4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

1. 成長とチオラベリング 注: プロトコルのこのセクションの完了に必要な時間は、細胞の増殖速度に応じて非常に変動します。チオラベリングの前にソリューションと機器を1時間、サンプルを処理するために30分のポストラベリングを行います。 S.セレビシエ株にパーマゼ(表1)をコードするプラスミドが含まれていることを確認し、セルへの4tUのインポートを高める。注: 輸入者がいなければ、2 分未満のラベリングが成功する可能性は低くなります (補足図 1を参照)。4tUの組み込みは、成長がウラシルなしで媒体である場合より効率的ですので、株はURA3+でなければなりません。表1のプラスミドのいくつかはURA3をマーカーとして運ぶ。このプロトコルをβ-est AID枯渇7と組み合わせるには、追加の歪み修飾が必要である。 アミノ酸を含まない酵母窒素塩基6.9g、ブドウ糖20g、SCSM単一ドロップアウトウラ(材料表)1Lを1Lの水に加えてYMMウラシルフリー培地を調製します。オートクレーブまたはフィルタは、使用前に成長培地を殺菌します。注:フィルター殺菌は、サンプル採取に使用されるメタノール中の細胞と共沈殿するオートクレーブによって生成されるペプチド/糖複合体として好ましい。 酵母をYMMウラシルフリー培地で0.6~0.8の600nm(OD600)の光学密度に成長させる。カルチャがログ フェーズの増加にあり、少なくとも 2 倍になっていることを確認します。通常、30°Cでの成長が推奨されますが、他の温度は、例えば、温度感受性株のために使用することができます。注:株、成長条件およびRNA収率に応じて、約30 mLサンプル容積が必要になります。この量はプロトコル全体で想定されます。培養の30 mLは、メタノールの20 mLで50 mL遠心チューブに収まる最も多いので、最適化を開始するのに便利なボリュームです。RNA回収を増加させるために早期の時点でより多くのサンプル体積を使用することを検討し、最大2000 mLは、本当に短い標識時間(<1分)で遅い成長細胞に使用されています。 H2Oの約50mLを氷の上で冷やします。各サンプルについて、2mLスクリューキャップチューブに200μLのジルコニアビーズを加え、氷の上で冷やします。また、20 mLのメタノール(注意)を50mL遠心管に入れ、ドライアイス(注意)の上に置きます。メタノールは、試料の体積を1/3~2/3にする必要があります。 注意:メタノールは吸入、接触および消費によって有毒である。ヒュームフードに大量のボリュームを分配し、メタノールがニトリル実験室の手袋を貫通することができるので、手袋の2組を着用してください。メタノールは非常に可燃性であり、点火のすべてのソースから遠ざけます。注:ドライアイスは接触時に冷たい火傷を引き起こし、非酸化ガスを発生させる可能性がありますので、換気の良い空間で取り扱い、使用する場合は手袋を使用してください。注:この時点でビーズを追加すると、チューブが乾燥し、セルペレットを回転させるときに、ビーズがチューブスレッドからスピンアウトされるよりも、サンプルを追加した後よりも簡単です。さらに、これはサンプルが加えられる前にビーズを冷却することを可能にする。 S.ポンベスパイクを(後でではなく)培養に加える場合は、氷と渦上のチオレートS.ポンベ細胞のアリコートを完全に解凍し、少なくとも30s、培養物に加えます。以下の指示に従って調製した場合、1つのS.ポンベアリコートは400 mLの培養物に対して十分です(12個の30mLサンプルに加えて、取り扱いのエラーを許容するのに十分です)。多かれ少なかれ培養を使用する場合は、カルチャに追加されたS.ポンベの体積を調整します。 S.cerevisiaeのプロトコルに記載されているように正確にOD600に0.8にS.ポンベ培養の1 Lを成長させる。 ティオラベルはステップ1.7として、しかし10分間。 ドライアイス上の400 mLのメタノールを使用して、すべての培養物を修正します( 基本的に、ステップ1.9に記載されているように)。 3000 x gで遠心分離によって細胞を3分間ペレットする。 上清を廃棄し、H2Oの3.3mLでセルペレットを再懸濁する。 それぞれ80μLのアリコートに分割します。-80 °C.で保存します。 400 mL培養用のアリコート 1 つまたは 30 mL サンプルあたり 10 μL を使用します。