Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

1. groei en thio-etikettering Opmerking: de tijd voor voltooiing van deze sectie van het protocol is zeer variabel, afhankelijk van de groeisnelheid van de cel. Laat 1 uur de oplossingen en apparatuur voorbereiden voorafgaand aan thio-labeling en 30 min post-labeling voor het verwerken van monsters. Zorg ervoor dat de stam S. cerevisiae een plasmide codeert een permease (tabel 1) om 4tu-import in de cel te stimuleren.Opmerking: zonder importeur is het onwaarschijnlijk dat een etikettering van minder dan 2 minuten succesvol is11 (Zie aanvullend figuur 1). 4tU-integratie is efficiënter als de groei in het medium is zonder uracil, dus de stam moet URA3+ zijn; verschillende plasmiden in tabel 1 dragen URA3 als marker. Als dit protocol moet worden gecombineerd met β-est-hulp depletie7, zijn aanvullende stam aanpassingen vereist. Bereid YMM uracil-vrij medium door toevoeging van 6,9 g gist stikstof basis zonder aminozuren, 20 g glucose en 1,92 g SCSM single Drop-out − Ura (tabel van materialen) tot 1 L water. Autoclaaf of filter steriliseren het groeimedium voor gebruik.Opmerking: filter sterilisatie heeft de voorkeur als peptide/suiker complexen geproduceerd door Autoclaveren co-precipitaat met de cellen in de methanol gebruikt in monsterverzameling. Groei van gist in YMM uracil-vrij medium naar een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,6 − 0,8. Zorg ervoor dat de cultuur in log fase groei en is geweest voor ten minste twee doublings. Groei bij 30 °C wordt normaalgesproken aanbevolen, maar andere temperaturen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor temperatuurgevoelige stammen.Opmerking: afhankelijk van de stam, groeiomstandigheden en RNA-opbrengst zal ongeveer 30 mL monstervolume nodig zijn. Dit bedrag wordt aangenomen in het hele protocol. 30 mL cultuur is het meest dat past in een centrifugebuis van 50 mL met 20 mL methanol, dus is een handig volume om de optimalisatie te starten. Overweeg het gebruik van meer sample volume voor vroege tijdpunten om het RNA-herstel te verhogen, tot 2000 mL is gebruikt voor langzamere groeicellen bij echt korte etiketterings tijden (< 1 min). Chill ongeveer 50 mL H2O op ijs. Voeg voor elk monster 200 μL Zirkonia kralen toe aan een 2 mL schroefdop buis en chill op ijs. Zet ook 20 mL methanol (voorzichtig) in 50 mL centrifugebuizen en leg op droogijs (Let op). De methanol moet 1/3 tot 2/3 het volume van het monster zijn.Let op: methanol is giftig bij inademing, contact en consumptie. Verdeel grote volumes in een rook afzuigkap en draag twee paar handschoenen, omdat methanol kan doordringen in nitril laboratorium handschoenen. Methanol is licht ontvlambaar, verwijderd van alle ontstekingsbronnen.Opmerking: aangezien droogijs koude brandwonden kan veroorzaken bij contact en asphixiant gas produceert, gebruikt u handschoenen bij het hanteren en gebruiken in een goed geventileerde ruimte.Opmerking: het toevoegen van de kralen op dit punt is gemakkelijker dan nadat het monster is toegevoegd als de buis droog is en bij het draaien van de celpellet worden de parels ook gesponnen van de buis draad die enige tijd bespaart. Bovendien kunnen de kralen afkoelen voordat het monster wordt toegevoegd. Als een s. pombe Spike moet worden toegevoegd aan de cultuur (in plaats van later), dooi dan een hoeveelheid thioated s. pombe cellen op ijs en Vortex grondig, ten minste 30 S, dan toevoegen aan de cultuur. Indien bereid volgens de onderstaande instructies, is een S. pombe aliquot voldoende voor 400 ml cultuur (genoeg voor monsters van 12 30 ml plus een beetje om fouten in de behandeling toe te staan). Als er meer of minder