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Bioengineering

Échafaudages d'impression de noyau/coquille pour l'ingénierie tissulaire des structures tubulaires

Published: September 27, 2019
doi:
10.3791/59951
, , , , , ,
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine,University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine,University of Maribor

Summary

Présenté ici est un simple à utiliser, core / coquille, en trois dimensions bioimpression mise en place pour la fabrication en une étape d’échafaudages creux, adapté à l’ingénierie tissulaire de structures vasculaires et autres tubulaires.

Abstract

L’impression tridimensionnelle (3D) des filaments de noyau/coquille permet la fabrication directe des structures de canal avec une coquille stable qui est reliée entrecroisée à l’interface avec un noyau liquide. Ce dernier est enlevé après l’impression, laissant derrière lui un tube creux. L’intégration d’une technique de fabrication additive (comme celle décrite ici avec des encres [bio]sur mesure, qui imitent structurellement et biochimiquement la matrice extracellulaire indigène [ECM]) est une étape importante vers l’ingénierie tissulaire avancée. Cependant, la fabrication précise de structures bien définies nécessite des stratégies de fabrication sur mesure optimisées pour le matériau utilisé. Par conséquent, il est judicieux de commencer par une configuration personnalisable, simple à utiliser et compatible avec un large éventail de matériaux et d’applications. Ce travail présente une buse de noyau/coquille facile à fabriquer avec la compatibilité luer pour explorer l’impression de noyau/coquille des structures de tas de bois, éprouvées avec une formulation bien définie et alginate-basée de matériel d’échafaudage.

Introduction

On peut soutenir que l’objectif ultime de l’ingénierie tissulaire (TE) est de produire des tissus fonctionnels ou des organes in vitro, qui peuvent être utilisés pour régénérer ou remplacer les parties blessées ou malades du corps humain1,2,3. La recherche actuelle en génie tissulaire (TE) se concentre sur les aspects individuels du domaine (matériaux d’échafaudage, procédures de fabrication, sources cellulaires, etc.) 4,5, ainsi que le développement de modèles in vitro simples de tissus et d’organes qui imitent les aspects fondamentaux de leurs homologues in vivo. Ces modèles sont déjà utiles pour de nombreuses applications, telles que le dépistage des médicaments et des études de toxicité, en particulier dans les cas où les cultures cellulaires 2D conventionnelles ne parviennent pas à imiter les réponses dynamiques des tissus indigènes6,7, 8,9. Les modèles in vitro tridimensionnels sont généralement construits en combinant les cellules10, les indices physico-chimiques11, et les molécules biologiquement actives12,13 sur les échafaudages, qui sont obtenus à partir de tissus décellularisés ou construits de novo à partir de matériaux biologiques ou biocompatibles14,15,16,17,18.

Il est crucial que les échafaudages récapitulent la microarchitecture 3D complexe et la structure hiérarchique des tissus indigènes pour permettre la fonctionnalité des tissus modifiés, représentatifs des tissus in vivo19. Malgré les progrès technologiques significatifs dans TE, le développement des constructions artificielles physiologiquement pertinentes de tissu demeure un défi. Les tissus épais (d’épaisseur de 200 millions d’euros) sont particulièrement problématiques, en raison de limitations telles que la diffusion de l’oxygène et des nutriments20. Des progrès ont été réalisés vers des constructions tissulaires plus importantes; cependant, la forte proximité requise des cellules avec les vaisseaux sanguins afin de transporter l’oxygène et les nutriments et de favoriser l’élimination des déchets doit être récapitulée. La vascularisation des tissus (ou, subsidiairement, la fabrication de réseaux vasculaires 3D interconnectés dans les constructions tissulaires) joue un rôle essentiel dans le maintien de la viabilité cellulaire et la promotion des fonctions des tissus in vitro, ce qui est plus difficile pour modèles dans des expériences prolongées21,22. En outre, la résolution requise, l’intégrité structurelle et la biocompatibilité simultanée n’ont pas encore été atteintes23.

Plusieurs approches TE ont été proposées dans le but de construire des structures semblables à des vaisseaux sanguins et de faciliter la vascularisation in vitro. Quelques exemples incluent l’ensemencement des cellules endothéliales (également co-cultivées avec d’autres types de cellules telles que des fibroblastes) qui s’auto-assemblent pour générer des réseaux microvasculaires24,l’utilisation des cellules progénitrices vasculaires et des péricytes qui favorisent la cellule endothéliale croissance21,25, la livraison de facteurs de croissance angiogéniques qui induisent la vascularisation20,26, en utilisant la technologie de la feuille cellulaire qui permet de contrôler la superposition vasculaire20, et la fabrication de structures d’échafaudage très poreuses qui favorisent l’angiogenèse27. Les approches mentionnées mettent l’accent sur l’induction de l’angiogenèse, qui nécessite généralement des quantités considérables de facteurs de croissance supplémentaires (p. ex., VEGF) et le temps de formation. Cependant, les plus grands inconvénients sont leur reproductibilité limitée et le contrôle spatial restreint sur le modelage vasculaire, ayant généralement pour résultat une distribution aléatoire de vascularculature dans la construction de tissu qui ne facilite pas nécessairement la perfusion.

La fabrication additive (AM, comme la bioimpression 3D) est de plus en plus impliquée dans la fabrication de constructions 3D utilisant des matériaux biologiques ou biocompatibles pour créer des échafaudages adaptés à l’ET. Plusieurs approches AM sont utilisées et développées en parallèle (p. ex., méthodes basées sur le jet d’encre et la micro-extrusion, différents types de techniques lithographiques) pour produire des échafaudages qui imitent les tissus indigènes dans leur architecture, leur biochimie et leur fonctionnalité. . Les techniques individuelles présentent certains avantages et inconvénients28, c’est pourquoi diverses modifications sont explorées (p. ex., micro-modelage, angiogenèse induite, etc.) afin d’accroître la mesure dans laquelle les vasculaires grands, complexes et stables réseaux peuvent être fabriqués22,29,30.