注: RNAseqを実行する場合は、スパイクの音量を 1/10に減らしてください。アリコートを再利用しないでください。未使用のスパイクを破棄します。このスパイクは、時間ポイントと実験の間で結果を正規化して比較するのに役立ちます。 不連続標識の場合、必要な代謝摂動(例えば、成長条件、β-est AID 7(図2および補足図2)などの遺伝子誘導または枯渇)を誘導し、次いで培養物を分割する。すべてのフラスコとメディアが必要な温度であることを確認し、可能であれば培養を加える前に培地を通気します。 10 μmMの濃度に4tUを加え、激しく混合する(100mM 4tUの培養量の1/10,000を1M NaOHに溶解)。チオールラベルを15~5分注:30秒は良い出発点です。20s未満のチオラベリングは、時間の圧力下で培養を操作するのが難しいため、より可変的な結果を与えます。ただし、1 分を超えるラベリングは、手法の時間的分解能を低下させます。 チェイス実験を行う場合。20-30 sのチオラベリングを許可し、その後、1Mウリジン(チオレートされていない)の1/200培養量を5mMの最終濃度に加えることによって追跡する。 注:ウリジンは、より多くの水溶性が培養に加えられるので、細胞の増殖に少ない乱れがあるので、ウリジンは、追跡のためのウラシルよりも好ましいです。 時間コースの最後まで、一定の間隔(少なくとも15秒)で培養のサンプルを採取してください。これより短いサンプリング間隔を確実に実行することは困難です。ステップ1.4で調製したドライアイス上のメタノールにサンプルを加えます。便宜上、20 mLのメタノールを含む50mLチューブに30mLの培養を加えます。注:二酸化炭素は寒いときにメタノールに溶解します。これは、サンプルを添加すると溶液から出て、混合時に激しく泡を出し、サンプル損失をもたらす。これを避けるために、必要な時間に近づくまで密閉されたチューブでメタノールを<-70 °Cに冷やし、ドライアイスに移します。 チューブを密閉し、振って十分に混ぜます。サンプルを氷の上に置く。どのサンプルも凍結されていないことを確認します。もしそうなら、手で穏やかに暖かく、絶えず反転する。これは、サンプルの温度を評価することができ、それは常に寒さを感じる必要がありますので、手で行うのが最善です。氷の上に置けこれは一時停止ポイントではありません。すべてのサンプルが流体になったら、次のステップに進みます。 3000 x gで2分間(可能な場合は4°C)で回転させ、細胞をペレットします。液体を注ぎ、ペレットを少なくとも1mLの氷冷水でゆっくりと上下にピペッティングします。注:サンプルペレット中の残留メタノールは、再懸濁液を補助する。 ステップ1.4で準備された2 mLねじキャップチューブに移します。13,000 x gで短時間(例えば、合計10回)スピンして細胞を再ペレットし、氷の上に戻し、液体を取り除きます。注:細胞ペレットは数ヶ月間-70から-80 °Cで貯えることができる。 2. 総RNAの調製 注:完成時間は90分です。 ジエチルパイロカーボネート(DEPC)処理溶液を使用して、RNAを分解から保護します。フィルターピペットの先端を使用してソリューションをアリコートし、常に手袋を着用してください。 溶液にDEPCの1/1000ボリュームを追加し、激しい振盪によって混合する。 室温(RT)で24時間放置し、オートクレーブを使用します。 アミン基(トリスなど)を持つ溶液は、DEPC処理できません。アリコート粉末とRNA作業のために特別に保存します。溶液を作るために、以前にDEPC処理されたH2 Oを使用してください。注:RNA上のチオグループは光電化可能なため、この時点から紫外線への曝露を最小限に抑えます。ストレージは暗闇の中にあるべきであり、インキュベーションはふたが付いているPCR機械で行われるのが最善である。 S.ポンベスパイクを培養ではなくセルペレットに追加する場合(両方を行わない)、今すぐ追加します。ペレットに添加する前に、氷と渦上のチオレートS.ポンベ細胞のアリコートを完全に30sで解凍する。注:ステップ1.5.1−1.5.7に従って調製した場合、30mLの培養物に由来する1つのペレットに対して10μLのS.ポンベアリコートが必要です。 キャップを置く前に、1−2sのために非常に短時間スピンして、ジルコニアビーズがキャップとチューブの間に閉じ込められており、サンプルとフェノールがチューブから漏れる可能性があることを確認します。 