cultuur wordt gebruikt, past u het volume van S. pombe aan de cultuur aan. Kweek 1 L van de s. pombe cultuur naar od600 tot 0,8 precies zoals beschreven in het protocol voor s. cerevisiae. Thio-label als stap 1,7, maar voor 10 min. Repareer alle cultuur met 400 mL methanol op droogijs, in essentie zoals beschreven in stap 1,9. Pellet de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 3,3 mL H2O. Splitsen in aliquots van elk 80 μL. Bewaren bij-80 °C. Gebruik één aliquot voor een kweek van 400 mL of 10 μL per 30 mL monster.Opmerking: verlaag het volume van Spike naar 1/10 als rnaseq wordt uitgevoerd. Gebruik aliquots niet opnieuw; Gooi ongebruikte piek weg. Deze piek is handig om te normaliseren en resultaten vergelijken tussentijd punten en experimenten. Voor niet-continue etikettering, induceren van de vereiste metabole perturbatie (bv. groeiomstandigheden, geninductie of depletie zoals β-est AID7 (Figuur 2 en aanvullend figuur 2), vervolgens de cultuur splitsen. Zorg ervoor dat alle kolven en dragers op de gewenste temperatuur zijn en, indien mogelijk, het medium belueren voordat de cultuur wordt toegevoegd. Voeg 4tU toe aan de kweek tot een concentratie van 10 μmM en meng krachtig (1/10.000 van het kweek volume van 100 mm 4tu opgelost in 1 M NaOH). Thiol-label voor 15 s tot 5 min.Opmerking: dertig seconden is een goed uitgangspunt. Thio-labeling voor minder dan 20 s geeft meer variabele resultaten als gevolg van moeilijkheden bij het manipuleren van de cultuur onder tijdsdruk. De etikettering voor meer dan 1 min vermindert echter de temporele resolutie van de techniek. Als een Chase-experiment moet worden uitgevoerd; laat thio-labeling voor 20 − 30 s dan jagen door toevoeging van 1/200 kweek volume van 1 M Uridine (niet gethioleerd), tot een uiteindelijke concentratie van 5 mm.Opmerking: Uridine heeft de voorkeur boven uracil voor de achtervolging, als Uridine is meer oplosbaar in water waardoor een kleiner volume aan de cultuur worden toegevoegd en dus er is minder verstoring van de groei van de cellen. Neem op gezette tijden (ten minste 15 sec.) monsters van de cultuur, tot het einde van de tijdsduur. Bemonsterings intervallen korter dan dit zijn moeilijk uit te voeren betrouwbaar. Voeg het monster toe aan de methanol op droogijs, bereid in stap 1,4. Voeg voor het gemak 30 mL cultuur toe aan een tube van 50 mL met 20 mL methanol.Opmerking: koolstofdioxide lost op in de methanol wanneer het koud is; Dit komt uit oplossing bij toevoeging van het monster en schuim krachtig bij het mengen ― resulterend in monsterverlies. Om dit te voorkomen, de methanol te koelen tot <-70 ° c in een strak verzegelde buis tot dicht bij de tijd die nodig is, vervolgens overbrengen naar droogijs. De buis afdichten en grondig mengen door te schudden. Plaats de monsters op ijs. Controleren of geen van de monsters bevroren is geweest; Als dat zo is, zachtjes warm in de hand, constant inverteren. Dit is het best gedaan in de hand als de temperatuur van het monster kan worden beoordeeld, het moet altijd koud voelen. Plaats op ijs. Dit is geen pauze punt; Zodra het monster vloeibaar is, gaat u verder met de volgende stap. Spin bij 3000 x g gedurende 2 min (bij 4 °c indien mogelijk) om de cellen te pellet. Giet de vloeistof af en breng de pellet in minstens 1 mL ijskoud water door door voorzichtig op en neer te pipetteren.Opmerking: de residuele methanol in de monster pellet helpt resuspensie. Overdracht naar 2 mL schroefdop buizen zoals voorbereid in stap 1,4. Draai kort (bijv. 10 s totale tijd) bij > 13000 x g om de cellen opnieuw te pellet, plaats terug op ijs en verwijder vloeistof.Opmerking: de celpellet kan enkele maanden bij-70 tot-80 °C worden bewaard. 