Parmi ceux-ci, la bioimpression d’extrusion est la méthode la plus couramment utilisée, en particulier en raison de la large gamme de matériaux compatibles (un processus généralement cell-friendly28,31,32) ainsi que la polyvalence exceptionnelle dans termes d’applications (p. ex., impression intégrée et sacrificielle23,33, fabrication de structures creuses34,35, etc.). Les principaux défis qui préoccupent les études actuelles comprennent le transfert des structures 2D à la 3D, la formation d’un réseau dense de tubes creux à haute résolution spatiale, et l’intégrité mécanique globale et la fidélité de la forme pendant le flux fluide dans la culture cellulaire conditions30.

L’approche la plus simple pour les tissus perfusables est la fabrication d’un réseau interconnecté de canaux au sein de la construction. La création de tels canaux impénontables dans un échafaudage tissulaire devrait résoudre bon nombre des problèmes susmentionnés, car il permet immédiatement la diffusion des nutriments et de l’oxygène tout en enlevant les déchets. Par conséquent, la formation potentielle de régions nécrotiques au sein de la construction est évitée36. Ces canaux peuvent en outre être ensemencés avec des cellules endothéliales (EC) et servir de vaisseaux sanguins artificiels dans les modèles de tissus 3D37. Dans le sens le plus élémentaire, un navire peut se composer d’un chenal creux, d’une couche molle d’EC et d’une coquille rigide. Récemment, l’extrusion 3D de deux matériaux différents dans un noyau / coquille de mode en utilisant des aiguilles co-axiales pour l’extrusion a gagné beaucoup d’intérêt38,39,40,41, car il permet la fabrication de tubes creux.

Semblable à l’impression 3D de microextrusion conventionnelle, l’impression de noyau/coquille est exécutée avec une buse co-axiale (parexemple, deux aiguilles avec des diamètres différents alignées sur le même axe d’une manière, de sorte que l’aiguille plus large enferme l’étroite). Ainsi, deux matériaux peuvent être extrudés simultanément, l’un comme filament central ou noyau « intérieur » et l’autre comme coquille « extérieure »41. À ce jour, la bioimpression co-axiale a été utilisée pour fabriquer des structures avecsolide 42, noyau / coquille43, et les brins creux40,44; cependant, les matériaux utilisés n’ont pas été optimisés pour la viabilité optimale des cellules et la robustesse mécanique des constructions imprimées. Comme mentionné, la technique offre la possibilité de combiner des biomatériaux avec différentes propriétés mécaniques, dans lequel le plus rigide soutient le plus doux. Plus important encore, si le matériau de l’échafaudage (p. ex. alginate, cellulose carboxyméthyle) est extrudé comme la coquille, tandis que le noyau composé de l’agent de liaison croisée (p. ex. chlorure de calcium) est distribué à partir du capillaire intérieur puis rincé après l’impression, il est possible de fabriquer un tube creux continu en une seule étape45.

Dans cet esprit, une méthode simple et reproductible en une seule étape a été développée pour construire des échafaudages bien définis et perfusables pour l’ingénierie des structures vasculaires et d’autres tissus tubulaires. Pour développer une technologie rentable, la fabrication devrait idéalement être un processus en une seule étape. Par conséquent, une configuration de noyau/coquille a été adaptée et intégrée dans le bioimprimeur 3D. La conception de base se compose d’une buse centrale en métal pour éviter la déformation lors de l’injection, autour de laquelle une deuxième buse d’un plus grand diamètre est placée. Une telle mise en place de buse co-axiale permet la co-extrusion des deux flux et la liaison croisée immédiate du canal hydrogel extrudé. Cela permet la fabrication directe de filaments creux à couches multiples, tandis que les liaisons croisées ultérieures avec des concentrations plus élevées de chlorure de calcium (CaCl2) assurent une stabilisation plus permanente de l’extérieur.

En tant que tel, cette méthode permet l’impression simultanée d’échafaudages et de microcanaux, dans lesquels les filaments d’hydrogel creux servent d’échafaudage pour soutenir l’intégrité mécanique des constructions 3D et agir simultanément comme microcanaux intégrés pour fournir nutriments pour la croissance cellulaire. Ce protocole fournit une procédure détaillée de la stratégie de bioimpression 3D de noyau/coquille basée sur l’utilisation d’une buse co-axiale faite sur commande dans laquelle les structures 3D d’hydrogel avec les canaux intégrés sont fabriquées en contrôlant le cross-linking pour produire des filaments creux, qui restent impunables pendant la culture cellulaire.

La configuration d’impression 3D utilisée dans ce travail est configurée comme précédemment décrite par Banoviet et Vihar46 et peut être divisée en trois composants principaux : A) une configuration mécanique CNC à trois axes avec une précision de positionnement de 50 m dans les directions X, Y et Z ; B) deux extrudeurs, adaptés pour les seringues jetables de 5 ml à verrouillage de luer, avec une résolution voxel de 1,2 l; c) le contrôle de l’électronique et des logiciels.