アセテートEDTA(AE)バッファーの400μL(50mM酢酸ナトリウムpH 5.3、10mM EDTA pH 8.0)で細胞を再ステージングし、激しく渦を酸化する。10%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の40 μLを加えます。SDSが発泡するように、渦をしないでください。 β-est AID 4U プロトコルを使用する場合は、タンパク質分析7の細胞懸濁液の 40 μL を取ります。AEを40μL加算して、体積を400μLまで戻します。 低pHでフェノール(注意)の800 μLを追加し、10sの渦。注意:フェノールは、吸入と接触によって有毒かつ腐食性です。常にヒュームフードにフェノールを含む手順を実行し、手袋の2ペアを着用してください。 最も低い電力設定で3つの2分間のバーストのために、ホモジナイザー(例えば、材料の表)で細胞をlyseします。均質化のパルスの間に2分間氷の上にサンプルを残します。注: 他のホモジナイザーを使用する場合は、条件を最適化します。不十分な揺れは収率が悪くなるのに対し、過度の揺れは260nm(A260)での吸光度によって決定される明らかに高い収率をもたらすが、RNAは分解され得る。ホモジナイザーが好ましいが、ホットフェノールRNA精製12を用いることができる。 ライズしたサンプルをドライアイスに5分間置き、固化するまで、RNAに持ち越されるゲノムDNAを減少させます。サンプルが解凍されない限り、あまりにも長く凍結しないでください。RTで13,000 x gでマイクロフュージでスピン5分;サンプル/フェノールミックスは、低温で行われた場合、スピン全体を通して固体のままになりますので、4 °Cでこれを行うように誘惑しないでください。注:サンプルがスピンの終わりに凍結している場合は、サンプルが完全に解凍されるまで、さらに5分間再スピンします。 フェノール/クロロホルム抽出物は、フェノールの等しい体積(約600μL)を持つクロロホルム抽出物:クロロホルム5:1、クロロホルム(注意)。フェノール:クロロホルム5:1またはクロロホルムを含む別のチューブに上相を移します。渦は、RTでマイクロフュージで5分間回転します。その後、新しい1.5 mLチューブにトップフェーズを転送します。注意:クロロホルムは吸入と接触によって有毒です。常にヒュームフードにクロロホルムを含む手順を実行し、手袋の2ペアを着用してください。 10M LiClの3分の1から半分の体積(約300μL)を加え、混合してRNAを沈殿させる。サンプルはすぐに曇りに行く必要がありますが、氷の上または4 °C(凍結するように-20 °C以下に保存しないでください)、または沈殿物が凝集するまで、少なくとも10分間放置する必要があります。 マイクロフュージで13,000 x gで5分間スピンします。流体を取り外し、短時間再スピンし、ドレッグを取り外します。70%エタノールの300-500 μLでペレットを洗浄し、短時間スピンし、残りのエタノールを除去します。注:これらの洗い流しの間、最初のスピンと同じ側にペレットを保つ、このようにペレットが移動し、壊れはありません。それが壊れた場合、RNAの一部が誤って失われる可能性があります。注:ペレットを乾燥させないようにしてください。流体のほとんどが取り除かれる限り、後続のステップに干渉しません。RNAはまた、この段階で-20 °Cで数ヶ月間、または-70〜-80°Cで長期保存することができます。 RNAペレットを90μLのTE pH 7.0(10mMトリスHCl pH 7.0、1mM EDTA pH 8.0)で再溶解し、RNAペレットとして振盪を起こすと再溶解が困難な場合があります。これは、より高い温度でRNAが劣化するにつれて5分以下でなければなりません。完全なRNA可溶化を確認し、0.2 mLチューブに移します。サンプルを上下にピペット。「しこり」が存在するべきではない、と流体は先端にスムーズに上昇し、落ちる必要があります。このソリューションは粘性なので、最終的なピペッティングモーションは遅くなります。注:RNAは、この段階で暗闇の中で-20 °Cで保存することができます。これはまた、RNA溶解性に有益であることができる。 3. バイオチニル化 注:完成時間は60分です。次の手順は、別々のキャップを持つストリップよりも渦で開く傾向が低いので、一体型キャップ付きチューブのストリップで便利に行われます。 5mM HPDP-ビオチン溶液(MTS-biotin)の10 μL(1/10最終容積)をRNAに添加し、完全に混合してバイオチリン化する。