2. bereiding van totaal RNA Opmerking: de voltooiingstijd is 90 min. Gebruik diethyl pyrocarbonaat (DEPC)-behandelde oplossingen om het RNA tegen degradatie te beschermen. Aliquot de oplossingen met behulp van filter pipetpunten en draag handschoenen te allen tijde. Aan een oplossing toevoegen 1/1000 volume van dePC en mengen door krachtig schudden. Laat op kamertemperatuur (RT) voor 24 uur en vervolgens op autoclaaf. Oplossingen met amine groepen (zoals tris) kunnen niet worden behandeld met DEPC. Aliquot het poeder en bewaar speciaal voor RNA werk. Gebruik eerder DEPC behandeld H2O om de oplossing te maken.Opmerking: als de thio-groep op het RNA fotoactivatable is, minimaliseert u de blootstelling aan UV-licht vanaf dit punt. De opslag moet in het donker zijn en de incubatie wordt het best gedaan in een PCR-machine met een deksel. Als een S. pombe Spike moet worden toegevoegd aan de celpellet in plaats van de cultuur (doe niet beide), voeg het nu toe. Dooi een hoeveelheid thioated S. pombe cellen op ijs en Vortex grondig, ten minste 30 S, alvorens toe te voegen aan de pellet.Opmerking: indien bereid volgens stappen 1.5.1 − 1.5.7, is 10 μL van S. pombe aliquot vereist voor een pellet die is afgeleid van 30 ml cultuur. Voordat u op de dop, spin heel kort voor 1 − 2 s om ervoor te zorgen dat er geen Zirkonia kralen worden gevangen tussen de dop en de buis, die kan leiden tot monster en fenol lekken uit de buis. Respendeer de cellen in 400 μL acetaat EDTA (AE) buffer (50 mm Natriumacetaat pH 5,3, 10 mm EDTA pH 8,0) door krachtig grondig. Voeg 40 μL 10% (g/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) toe. Niet Vortex, als SDS schuim zal. Als het β-est AID 4U-protocol moet worden gebruikt, neem dan 40 μL van de celsuspensie voor eiwitanalyse7. Voeg 40 μL AE toe om het volume terug te brengen tot 400 μL. Voeg 800 μL fenol (voorzichtigheid) toe bij lage pH en Vortex voor 10 sec.Let op: fenol is giftig en corrosief bij inademing en contact. Voer altijd procedures uit waarbij fenol in een rook afzuigkap zit en draag twee paar handschoenen. Lyse de cellen in een homogenisator (bijv. een tabel met materialen) voor drie 2 minuten uitbarstingen bij de laagste vermogensinstelling. Laat de monsters 2 minuten op ijs liggen tussen de pulsen van de homogenisatie.Opmerking: Optimaliseer de voorwaarden als u andere homogenisatoren gebruikt. Onvoldoende schudden zal resulteren in slechte opbrengsten, terwijl overmatig schudden resulteert in een schijnbare hogere opbrengst, zoals bepaald door de extinctie bij 260 nm (A260), maar het RNA kan worden afgebroken. Een homogenisator heeft de voorkeur, maar Hot fenol RNA zuivering12 kan worden gebruikt. Plaats het gelyseerd-monster gedurende 5 minuten op droogijs, totdat het stolt, waardoor het genomisch DNA wordt overgedragen naar het RNA. Niet te lang bevriezen omdat het monster niet ontdooit. Spin 5 min in microfugebuis bij > 13000 x g bij RT; Wees niet in de verleiding om dit te doen bij 4 ° c, omdat het monster/fenol mengsel gedurende de spin solide blijft als het op lage temperatuur wordt uitgevoerd.Opmerking: als het monster nog steeds bevroren is aan het einde van de spin, moet het opnieuw draaien voor nog eens 5 minuten totdat het monster volledig ontdooid is. Fenol/chloroform extract dan chloroform extract met een gelijk volume (ongeveer 600 μL) fenol: chloroform 5:1 dan chloroform (voorzichtigheid). Breng de bovenste fase over naar een andere buis die fenol bevat: chloroform 5:1 of chloroform. Vortex, draai dan 5 minuten in een microfugebuis bij RT. Breng vervolgens de bovenste fase over naar een nieuwe 1,5 mL Tube.Let op: chloroform is giftig bij