Pour faciliter l’impression de noyau/coquille, une buse appropriée a été développée qui peut être montée sur l’un des extrudeurs (extrudeur primaire, impression du noyau) et est compatible avec les aiguilles émoussées de G27. Il a également la compatibilité luer-lock pour se connecter avec le deuxième extrudeur (impression de la coquille). Les premiers prototypes ont été fabriqués en insérant une aiguille G27 à extrémité émoussée (diamètre intérieur de 210 m, diamètre externe de 410 m) dans une aiguille G21 (diamètre intérieur de 510 m, diamètre externe de 820 m) ou à la pointe conique G20 (diamètre intérieur de 600 m), puis en insérant un n secondaire eedle latéralement pour fournir le matériel de coquille. Cependant, en raison de la légère flexion de l’arbre d’aiguille, il n’est pas possible de produire une pointe de buse avec l’alignement concentrique des aiguilles intérieures et extérieures.

Pour résoudre ce problème, une nouvelle conception de buse a été conçue qui répondait aux critères suivants : 1) elle peut être fabriquée à l’aide d’un moulin CNC à 3 axes, 2) elle peut être fabriquée à partir de divers matériaux (plastiques de haute performance, tels que PEEK ou métaux), 3) elle a une compatibilité luer-lock pour l’application de matériel de coquillage, et 4) est compatible pour une aiguille g27 émoussée et le maintient en place à deux positions pour aligner la pointe avec l’axe central. Un schéma du prototype de la buse est montré dans la figure 1.

