 1 mM EDTA pH 8.0) путем нагрева при 65 градусах Цельсия при встряхивании, так как гранулы РНК может быть трудно вновь растворить. Это должно быть не более 5 мин, как РНК деградирует при более высоких температурах. Проверьте полную растворимую РНК, а затем перенесите на трубку 0,2 мл. Pipette образец вверх и вниз; не должно быть никаких “комков”, и жидкость должна расти и падать плавно в кончике. Это решение является вязким, поэтому окончательное движение трубачирования должно быть медленным.ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может храниться при -20 градусов в темноте на данном этапе; это также может быть полезным для растворимости РНК. 3. Биотинилаация ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения составляет 60 мин. Следующие шаги удобно выполняются в полоске трубок с цельальными колпачками, так как они имеют меньше тенденции открываться на вихре, чем полоски с отдельными колпачками. Биотинилат, добавляя вРНК 10 л (1/10 конечного тома) раствора 5 мМ HPDP-биотин (МТС-биотин, который можно использовать точно так же, как HPDP-биотин), в РНК и тщательно перемешать. Разогреть РНК не более чем на несколько секунд при температуре 65 градусов по Цельсию, прежде чем добавить биотин. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 15 минут до максимум 30 мин в темноте.ПРИМЕЧАНИЕ: Это нагревание требуется, как некоторые партии HPDP осаждается на RT в образце РНК. Блок ПЦР с нагретой крышкой идеально подходит для этого. Подготовьте небольшой объем смолы, столбец исключения размера(Таблица материалов), чтобы исключить неинкорпорированный биотин. Снимите нижнюю бирку колонны и ослабьте крышку, поместите в центрифугу 2 мл. Спин на 1500 х г в течение 1 мин, чтобы промыть буфер Добавить 0,3 мл TE мягко в верхней части столбца и спина снова. Повторите мыть и спина в два раза больше в общей сложности 3 моет. Наконец, перенесите промытую колонку на свежую трубку 1,5 мл. После завершения инкубации образца (шаг 3.1) добавьте образец в верхнюю часть столбца. Спин при 1500 х г в течение 2 мин. Биотинилаповый образец РНК в настоящее время находится в нижней части трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мин спина не достаточно, чтобы удлинить весь образец. Добавьте от трети до половины объема (примерно 40 л) из 10 M LiCl, смешайте, чтобы повторно ускорить РНК в виде шага 2.10. Образец должен быть облачным немедленно, но оставить, по крайней мере 5 мин на льду или на 4 кв. c или до осажденного flocculates; не храните ниже -20 градусов по Цельсию, так как он замерзнет. Centrifuge образец в течение 5 мин на йgt;13000 х г в микрофуге. Вымойте 80% этанола, 1 ч вращения. Следуйте процедуре в шаге 2.11, чтобы удалить как можно больше жидкости, как это возможно.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку HPDP-биотин очень растворим в 80% этанола, это дополнительный шаг очистки. Повторите 80% этанола мыть, чтобы удалить как можно больше ООН-включены биотин, как это возможно.ПРИМЕЧАНИЕ: РНК также может храниться на этом этапе при -20 градусов в темноте. 4. Очистка недавно синтезированной РНК ПРИМЕЧАНИЕ: Время завершения составляет 2 ч. Повторное растворение РНК в 200 qL DEPC-обработанных H2O (65 градусов по Цельсию инкубации может быть использован, как и процедура в шаге 2.12). Измерьте концентрацию РНК при A260 с помощью спектрофотометра; образец, возможно, придется разбавлять 1/10, чтобы получить его в линейном диапазоне спектрофотометра. Vortex это разбавление, по крайней мере 10 с для обеспечения вязкой РНК равномерно растворяется.ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность биотинилации может быть оценена по точечной подогреву13 при необходимости. Добавьте одинаковое количество РНК в свежую трубку и сделайте до 200 кЛ в DEPC-обработанных H2O. Используйте весь образец с наименьшей концентрацией РНК и используйте соответствующий объем других образцов, чтобы иметь одинаковое количество РНК для каждого.ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 4tU эксперимент template.xlsx имеет форму, чтобы помочь этому расчету. Когда образец находится на RT, добавьте 25 qL 10 x NaTM буфер (0.1 M Tris HCl pH7.0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl 2), 25 qL 1 M NaPi pH 6.8 (0.5 M2PO4 0.5 M Na2HPO4) , и 2,5 л 10% SDS. Тщательно перемешайте и закрутите осторожно (йlt;30 s; приблизительно 100 x g).