inademing en contact. Voer altijd procedures in waarbij chloroform in een rook afzuigkap zit en draag twee paar handschoenen. Voeg een derde tot halve volume (ongeveer 300 μL) van 10 M LiCl toe en meng om het RNA neer te slaan. Het monster moet onmiddellijk troebel zijn, maar laat ten minste 10 min op ijs of bij 4 °C (niet bewaren beneden-20 °C als het zal bevriezen), of tot de precipitaat flocculaten. Spin voor 5 min bij > 13000 x g in een microfuge. Verwijder de vloeistof, draai kort opnieuw en verwijder de Dregs. Was pellet met 300 − 500 μL van 70% ethanol, draai kort en verwijder de resterende ethanol.Let op: tijdens deze wasstraten houdt u de pellet aan dezelfde kant van de buis als de eerste spin, op deze manier zal de pellet niet bewegen en breken; Als het breekt een deel van het RNA kan per ongeluk verloren.Opmerking: droog de pellet niet; zolang de meeste van de vloeistof is verwijderd, zal het niet interfereren met de volgende stappen. Het RNA kan ook worden opgeslagen in dit stadium bij-20 °C gedurende een paar maanden of-70 tot-80 °C voor langdurige opslag. De RNA-pellet opnieuw oplossen in 90 μL TE pH 7,0 (10 mM tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) door TE verwarmen bij 65 °C met schudden omdat de RNA-pellet moeilijk opnieuw kan worden opgelost. Dit mag niet meer dan 5 minuten zijn, omdat RNA bij hogere temperaturen degradeert. Controleer op volledige RNA-solubilisatie en breng vervolgens over naar een 0,2 ml-buis. Pipetteer het monster op en neer; Er mogen geen “klonten” zijn en de vloeistof moet stijgen en soepel in de tip vallen. Deze oplossing is visceus, dus de laatste Pipetteer beweging moet traag zijn.Opmerking: het RNA kan in dit stadium bij-20 °C in het donker worden bewaard; Dit kan ook gunstig zijn voor RNA oplosbaarheid. 3. biotinylatie Opmerking: de voltooiingstijd is 60 min. De volgende stappen zijn handig gedaan in een strook buizen met integraal doppen omdat ze minder neiging hebben om te openen op grondig dan strips met aparte doppen. Biotinylaat door toevoeging van 10 μL (1/10 Final volume) van een 5 mm hpdp-BIOTINE oplossing (MTS-Biotine kan op exact dezelfde manier worden gebruikt als hpdp-Biotine), op het RNA en meng grondig. Verwarm het RNA voor niet meer dan een paar seconden bij 65 °C voordat u het Biotine toevoegt. Inincuberen bij 65 °C gedurende 15 minuten tot een maximum van 30 min in het donker.Opmerking: deze verwarming is vereist omdat sommige HPDP-batches neerslaan bij RT in het RNA-monster. Een PCR-blok met een verwarmd deksel is hiervoor ideaal. Bereid een kleine harsvolume, grootte uitsluitings kolom (tabel van materialen) om het grondstof Biotine uitsluiten. Verwijder de onderste tag van de kolom en maak de dop los, plaats in een 2 mL centrifugebuis. Draai op 1500 x g gedurende 1 minuut om de buffer uit te spoelen Voeg 0,3 ml te zachtjes toe aan de bovenkant van de kolom en draai opnieuw. Herhaal de Wash en spin twee keer meer voor een totaal van 3 wases. Breng tenslotte de gewassen kolom over naar een verse 1,5 mL Tube. Zodra de monster incubatie (stap 3,1) is voltooid, voegt u het monster toe aan de bovenkant van de kolom. Spin bij 1500 x g gedurende 2 min. Het biotinyleerd RNA-monster bevindt zich nu in de bodem van de buis.Opmerking: een spin van 1 minuut volstaat niet om het hele monster te elzen. Voeg een derde tot halve volume (ongeveer 40 μL) van 10 M LiCl toe, meng om het RNA opnieuw neer te slaan als stap 2,10. Het monster moet onmiddellijk troebel zijn, maar gedurende ten minste 5 minuten op het ijs of bij 4 °C of tot het precipitaat flocculaten vertrekken; niet bewaren beneden-20 °C als het zal bevriezen. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij > 13000 x g in een micro Fuge. Wassen met 80% ethanol, ≤ 1 h draaiend. Volg de procedure in stap 2,11 om zo veel mogelijk van de vloeistof te verwijderen.Opmerking: aangezien HPDP-Biotine zeer goed oplosbaar is in 80% ethanol, is dit een extra zuiveringsstap. Herhaal de 80% ethanol spoeling om zo veel mogelijk uit de VN opgenomen Biotine te verwijderen.Let op: het RNA kan ook in dit stadium bij-20 °C in het donker worden bewaard. 4. zuivering van het nieuw gesynthetiseerde RNA Opmerking: de voltooiingstijd is 2 uur. Het RNA opnieuw oplossen in 200 μL DEPC-behandelde H2O (65 °c incubatie kan worden gebruikt, vergelijkbaar met de procedure in stap 2,12). Meet de RNA-concentratie bij een260 met behulp van een spectrofotometer; het monster moet mogelijk 1/10 worden verdund om het binnen het lineaire bereik van de spectrofotometer te krijgen. Vortex deze verdunning voor ten minste 10 s om ervoor te zorgen dat het viskeuze RNA gelijkmatig wordt opgelost.Opmerking: de efficiëntie van biotinylation kan indien nodig worden beoordeeld door dot Blot13 . Voeg gelijke hoeveelheden RNA toe aan een frisse buis en maak tot 200 μL in met DEPC behandelde H2O. gebruik al het monster met de laagste RNA-concentratie en gebruik een geschikt volume van de andere monsters om een vergelijkbare hoeveelheid RNA voor elk te hebben.Opmerking: de spreadsheet 4Tu experiment template. xlsx heeft een formulier om deze berekening te helpen. Voeg bij RT een monster van 25 μL 10 x NaTM buffer (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μl van 1 m NAPI pH 6,8 (0,5 M Nah2po4 0,5 m na2HPO4) en 2,5 μL van 10% SDS. Meng grondig en draai zachtjes (< 30 s; ongeveer 100 x g).Opmerking: om precipitatie van het VIB en zouten te voorkomen, moeten de monsters op RT worden gehouden gedurende de volgende procedures tot en met stap 4,13. Maak de kraal buffer met 1x NaTM buffer, 0,1 M NaPi en 0,1% SDS, 2 mL per sample. Voeg de vereiste hoeveelheid H2O eerst en het VIB als laatste toe. Dit moet elke keer vers worden gemaakt als een precipitaat vormt na 24 uur.Opmerking: om de vorming van precipitaten te voorkomen, moet de kraal buffer bij RT worden bewaard gedurende de volgende procedures. Niet DEPC traktatie of autoclaaf. Voeg 50 μL streptavidine kralen toe aan een lage retentie 1,5 mL buis. Plaats de buis op het magnetische rek, wacht tot de parels zich vestigen en verwijder vervolgens de vloeistof Was de streptavidine kralen. Voeg 200 μL kraal buffer en Vortex toe totdat de kraal pellet volledig is geresuspendeerd. Meestal is 3 − 5 s alles wat nodig is. Voor wasstraten voordat het RNA-monster wordt toegevoegd volstaat het om de buizen rond te draaien zodat de kralen over de buis naar de andere kant reizen. Draai vervolgens de buizen terug naar de oorspronkelijke kant zodat de parels weer over de buis reizen. Draai de buis op lage snelheid (ongeveer 100 x g) voor een maximum van 5 s om de vloeistof te draaien, maar niet de kralen. Plaats in het magnetische rek om de parels te laten vangen door de magneet. Verwijder de vloeistof door aspiratie voor een klein aantal monsters; Giet de vloeistof af als er veel monsters zijn.Opmerking: met een groot aantal monsters kan het verwijderen van alle vloeistof puur door aspiratie problematisch zijn, omdat de kralen in het eerste monster kunnen worden gedroogd voordat het laatste monster is afgewerkt, dit verhoogt de achtergrond. Het wassen kan worden versneld door de vloeistof van alle monsters in één keer af te gieten terwijl u op de magneet zit. Ze moeten een beetje langer op de magneet worden gelaten voordat ze gaan gieten en de kleine hoeveelheid vloeistof die overblijft, moet weg worden