Protocol

1. Préparation d’hydrogels et de solutions de liaison croisée En bref, en mélangeant vigoureusement, dissoudre les poudres ALG et CMC dans de l’eau ultra-pure pour obtenir une solution Totale de 3 wt% ALG et 3 wt% CMC.REMARQUE : Dans ce travail, des seringues de 5 ml sont utilisées pour l’impression ; ainsi, la quantité finale de matériel est ajustée à ce volume. Toutefois, pour les autres cartouches d’extrusion et les tailles d’échantillons imprimées, la quantité de matériel préparé doit être mise à l’échelle en conséquence. Ajoutez des nanofibres de cellulose de 1,5 wt% au mélange ALG-CMC pour un renforcement mécanique supplémentaire pour atteindre la viscosité souhaitée, adaptée à l’impression. Agiter la suspension hydrogel jusqu’à ce qu’elle soit homogène à l’aide d’un mélangeur supérieur.REMARQUE : Aucune fibre ou bulle ne devrait être présente dans l’hydrogel. Préparer 10 ml de chlorure de calcium de 100 mm (CaCl2) dans de l’eau ultra-pure, qui est utilisée comme principale solution de liaison croisée pour l’impression. Préparer 10 mL de 5 wt.% CaCl2 solution dans l’eau ultra-pure, qui est utilisé comme une solution secondaire de liaison croisée dans le post-traitement des échafaudages.REMARQUE : En général, toutes les formulations d’hydrogel, qui conviennent à la liaison chimique immédiate, permettent la fabrication en une seule étape de tubes creux et peuvent être utilisées avec ce type de base/coquillage. Les mécanismes d’impression et de liaison croisée doivent être optimisés en conséquence. La viscosité de l’hydrogel varie selon la composition souhaitée; cependant, il peut être ajusté avec des concentrations de polymères et l’ajout d’agents épaississants (par exemple, nanofibres). La viscosité idéale pour l’impression 3D de structures stables est suffisamment élevée pour que le filament extrudé conserve sa forme et que l’échafaudage conserve son propre poids avant de se croiser. 2. Impression de coeur/coquille des échafaudages perfusables Avant l’impression, stérilisez le bioimprimeur en pulvérisant à 70 % d’éthanol à fond et exposez-le à la lumière UV pendant 1 h. Allumez le bioimprimeur et exécutez le logiciel de contrôle, qui vient dans un faisceau avec l’imprimante 3D. Effectuez la procédure de homing en appuyant sur l’icône Accueil. Utilisation du fichier de commande de la barre d’outils Import G-Code, importer le code g d’échafaudage généré. Transférer l’hydrogel dans une seringue stérile de 5 ml et le placer dans l’une des montures extrudentes de l’imprimante 3D. Par l’intermédiaire de la serrure de luer et d’un tube court, connectez-le à l’entrée latérale de luer de la buse de noyau/coquille. Transférer la solution de liaison croisée (100 mM CaCl2) dans une autre seringue stérile de 5 ml avec une aiguille à extrémité émoussée G27 attachée et l’insérer dans le porte-aiguille supérieur de la buse de base/coquille. L’aiguille intérieure doit légèrement dépasser (1 mm) de la buse externe du noyau/coquille. Ajustez l’alignement manuellement. Insérez la deuxième seringue dans la monture d’extrusion. Pour insérer correctement les seringues dans les montures (mise en place indiquée dans la figure 2),contrôlez manuellement les deux supports d’extrusion en cliquant sur les flèches A et B et Up and Down. Avant le début de l’impression, extrudez séparément l’hydrogel et la solution de liaison croisée pour éliminer toutes les bulles d’air excédentaires dans la buse de noyau/coquille et assurer un flux continu d’hydrogel. À l’aide des flèches Z et Up and Down, régler manuellement la distance entre la buse et le substrat d’impression. Il est recommandé d’utiliser un substrat plat d’impression de verre, qui a une bonne adhérence. La buse d’extrusion ne doit pas être en contact avec le substrat pour permettre un écoulement ininterrompu de l’hydrogel. La distance optimale entre la buse et le substrat (hauteur de couche) est généralement la même que la largeur du diamètre de la buse extérieure, mais elle est ajustée au matériau utilisé et aux paramètres d’impression individuels. Ajustez la hauteur d’impression de départ en fonction des besoins individuels. Appuyez sur le bouton Play pour démarrer le processus d’impression.REMARQUE : Il est recommandé d’inclure l’impression d’une jupe (figure 3) entourant l’échafaudage pour assurer la pose d’un filament creux homogène avant l’impression du début de l’échafaudage. Pour obtenir un débit hydrogel optimal avec l’intention d’imprimer des échafaudages optimaux, varier la composition de la formulation, la composition de la solution de liaison croisée et les paramètres d’impression (c.-à-d. la vitesse d’impression, la pression d’extrusion, la température d’impression, la distance entre le le substrat et la buse d’extrusion, etc.). Après l’impression, retirer soigneusement le substrat avec l’échafaudage imprimé et verser la solution secondaire de liaison croisée (5 wt.% CaCl2) sur l’ensemble de l’échafaudage pour assurer le lien croisé sur l’ensemble de l’échafaudage. Incuber 1 min à température ambiante (RT).REMARQUE : Assurez-vous que l’échafaudage entier est immergé dans la solution de liaison croisée. Cette étape est cruciale pour atteindre les propriétés de résistance désirées de l’échafaudage, mais varie en fonction du matériau et de la méthode de liaison croisée utilisée. À l’aide d’un scalpel, couper manuellement l’excès de matière de jupe. Stériliser les échafaudages sous une lumière UV pendant 30 min. Retournez soigneusement l’échafaud et répétez le processus de stérilisation. Détachez soigneusement l’échafaudage du substrat en le tirant doucement sur le côté. Si l’échafaudage adhère fortement au substrat, séparez-le en insérant un bord tranchant entre eux. Transférer l’échafaudage dans un support de culture cellulaire incolore (DMEM complété de 5 wt.% FBS, 100 U/mL de pénicilline et 1 mg/mL de streptomycine), et les incuber à 37 oC dans une atmosphère contenant 5 wt.% CO2 pendant au moins 24 h. 3. Préparation des cellules endothéliales et de la solution d’essai vivante/morte Pour la culture cellulaire, préparer le milieu avancé de culture cellulaire DMEM avec le rouge phénol ajouté et le compléter avec 5 wt.% FBS et 2 mM L-glutamine. Ajouter 100 u/mL de pénicilline et 1 mg/mL de streptomycine. Initier la lignée de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) et les passer conformément aux protocoles de culture HUVEC tels que décrits47.REMARQUE : Il est recommandé de culture les cellules dans le support de culture cellulaire avec le rouge de phénol ajouté pour la visualisation simple pendant l’injection des cellules dans les échafaudages translucides blancs comme décrit ci-dessous. Pour le comptage cellulaire, pipette 100 l de cellules suspendues dans les médias de culture cellulaire et les tacher avec 900 l de 0,1 wt.% solution bleue trypan. Utilisez un compteur cellulaire automatisé ou un hémocytomètre manuel pour compter et obtenir le nombre estimatif de cellules en suspension. Pour l’exemple vivant/mort, préparez une solution de 4 mM Calcein-AM et 2 mM d’iodure de propidium en PBS stérile.REMARQUE : La solution vivante/morte doit être préparée directement avant de procéder à l’assidu. 4. Transférer des cellules dans des échafaudages Retirez les échafaudages des supports de culture cellulaire et transférez-les dans un plat Petri en verre suffisamment grand. Immédiatement avant d’injecter les cellules dans les échafaudages, dissocier les HUVEC des flacons en utilisant le traitement par 0,25 wt.% trypsine. En bref, disposer des supports de culture cellulaire et couver les cellules avec 0,25 wt.% trypsine (2 ml) pendant 5 min à 37 oC. Après l’incubation, ajouter 3 ml de support de culture cellulaire aux cellules trypsinisées et transférer toutes les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min et disposer du supernatant. Resuspendre les cellules dans les médias de culture cellulaire frais. Comptez les cellules telles que décrites précédemment. Ajuster la concentration cellulaire totale en fonction des besoins individuels. Dans ce travail, une concentration de départ de 340 000 cellules/mL est utilisée. Resuspendre les cellules dans une seringue stérile avec une aiguille G27 émoussée attachée. Trouvez un point d’entrée et commencez à injecter soigneusement des cellules dans les échafaudages. La suspension cellulaire s’écoule à travers un échafaudage translucide doit être visible. Assurez-vous que l’échafaudage entier se remplit de suspension cellulaire. Immerger les échafaudages dans les supports de culture cellulaire et les incuber à 37 oC dans une atmosphère contenant 5 wt.% CO2 pendant 10 jours. Réapprovisionnez les médias de culture cellulaire en fonction des besoins expérimentaux. 5. Test de vie/mort et imagerie cellulaire Après l’incubation, rincer les échafaudages avec PBS. À l’insu d’une aiguille émoussée, injectez soigneusement la solution vivante/morte préparée précédemment (4 mM de calcin-AM et 2 mM d’iodure de propidium en PBS) dans les échafaudages et incubez-les en PBS pendant 30 min à 37 oC. Assurez-vous que la solution traverse toute la longueur de l’échafaudage. Rincer les échafaudages avec PBS. Transférer délicatement les échafaudages sur un toboggan en verre. Observez les cellules teintées directement dans les échafaudages sous un microscope à fluorescence.REMARQUE : Les cellules viables produisent la fluorescence verte et les cellules mortes émettent la lumière rouge de fluorescence.