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать осадков SDS и солей, образцы должны храниться на RT в течение следующих процедур до шага 4.13. Сделайте буфер бисины, содержащий буфер 1x NaTM, 0,1 M NaPi и 0,1% SDS, 2 мл на образец. Добавьте необходимое количество H2O первого и SDS последнего. Это должно быть сделано свежим каждый раз, как осадок формы после 24 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать образования осадков, буфер биса должен храниться в RT на протяжении следующих процедур. Не DEPC лечить или автоклав. Добавьте 50 л стрептавидина в трубку с низким удержанием 1,5 мл. Поместите трубку на магнитную стойку, подождите, пока бусинки осядут, а затем удалите жидкость Вымойте стрептавидинбидские бусы. Добавьте 200 л буфера биса и вихря до тех пор, пока гранулы из биса не будут полностью восстановлены. Обычно 3’5 s это все, что требуется. Для смок до РНК образец добавляется достаточно, чтобы повернуть трубки вокруг так бусы путешествия через трубку на другую сторону. Затем поверните трубы обратно в исходную сторону, чтобы бисер путешествия по трубе еще раз. Спин трубки на низкой скорости (примерно 100 х г) для максимум 5 с, чтобы спина вниз жидкости, но не бисер. Поместите в магнитную стойку, чтобы шарики были захвачены магнитом. Удалить жидкость путем аспирации для небольшого числа образцов; слить жидкость, если много образцов.ПРИМЕЧАНИЕ: С большим количеством образцов, удаление всей жидкости чисто аспирации может быть проблематичным, так как бусы в первом образце могут быть высушены до последнего образца закончена, это увеличивает фон. Мытье может быть ускорено путем заливки жидкости из всех образцов сразу в то время как на магните. Они должны быть оставлены немного дольше на магнит перед заливкой и небольшое количество жидкости, которая остается должен быть аспирированы прочь, но, в целом, это означает меньше времени на магнит и без жидкости. Таким образом, можно сделать 24 или более извлечений быстро. Блок с буфером биса 200 л, 10 мг/мл гликогена и 2,5 л 5 мг/мл tRNA, 20 мин вращающийся конец над концом на умеренной скорости на RT. Вращение заключается в том, чтобы держать бисер в подвеске. После того, как блокировка будет завершена, удалите жидкость в виде шагов 4.7.2-4.7.4 и снова промойте, как шаги в разделе 4.7. Отреприжите бусинки в образце. Инкубировать на RT с вращением в течение 30 мин. Во время инкубации приготовьте свежую трубку 1,5 мл для каждого образца. Добавьте 1/10 объем (примерно 10 л) 3 M ацетат ацетата натрия рН 5,3 и 20 мкг гликогена, и спина примерно на 100 х г в течение 3 с. Хранить в стойке до необходимости. Удалите несвязанную РНК из бисера, как шаги 4.7.2-4.4.4. Несвязанная РНК может быть упорно в свежей трубке, но соли и SDS сделать его очень трудно очистить. Затем мыть бисер, как раздел 4.7 с вихрем, как минимум от 3 до максимум 5 раз. После окончательной стирки позаботьтесь о том, чтобы заасить всю жидкость; вернуться к каждой трубке и аспирировать отбросы буфера еще раз. Чтобы утилизировать РНК, добавьте 50 qL свежеприготовленного 0,7 М-меркаптоэтанола(ЗМЕ) в бисер (1 /20 разбавления коммерчески поставляемого раствора). Вихрь и спина кратко, как шаги 4.7.1 и 4.7.2. Поместите суспензию в магнитную стойку и пипетку РНК, содержащую раствор, в 1,5 мл центрифуги трубки, подготовленной в шаге 4.10. Elute еще раз, как шаг 4.13 для восстановления остаточной РНК из бисера и добавить eluted образца в трубку, содержащую первый elution из этих бусин. Удалите остаточные бусы из электора, поместив образец обратно в магнитную стойку и переведя жидкость в свежую, низкую связывающую 0,5 мл центрифуги. Смешайте образец, а затем осаждает nsRNA, добавляя 2,5x объемы (280 л) этанола и еще раз перемешайте. Оставьте на 1 ч на ночь при -20 градусах Цельсия. Спин в предварительно охлажденной центрифуге (4 кВ) в течение 20 минут на максимальной скорости (не менее 13 000 х г). Тщательно вымойте 200 л 70% этанола при -20 градусов по Цельсию. Как остаточный ЗМЕ будет препятствовать вниз по течению приложений, спина на каждом шагу, чтобы удалить как можно больше отбросов, как это возможно; в конце образца не следует пахнуть ЗМЕ. Повторно растворить в 10-20 л DEPC-обработанных 1x TE с эквивалентом 0,005 Л L RNase ингибитор.ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы должны быть выполнены на льду. Измерьте концентрацию РНК и чистоту. Измерьте A260 и A225 в спектрофотометре низкого объема образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Максимум абсорбции вблизи 225 нм происходит от неизбежного загрязнения из бисера. При отсутствии РНК сигнал от загрязняющей снизилась до 35% при 260 нм. Таким образом, фактическое количество РНК приблизительно по формуле: (A260-(A2250,35)) Кроме того, проанализируйте образец на системе электрофореза микрожидкости, такой как биоанализатор.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ предпочтительнее использовать спектрофотометр, как РНК целостности может быть оценена, загрязнитель не вмешивается в количественную оценку и меньше образца не требуется. Проанализируйте nsRNA.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, конкретные РНК могут быть количественно стандартными методами обратной транскриптазы qPCR. РНК, подготовленная таким образом, совместима с библиотечной подготовкой к РНК-секу. Удаление РНК не требуется для маркировки менее 5 мин. Рекокодирование SLAMseq14 также может быть выполнено на этой РНК.