ビオチンを加える前に、65°Cで数秒以内にRNAを予熱します。暗闇の中で最大30分間15分間65°Cでインキュベートします。注:この加熱は、一部のHPDPバッチがRNAサンプル内のRTで沈殿するため必要です。加熱されたふたが付いているPCRブロックはこれに理想的である。 小さな樹脂量、サイズの除外カラム(材料の表)を準備し、未組み込みのビオチンを除外します。カラムの下部タグを取り外し、キャップを緩め、2 mL遠心管に入れます。1500 x gで 1 分間スピンして、バッファーをフラッシュする TE の 0.3 mL を列の上部にそっと追加し、再度スピンします。洗浄を繰り返し、合計3回の洗浄のためにもう2回回転させます。最後に、洗浄されたカラムを新鮮な1.5 mLチューブに移します。 サンプルインキュベーション(ステップ3.1)が完了したら、サンプルを列の上部に追加します。1500 x gで2 分間スピンします。生体化したRNAサンプルは、チューブの底部に入っています。注:1分のスピンでは、サンプル全体を溶出させるには十分ではありません。 10M LiClの3分の1から半分の体積(約40μL)を加え、混合してステップ2.10としてRNAを再沈殿させる。サンプルはすぐに曇りに行く必要がありますが、氷の上または4 °Cで、または沈殿物が凝集するまで少なくとも5分間放置する必要があります。凍結しますので-20°C以下に保管しないでください。マイクロフュージで13,000 x gで5分間サンプルを遠心分離します。 80%エタノール、≤1時間回転で洗浄します。ステップ 2.11 の手順に従って、できるだけ多くの流体を取り除きます。注:HPDP-ビオチンは80%エタノールに非常に可溶性なので、これは追加の精製工程です。 80%エタノール洗浄を繰り返し、できるだけ多くの未組み込みビオチンを除去します。注:RNAはまた、暗闇の中で-20 °Cでこの段階で保存することができます。 4. 新たに合成されたRNAの精製 注:完了の時間は2時間です。 DEPC処理H2Oの200μLでRNAを再溶解する(65°Cインキュベーションは、ステップ2.12の手順と同様に使用することができる)。 分光光度計を用いてA260のRNA濃度を測定する。試料は、分光光度計の線形範囲内に収めるために1/10を希釈する必要があります。粘性RNAが均等に溶解することを確実にするために、少なくとも10sのためにこの希釈を渦。注:バイオチニル化の効率は、必要に応じてドットブロット13によって評価することができる。 新鮮なチューブに同量のRNAを追加し、DEPC処理されたH2 Oで最大200 μLを作ります。注: スプレッドシート4tU 実験テンプレート.xlsxには、この計算を支援するフォームがあります。 サンプルが RT の場合は、10 x NaTM バッファーの 25 μL を追加します (0.1 M トリス HCl pH 7.0、2 M NaCl、250 mM MgCl 2)、25 μL の 1 M NaPi pH 6.8 (0.5 M NaH2PO4 0.5 M Na2 HPO4)10% SDS の 2.5 μL。よく混ぜて軽く回転させます(<30 s;約100 x g)。 注:SDSおよび塩の沈殿を避けるために、サンプルはステップ4.13まで次の手順を通してRTで保たれなければならない。 1x NaTM バッファ、0.1 M NaPi、および 0.1% SDS、サンプルあたり 2 mL を含むビーズ バッファを作成します。最初に H2O の必要量を追加し、最後に SDS を追加します。これは、24時間後に沈殿物の形態として毎回新鮮にする必要があります。注: 沈殿物の形成を避けるために、ビードバッファは以下の手順を通じてRTに保持する必要があります。DEPC は、治療やオートクレーブを使用しないでください。 低保持1.5 mLチューブに50 μLのストレプトアビジンビーズを追加します。チューブを磁気ラックに置き、ビーズが落ち着くのを待ってから流体を取り外します。 ストレプトアビジンビーズを洗います。 ビーズペレットが完全に再懸濁されるまで、ビーズバッファと渦の200 μLを追加します。通常は 3−5 s が必要です。RNAサンプルを添加する前に洗い物をする場合は、ビーズがチューブを横切って反対側に移動するようにチューブを回すので十分です。次に、チューブを元の側に戻して、ビーズが再びチューブを横切るようにします。 