Representative Results

L’objectif de ce travail était de développer une buse de noyau/coquille facile à fabriquer avec la compatibilité luer pour l’impression de noyau/coquille des structures de tas de bois. En outre, un protocole d’impression simple et répétable en une seule étape a été décrit, qui est simple à modifier et s’adapte à un large éventail de matériaux et de différents mécanismes chimiques de liaison croisée pour construire des échafaudages bien définis et perfusables pour l’ingénierie des structures vasculaires et tubulaires de tissu. Buse de coeur/coquilleLa buse est composée d’une aiguille g27 à bout émoussé (pour l’impression du filament axial intérieur) et du corps de la buse, qui maintient l’aiguille en place et crée une buse extérieure pour le filament de la coquille avec un port de connexion pour l’entrée des matériaux. Un schéma est indiqué dans la figure 1. Deux seringues de 5 ml, qui sont placées dans les extrudeurs individuels et fournissent les matériaux de noyau et de coquille. Tubing relie le corps de la buse avec la seringue, fournissant le matériel de coquille. L’assemblage complet de la buse de noyau/coquille et de la configuration de seringue est indiqué dans la figure 2. Le premier prototype fonctionnel de la carrosserie de la buse a été fabriqué par CNC moudre un bloc de polyoxyméthylène (POM). Compatibilité et étanchéité entre l’élément, une aiguille g27 et un tube ont été testés en installant dans Vitaprint. Aucune fuite de la matière de coquille n’a été observée dans la buse, le connecteur de verrouillage de luer, ou entre le corps et l’aiguille. Le corps de la buse s’adapte étroitement avec le moyeu d’aiguille (connecteur de luer), assurant le mouvement synchronisé de la buse entière avec l’extrudeur. Bâtiment d’échafaudageL’approche la plus simple pour fabriquer des échafaudages est de déposer des matériaux couche par couche où la direction d’impression est changée chaque couche consécutive, généralement à un angle de 90 degrés. En raison des propriétés visco-élastiques et hygroscopiques des hydrogels, la fidélité de la forme de conservation des structures imprimées demeure difficile. L’objectif principal de cette section de protocole est l’impression 3D d’échafaudages de noyau/coquille perfusables utilisant deux polymères, qui ont précédemment montré des résultats prometteurs pour la construction d’échafaudages (ALG et CMC) avec l’ajout de nanofibres de cellulose (NFC) pour augmenter stabilité mécanique. ALG et CMC sont des copolymères linéairessolubles dans l’eau et les deux contiennent des groupes de carboxyles, qui peuvent être reliés entre eux avec l’ajout de cations divalentes. Les particules Ca2mD forment simultanément des liaisons ioniques avec deux groupes fonctionnels, formant des connexions entre les chaînes de polymères, augmentant ainsi la rigidité du gel. Impression d’échafaudages perfusablesLe but de ce processus est d’imprimer en 3D des structures d’échafaudage simples à tas de bois, qui s’étendent sur plusieurs couches et conservent leur fidélité de forme ainsi que la perfusabilité jusqu’à ce qu’elles deviennent entièrement reliées entreles. Cela nécessite même une coextrusion du noyau et de la coquille sans mouvements de croisement ou de rétraction, ce qui peut interrompre le flux. Par conséquent, les méthodes typiques de modélisation et de découpe de CAO sont moins appropriées. Dans ce travail, un code g conçu manuellement est utilisé, et un générateur de code g basé sur python a été développé pour la préparation rapide de code g. Les échafaudages ont été structurés en forme de grille de bois et construits sur une surface de verre plat. La fabrication a été effectuée couche par couche, déposant les lignes de croisement de chaque couche successive dans un angle de 90 degrés par rapport à la précédente. En outre, chaque couche successive était 2% plus étroite dans les directions X et Y, assurant un support continu du filament par les couches précédentes. La distance entre les filaments (taille macropore) peut être précisément conçue dans le code g en tenant compte du diamètre extérieur du filament extrudé (0,8 mm) et de la distance entre les grilles (3 mm). Les échafaudages étaient tenus de remplir les principaux critères d’inclusion pour un examen plus approfondi. Tout d’abord, les échafaudages d’au moins 4 couches de hauteur étaient nécessaires pour conserver leur intégrité structurelle et leur géométrie (p. ex., taille des macropores) pendant l’impression, afin d’être admissibles à un développement ultérieur. Deuxièmement, les échafaudages devaient rester perfusables (microcanaux stables) même après avoir été incubés pendant 7 jours dans les médias de culture cellulaire à 37 oC. À intervalles de temps appropriés (1, 2, 5 et 7 jours), des échafaudages ont été retirés des médias culturels et testés pour voir s’ils étaient encore impraticables. Dans la figure 4A, la section transversale d’un échafaudage fraîchement imprimé et post-traité affiche un canal creux clairement visible à l’intérieur du filament. Dans la figure 4B, il est clair que même après 72 h d’incubation dans les médias de culture cellulaire à 37 oC, le filament conserve la structure creuse sur toute la longueur de l’échafaudage. Plusieurs formulations étaient imprimables, restaient structurellement stables, conservaient la géométrie imprimée et demeuraient impuntables; cependant, un seul a été choisi pour d’autres essais (c.-à-d., 3 wt.% ALG – 3 wt.% CMC – 1.5 wt.% NFC), qui a permis l’impression d’échafaudages perfusables avec jusqu’à 10 couches. Le processus d’impression avec la buse personnalisée est indiqué dans la figure 5A. L’impression de noyau/coquille était possible avec des formulations moins visqueuses ; cependant, les gels avec des concentrations plus élevées n’ont pas permis le flux continu par la buse. Pour le rattachement principal (matériau de base, livré pendant l’impression) 100 mM CaCl2 a été utilisé, ce qui a stabilisé adéquatement la formation continue d’un filament creux, sans causer de solidification du gel dans la buse. Après l’impression, les échafaudages ont été trempés dans une solution CaCl2 de 5 wt.% pour relier complètement l’hydrogel pour une fidélité à long terme. Un échantillon d’échafaudage fini est représenté dans la figure 5B. Pendant l’optimisation, le processus de la formulation d’un colorant artificiel a été utilisé dans la solution de base, pour permettre l’évaluation visuelle et l’examen de la qualité du filament extrudé. Le colorant n’a pas été utilisé pour la fabrication des échafaudages finaux, qui ont été préparés pour l’ensemencement et la culture des cellules. Assay vivant/mortAprès l’incubation, un analyse vivante/morte a été utilisé pour visualiser les CE et faire la distinction entre les cellules vivantes (vertes) et mortes (rouges) dans l’échafaudage incubé. Cela a servi deux objectifs principaux: A) pour déterminer si les échafaudages fournissent un environnement biocompatible pour favoriser la croissance et l’adhérence sans montrer d’effets nocifs sur la cellule, et B) pour visualiser l’intégrité structurelle des structures tubulaires et de leur système de canal interne plus en détail. Les résultats de l’analyse en direct/mort sont indiqués à la figure 6. En présence d’estérases intracellulaires, la membrane plasmatique perméable Calcein-AM est convertie en Calcéine, émettant de la lumière de