genomen, maar over het algemeen betekent dit minder tijd op de magneet en zonder vloeistof. Op deze manier is het mogelijk om 24 of meer extracties snel te doen. Blok met 200 μL kraal buffer, 10 μL 20 mg/mL glycogeen, en 2,5 μL 5 mg/mL tRNA, 20 min draaiend eind einde bij matige snelheid bij RT. De rotatie is om de parels in suspensie te houden. Zodra de blokkering voltooid is Verwijder de vloeistof als stappen 4.7.2 − 4.7.4 en spoel opnieuw, als de stappen in paragraaf 4,7. Hervat de kralen in het voorbeeld. Incuberen bij RT met een rotatie van 30 min. Bereid tijdens de incubatie een verse 1,5 mL tube voor elk monster. Voeg 1/10 volume (ongeveer 10 ΜL) van 3 M Natriumacetaat pH 5,3 en 20 μg glycogeen toe en draai op ongeveer 100 x g voor 3 s. Bewaar in een rek totdat nodig. Verwijder het ongebonden RNA van de kralen, als stappen 4.7.2 − 4.7.4. Het ongebonden RNA kan in een frisse buis worden geperseerd, maar de zouten en SDS maken het erg moeilijk om te zuiveren. Was vervolgens de kralen, als sectie 4,7 met vortexing, voor een minimum van 3 tot een maximum van 5 keer. Na de laatste wasbeurt speciale aandacht te aspireren alle vloeistof; keer terug naar elke buis en aspireren de droesem van de buffer opnieuw. Om het RNA te elzen, voeg 50 μL vers bereide 0,7 M β-mercaptoethanol (βME) toe aan de parels (1/20 verdunning van de commercieel geleverde stamoplossing). Vortex en spin kort, als stappen 4.7.1 en 4.7.2. Plaats de slurry in het magnetische rek en Pipetteer de RNA bevattende oplossing in de 1,5 mL centrifugebuis bereid in stap 4,10. Elueer nogmaals als stap 4,13 om het resterende RNA van de kralen te herstellen en voeg het eluteerde monster toe aan de buis met de eerste elutie van deze kralen. Verwijder resterende kralen uit het geeleerde RNA door het monster in het magnetische rek te plaatsen en de vloeistof over te brengen naar een frisse, lage binding 0,5 mL centrifugebuis. Meng het monster en precipderen het nsRNA door 2,5 x volumes (280 μL) ethanol toe te voegen en nogmaals te mengen. Laat 1 uur rusten bij-20 °C. Spin in een voorgekoelde centrifuge (4 °C) gedurende 20 minuten bij de maximumsnelheid (ten minste 13.000 x g). Grondig wassen met 200 μL 70% ethanol bij-20 °C. Als residuele βme remmen downstream toepassingen, spin bij elke stap om zo veel van de droesem mogelijk te verwijderen; aan het einde moet het monster niet ruiken aan βME. Opnieuw oplossen in 10 − 20 μL DEPC-behandelde 1x TE met het equivalent van 0,005 μL RNase-remmer.Opmerking: alle daaropvolgende stadia moeten op ijs worden uitgevoerd. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid. Meet de A260 en een225 in een laag monstervolume spectrofotometer.NB: een absorptiemaximum bij λ = 225 nm is afkomstig van een onvermijdelijke verontreiniging van de kralen. Bij afwezigheid van RNA daalt het signaal van de verontreiniging tot 35% bij λ = 260 nm. Daarom wordt de werkelijke hoeveelheid RNA benaderd door de formule: (A260-(a225* 0.35)) * 40 ng/μL. U ook het monster analyseren op een micro-fluïdica elektroforese systeem zoals een bioanalyzer.Opmerking: deze analyse heeft de voorkeur boven het gebruik van een spectrofotometer omdat de integriteit van RNA kan worden beoordeeld, de verontreiniging niet interfereert met de quantitatie en er minder monster nodig is. Analyseer het nsRNA.Opmerking: specifieke Rna’s kunnen bijvoorbeeld worden gekwantificeerd door standaard reverse transcriptase qPCR-technieken. RNA bereid op deze manier is compatibel met de voorbereiding van de bibliotheek voor RNA-SEQ. verwijdering van rRNA is niet nodig voor het labelen van tijden van minder dan 5 min. het hercoderen van SLAMseq14 kan ook op dit RNA worden uitgevoerd.