チューブを低速(約100 x g)で回転し、最大5sで流体をスピンダウンしますが、ビーズは回転しません。 磁気ラックに入れ、ビーズを磁石で捕捉できるようにします。 少数のサンプルの吸引によって液体を取り除く;多くのサンプルの場合は液体を注ぎます。注:多数のサンプルでは、最初のサンプルのビーズが最後のサンプルが終了する前に乾燥する可能性があるため、純粋に吸引によってすべての流体を除去することは問題になる可能性があります。洗浄は磁石の上で一度にすべてのサンプルから液体を注ぐことによって促進することができる。彼らは注ぐ前に磁石にもう少し長く残す必要があり、残っている流体の少量は離れて吸引する必要がありますが、全体的に、それは磁石上と流体なしでより少ない時間を意味します。このようにして、24以上の抽出を迅速に行うことができます。 200 μLビーズバッファー、10 μL 20 mg/mL グリコーゲン、および 2.5 μL 5 mg/mL tRNA を備えたブロック、RT で適度な速度でエンドを 20 分回転します。回転は、ビーズをサスペンションに保つことです。ブロッキングが完了したら、ステップ4.7.2−4.7.4として流体を取り外し、セクション4.7のステップとして再び洗浄します。 サンプル内のビーズを再中断します。30分間回転してRTでインキュベートします。 インキュベーション中に、各サンプルに新鮮な1.5 mLチューブを準備します。3MアセテートpH 5.3および20 μgのアセテートナトリウムの1/10体積(約10μL)を加え、必要になるまでラック内に約100xgで3sの貯蔵で回転させる。 ステップ 4.7.2−4.7.4に従って、バインドされていない RNA をビーズから取り外します。非結合RNAは新鮮なチューブで耐えることができますが、塩とSDSは精製を非常に困難にします。その後、断面4.7として、最低3~最大5回、ビーズを洗います。 最終的な洗浄の後、すべての液体を吸引するために特別な注意を払います。各チューブに戻り、バッファのドレッグをもう一度吸引します。 RNAを溶出させるには、ビーズに50μLの新たに調製した0.7M β-メルカプトエタノール(βME)をビーズ(市販のストック溶液の1/20希釈)を加える。渦とスピンは、ステップ 4.7.1 および 4.7.2 として短時間です。スラリーを磁気ラックに入れ、ステップ4.10で調製した1.5 mL遠心管にRNA含有溶液をピペットします。 ステップ4.13としてもう一度Eluteを加えてビーズから残留RNAを回収し、これらのビーズからの最初の溶出を含むチューブに溶出したサンプルを添加する。 サンプルを磁気ラックに戻し、流体を新鮮で低結合の0.5 mL遠心分離管に移すことによって、ELUTED RNAから残留ビーズを取り除きます。 サンプルを混合し、エタノールの2.5xボリューム(280 μL)を追加してnsRNAを沈殿させ、もう一度混ぜます。-20 °Cで一晩1時間放置します。最大速度(少なくとも13,000 x g)で20分間、あらかじめ冷やされた遠心分離機(4°C)でスピンします。 -20°Cで70%エタノールの200 μLで十分に洗浄します。残留βMEは下流のアプリケーションを阻害するように、可能な限り多くのドレッグを除去するために、すべてのステップでスピンします。最後に、サンプルはβMEのにおいをかぐべきではありません。 0.005 μL RNase阻害剤に相当するDEPC処理1x TEの10-20 μLで再溶解する。注:後続のすべてのステージは氷上で実行する必要があります。 RNA濃度と純度を測定します。 A260と A225を低サンプル体積分光光度計で測定します。注:λ = 225 nm付近の吸光度最大値は、ビーズからの避けられない汚染物質から得られます。RNAがない場合、汚染物質からのシグナルはλ =260 nmで35%まで低下します。したがって、実際のRNA量は式(A 260-(A225*0.35))*40 ng/μLで近似されます。 あるいは、バイオアナライザなどの微小流体電気泳動システム上でサンプルを分析する。注:この分析は、RNAの完全性を評価することができるように分光光度計を使用する方が好ましく、汚染物質は定量を妨げなく、より少ないサンプルが必要とされる。 nsRNA を分析します。注:例えば、特定のRNAは、標準的な逆転写酵素qPCR技術によって定量することができる。このように調製されたRNAは、RNA-seqに対するライブラリー調製と互換性があり、rRNAの除去は5分未満のラベリング時間には必要ありません。