fluorescence verte dans les cellules vivantes. D’autre part, les cellules apoptotiques sont visualisées par l’iodure de propidium imperméable à la membrane, qui fluoresces en rouge lorsqu’elles sont intercalées dans l’hélice double de l’ADN. Des images en direct/mortes et des images lumineuses d’échafaudages ont été combinées pour aider à visualiser les cellules à l’intérieur des canaux creux. La solution de coloration a été injectée, et l’assay effectué directement dans les échafaudages imprimés en 3D après l’incubation des cellules d’échafaudage pendant 48 h. Il convient de noter qu’une densité d’ensemencement relativement faible d’ECs a été utilisée (340 000 cellules/mL), car cette étude n’a servi que de preuve de concept pour l’impression de carottes et de coquillages d’échafaudages perfusables. La conclusion la plus significative de l’essai vivant/mort est que même après 48 h, aucune cellule morte (rouge) n’a été observée, prouvant que ni le matériau d’échafaudage lui-même, ni ses produits de dégradation n’ont montré d’effets toxiques. En outre, les CE ont effectivement adhéré et sont restés attachés à l’intérieur des échafaudages et ont semblé former des agglomérats distribués uniformément lorsqu’ils étaient cultivés à l’intérieur des canaux. Ceci suggère que la méthode de fabrication décrite et la formulation d’échafaudage fournissent un cadre approprié pour construire in vivo, pertinents, morphologies tubulaires de tissu. En plus d’imiter les interactions cellule-ECM et la communication cellulaire serrée dans les trois dimensions spatiales, l’ingénierie tissulaire complexe nécessite également une exposition constante des cellules à un milieu frais pour maintenir leur viabilité. Ceci peut être réalisé à son tour par un réseau de canaux denses sous perfusion continue, ce qui justifie une enquête plus approfondie dans les travaux futurs, et nécessitera l’optimisation des paramètres de matériaux et de croissance pour faciliter l’ingénierie tissulaire à long terme de la vascularisation. Figure 1 : Prototype de buse core/shell. (A) La conception globale et les principaux composants du prototype de carrosserie de la buse sont présentés. La buse est complétée par l’insertion d’une aiguille G27 émoussée par le haut. Les supports d’aiguille du haut et du bas immobilisent et réalignent l’aiguille avec l’axe de la buse, en veillant à ce que la pointe s’étendde de la buse à travers le centre.  Pour relier la buse à un matériau « coquillage » extrudé de la seringue secondaire, le tube avec un connecteur à verrouillage de luer est fixé à l’entrée latérale. De là, le matériau est transmis à la buse par un canal étroit. La fabrication du canal mentionné nécessite le forage en deux positions, produisant des trous qui doivent être plafonnés après la fabrication). (B) Un gros plan de la buse avec une aiguille G27 insérée s’étend hors de la buse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Configuration finale du noyau/shell. (A) La buse complète du noyau/coquille est montrée avec des seringues correctement fixées contenant l’hydrogel (à droite), la construction de la solution « coquille » et de liaison croisée (à gauche) extrudée comme étant le « noyau ». (B) Est montré le noyau / shell set-up installé dans le système Vitaprint avec deux extrudeurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Code G de l’échafaudage tubulaire. Voici une capture d’écran du logiciel d’imprimante est montré, en particulier l’aperçu du chemin (A) et brut g-code de la première couche (B). Le code g est un ensemble d’instructions avec des coordonnées cibles dans des directions spatiales absolues (X, Y, Z), ainsi que l’extrusion (A,B) dans des directions relatives. La commande G détermine le type d’instruction, tandis que G1 représente un mouvement linéaire vers les coordonnées cibles et que le G92 détermine la position de départ initiale. De plus, le taux d’alimentation des commandes suivantes est déterminé avec l’instruction F en mm/min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Section transversale d’un brin d’échafaudage avec un intérieur creux. (A) La tranche transversale de l’échafaudage fraîchement imprimé et post-traité est montrée. (B) La tranche transversale de l’échafaudage après avoir été incubée dans les médias de culture cellulaire pendant 72 h est montrée. Tandis que la forme de la buse définit l’extrusion d’un tube avec une section transversale ronde, le filament semble être quelque peu aplati sur la déposition. Le canal interne, cependant, reste intact et conserve sa forme pendant l’incubation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Impression de cœurs et de coquillages d’échafaudages. Ici, la fabrication (A) d’un échafaudage à tube creux à trois couches et sa forme finale (B) sont montrées. Pour une meilleure visualisation, la solution de liaison croisée dans le noyau a été tachée d’un colorant rouge. La formulation présente une stabilité mécanique suffisante pour conserver la stabilité de l’échafaudage, même si des structures plus épaisses (jusqu’à 10 couches, données non montrées) sont fabriquées. Les dimensions extérieures de la structure finale étaient d’environ 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6 : L’assay en direct/mort effectué directement dans les échafaudages. Une suspension des HUVEC a été injectée dans le canal intérieur d’échafaudage, incubée pendant 48 h, et traitée avec la teinture vivante/morte. Les HUVEC viables émettent une lumière de fluorescence verte, qui est représentée dans les points lumineux de l’image. Les cellules mortes émettent de la lumière de fluorescence verte; cependant, aucun n’est visible dans l’échafaudage observé. La distribution des cellules signifie également la forme et les capacités de perfusion conservées des canaux. Dans une moindre mesure, la solution d’assay vivante/morte a également taché le matériau d’échafaudage, produisant la fluorescence légère sous le microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Conception de buse
À l’aide de la buse développée de noyau/coquille, intégrée dans un système Vitaprint à deux extrudeurs, des échafaudages creux tubulaires ont été fabriqués en une seule étape. Pour atteindre une épaisseur égale de la paroi du tube à travers la plupart des échafaudages préparés, l’aiguille doit être positionnée centralement sur l’axe de l’anneau d’extrusion externe. Les aiguilles de jauge standard présentent souvent une légère excentricité, mais significative, hors de l’axe. Ainsi, le corps de la buse a été conçu pour tenir l’aiguille à deux endroits, une fois au sommet (fixation du moyeu) et une fois avant la chambre finale de noyau/coquille (fixant la canule elle-même), corrigeant son alignement axial. La précision de l’alignement axial augmente avec la distance entre le point de fixation. Il y a cependant un compromis entre la longueur de l’aiguille et le volume de la chambre de buse disponible. Pour améliorer davantage la fonctionnalité de l’installations, certaines modifications de la buse peuvent être implémentées : A) une monture de buse avec une stabilité améliorée, B) des buses supplémentaires pour une plus large gamme de compatibilité d’aiguille, C) un mécanisme d’ajustement précis pour l’aiguille à le positionnement de la buse, et D) intégrant des entrées supplémentaires et des dispositifs microfluidiques pour la préparation des matériaux à la volée.

Optimisation d’Hydrogel
Pour déterminer le rapport optimal ALG:CMC, plusieurs itérations matérielles ont été évaluées. En général, l’impression de carottes et de coquillages avec des concentrations supérieures à 3 wt.% des deux composants a été rendue impossible, parce qu’elle ne permettait pas un flux continu d’hydrogel ou a entraîné l’engorgement de la buse. Plus précisément, la concentration d’ALG au-dessus de 3 wt.% a augmenté la viscosité excessivement et a eu comme conséquence le colmatage de buse, alors que les concentrations plus basses d’ALG et les concentrations plus élevées de CMC (gt;3 wt.%) ont ralenti des temps de liaison croisée et n’ont donc pas fourni suffisamment soutien structurel de l’échafaudage. L’impression de noyau/coquille était possible avec des formulations moins visqueuses ; cependant, la viscosité extrudée de gel doit être suffisante pour maintenir la fidélité à long terme de forme. En fin de compte, un ratio ALG:CMC de 1:1 s’est avéré être le choix le plus approprié qui confirme une étude précédente de Maver et coll.49. L’ajout de NFC a considérablement amélioré l’imprimabilité et la rigidité structurelle des échafaudages imprimés de noyau/coquille, mais n’a eu aucun effet significatif sur les propriétés de liaison croisée du matériau.

Les applications personnalisées, optimisées pour des types de cellules spécifiques et des configurations expérimentales, nécessiteront des matériaux d’échafaudage bien adaptés, qui varieront dans la composition et les mécanismes de liaison croisée. La méthode décrite dans ce travail est basée sur une solution de polymère mélangé alginate-cellulose, qui est reliée ioniquement entre l’utilisation ionique des ions Ca2. L’alginate lui-même est un polymère linéaire de blocs de résidus de l’Alginate lui-même qui peuvent être réversiblement ioniquement croisés par l’application de Ca2 et d’autres cations divalentes telles que Sr2,Br2,Mg 2 degrés. Néanmoins, l’ion le plus largement utilisé pour le lien croisé de l’alginate reste Ca2 sous la forme de CaCl2. Ca2 peut également être utilisé sous la forme de CaSO4 ou CaCO3; cependant, la faible solubilité de CaSO4 par rapport à CaCl2 signifie une gélation plus lente. CaCO3 donne des temps de gel encore plus lents qui peuvent entraîner des propriétés mécaniques faibles et incohérentes.

Des temps de gel plus longs produisent généralement une construction plus homogène, cependant, certaines applications, telles que l’impression de noyau/coquille exige des taux de gel rapide50. Les ions Mg2MD induisons également à la gélation; cependant, leur efficacité de liaison croisée est d’environ 5x-10x plus bas, par rapport à Ca2 ,avec des temps de liaison croisée de 2-3 h. En outre, les ions de magnésium sont plus sélectifs vers les unités guluroniques, d’où le lien croisé dépend davantage de la composition chimique de l’ALG51. Dans ce cas, un taux de gel rapide est essentiel pour assurer la formation continue du canal creux avant que la structure creuse puisse s’effondrer. CaCl2 donne le taux de gel le plus rapide, ce qui est crucial pour le dépôt direct de filaments creux. 100 mM CaCl2 a été utilisé, ce qui a stabilisé adéquatement la formation continue d’un filament creux sans causer la solidification du gel dans la buse.

Impression et post-traitement des échafaudages
Les étapes suivantes doivent être prises en considération au cours de cette partie du processus, y compris 1) veiller à ce que toutes les solutions et les matériaux, y compris le bioimprimeur 3D sont correctement stérilisés avant l’impression. 2) Lors de la préparation de l’hydrogel, l’homogénéité du matériau est cruciale pour l’impression continue. L’introduction d’impuretés ou de bulles d’air doit être évitée, car ils peuvent obstruer la buse et / ou perturber l’extrusion. 3) Les seringues doivent être correctement reliées à la buse de noyau/coquille par l’intermédiaire du mécanisme de luer-lock et correctement insérées dans les supports d’extrudement comme vu dans la figure 2A, B. 4) Avant d’imprimer une structure complexe, il est recommandé de pré-extruder une petite partie du gel et la solution de liaison croisée pour effacer les bulles d’air excédentaires dans la buse de noyau/coquille et assurer un flux continu d’hydrogel. Cela peut être incorporé directement dans le code g pour améliorer la répétabilité. 5) Il est utile d’ajouter une jupe entourant l’échafaudage pour assurer la pose d’un filament creux homogène avant que l’impression de l’échafaudage lui-même commence.

En outre, 6) pour améliorer l’adhérence entre le filament d’impression et le substrat, il est recommandé d’utiliser une surface plane avec une bonne adhérence (c.-à-d., une glissière en verre ou un plat Petri). 7) La buse d’extrusion ne doit pas être en contact direct avec le substrat pour permettre un écoulement ininterrompu de l’hydrogel. La distance initiale aura un impact important sur la qualité de l’impression, mais l’épaisseur du filament extrudé est une bonne approximation du réglage initial. 8) La hauteur d’impression de départ dans le code g doit être ajustée en fonction des besoins individuels. Une fois les paramètres d’impression optimisés, le code g de l’échafaudage doit être importé dans le logiciel Planet CNC et le processus d’impression a commencé comme décrit dans le protocole. 9) Pour contrôler et optimiser le débit d’hydrogel avec l’intention d’imprimer des échafaudages optimaux, la composition de formulation et les paramètres d’impression doivent être variés (c.-à-d. la vitesse d’impression, la pression d’extrusion, la température d’impression, la distance entre le substrat et buse d’extrusion, hauteur de couche, taille d’échafaudage, etc.).

En général, des débits plus élevés sont nécessaires pour imprimer des formulations avec une viscosité plus élevée. Comme nous l’avons mentionné, toutes les formulations d’hydrogel, qui conviennent à la liaison chimique immédiate, permettent la fabrication en une seule étape de tubes creux et peuvent être utilisées avec la configuration du noyau/coquille décrite. Les mécanismes d’impression et de liaison croisée doivent être optimisés en conséquence. Après l’impression, tous les échafaudages ont été post-traités par liaison croisée secondaire avec 5 wt.% CaCl2 solution, qui a assuré la liaison complète du composant ALG-CMC et stérilisé des deux côtés sous une lumière UV pendant au moins 30 min. Il faut s’assurer d’engloutir complètement l’échafaudage avec la solution de liaison croisée et d’incuber assez longtemps pour terminer le processus de liaison croisée. Le post-traitement sera différent en fonction du matériau et du mécanisme de liaison croisée utilisés, qui doivent être considérés à l’avance. Après le traitement, les échafaudages doivent être retirés soigneusement du substrat, transférés dans les médias de culture cellulaire et incubés dans une atmosphère contrôlée pendant au moins 24 heures avant l’ensemencement cellulaire. L’utilisation d’un milieu incolore améliorera la visibilité de la suspension cellulaire lors de l’injection dans les échafaudages.

Assay vivant/mort
La solution vivante/morte doit être préparée directement avant de procéder à l’étude et maintenue dans l’obscurité avant de procéder à l’étude, car elle contient des colorants de fluorescence qui sont sujettes au blanchiment. Après le temps d’incubation souhaité, le support de culture cellulaire doit être soigneusement jeté autour des échafaudages et rincé avec du PBS. Idéalement, le même point d’entrée devrait être utilisé pour l’ensemencement cellulaire suivi de l’attaque vivante/morte injectée dans les échafaudages.

Importance des résultats
ALG et CMC ont déjà été utilisés pour promouvoir l’angiogenèse in vitro. Sur la base de ses caractéristiques ECM-mimétique, de ses liens croisés physiques et de sa biocompatibilité, ALG a été couramment utilisé comme composant pour la livraison et la libération contrôlée de facteurs de croissance angiogéniques (p. ex., bFGF, HGF, VEGF164 et Ang-1- respectivement)52 ,53,54. En outre, en combinaison avec la gélatine, CMC a également été utilisé pour encapsuler les cellules endothéliales vasculaires en raison de ses capacités de liaison croisée rapide dans des conditions physiologiques55. NFC ont été ajoutés pour augmenter encore la stabilité mécanique et la fidélité de forme des échafaudages. Il convient de souligner que l’objectif n’était pas d’améliorer la vascularisation, mais de démontrer la possibilité de produire des échafaudages ALG-CMC creux, imprimés en noyol/coquille, ce qui facilite également l’attachement et la prolifération des HUVECs. Le choix d’utiliser un mélange ALG-CMC était basé sur des résultats de matériaux de base couramment utilisés, facilement accessibles et biocompatibles qui pourraient permettre l’impression de carottes et de coquillages de canaux creux. Beaucoup d’autres matériaux peuvent être des options plus viables pour améliorer l’angiogenèse ; cependant, certains ne sont pas adaptés à l’impression de noyau/coquille, car ils ne facilitent pas la gélation rapide/liaison croisée, qui est cruciale dans cette approche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent saluer le soutien financier apporté à ce projet de l’Agence slovène de recherche (numéros de subvention : P3-0036 et I0-0029) et du Ministère des sciences, de l’éducation et des sports (numéro de subvention : 5442-1/2018/59).

Materials

Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 mΩ cm at 25⁰C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)
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Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).
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