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Genetics

Microarray di DNA e RNA ad alta densità - Sintesi fotolitografica, ibridazione e preparazione di grandi librerie di acido nucleico

Published: August 12, 2019
doi:
10.3791/59936
, , , ,
1Institute of Inorganic Chemistry, Faculty of Chemistry,University of Vienna

Summary

In questo articolo, presentiamo e discutiamo nuovi sviluppi nella sintesi e nelle applicazioni di microarray di acido nucleico fabbricati in situ. In particolare, mostriamo come i protocolli per la sintesi del DNA possono essere estesi all’RNA e come i microarray possono essere utilizzati per creare librerie di acido nucleico recuperabili.

Abstract

La fotolitografia è una tecnica potente per la sintesi di oligonucleotidi di DNA su vetrini di vetro, in quanto combina l’efficienza delle reazioni di accoppiamento al fosforamidite con la precisione e la densità della luce UV riflessa da specchi di dimensioni micrometriche. La fotolitografia produce microarray che possono ospitare da centinaia di migliaia fino a diversi milioni di sequenze di DNA diverse, 100 nt o più, in poche ore. Con questo spazio di sequenza molto grande, i microarray sono piattaforme ideali per esplorare i meccanismi delle interazioni nucleico acido-ligando, che sono particolarmente rilevanti nel caso dell’RNA. Recentemente abbiamo riferito della preparazione di un nuovo set di fosforamiditi dell’RNA compatibili con la fotolitografia in situ e che sono stati successivamente utilizzati per far crescere oligonucleotidi di RNA, omopolimeri e sequenze di base miste. Qui, illustriamo in dettaglio il processo di fabbricazione di RNA microarray, dalla progettazione sperimentale, alla configurazione strumentale, sintesi array, deprotection e analisi di ibridazione finale utilizzando una sequenza modello 25mer contenente tutte e quattro le basi come esempio. Parallelamente, andiamo oltre gli esperimenti basati sull’ibridazione e sfruttiamo la fotolitografia microarray come porta di accesso poco costosa alle complesse librerie di acido nucleico. Per farlo, i microarray di DNA ad alta densità sono fabbricati su un monomero sensibile alla base che permette al DNA di essere comodamente scovigiato e recuperato dopo sintesi e deprotection. Il protocollo di fabbricazione è ottimizzato in modo da limitare il numero di errori sintetici e a tal fine, viene introdotto uno strato di soluzione-carotene per assorbire i fotoni UV che potrebbero altrimenti riflettersi sui substrati di sintesi. Descriviamo in modo passo-passo il processo completo di preparazione della biblioteca, dalla progettazione alla scissione e alla quantificazione.

Introduction

L’uso pratico di microarray di DNA è stato tradizionalmente nello studio delle variazioni nei livelli di espressione genica tra due popolazioni cellulari, utilizzando filamenti complementari e fluorescenza come metodo di rilevamento1. Occasionalmente, microarray di DNA si avventurano in eventi di legame con leganti acido non nucleico, come le proteine, con una strategia di permutazione di sequenza sistematica che offre una panoramica completa del paesaggio legante2,3, 4,5. Questo approccio trasforma efficacemente i microarray da mere superfici di ibridazione in piattaforme con ampia copertura di sequenza, che sarebbe una risorsa per lo studio del mondo più ricco e complesso della struttura e della funzione dell’RNA. Sostenuti dalla reazione di accoppiamento fosforodite estremamente efficiente6, gli array di DNA sintetizzati in situ possono ora essere considerati anche come una fonte a basso costo di DNA7, che sta diventando particolarmente rilevante considerando la crescente domanda di materiale acido nucleico per l’assemblaggio genico8,9, nanostructures basate sul DNA10, memorizzazione di informazioni o sequenziamento11,12. Allo stesso modo, le tecnologie di sequenziamento trarranno probabilmente beneficio dallo sviluppo di metodi che producono miscele molto complesse di oligonucleotidi RNA13. In questo contesto, i protocolli di fabbricazione dell’array che consentono di sintetizzati gli oligonucleotidi in situ e ad alta densità sono posizionati in posizione ideale per soddisfare le esigenze del campo in rapida espansione della biotecnologia dell’acido nucleico. Tuttavia, con un campo così diversificato come la biotecnologia, lo scopo di ogni applicazione può richiedere che il DNA su microarray sia prodotto ad alta produttività o con una quantità molto bassa di errori sintetici14,15, o entrambi, richiedendo un uno sguardo più attento ai protocolli di sintesi dei microarray di DNA che, storicamente, sono stati ottimizzati principalmente per i test di ibridazione. Nel frattempo, la sintesi in situ di microarray di RNA è stata trovata come uno sforzo impegnativo, con la maggior parte della difficoltà associata al gruppo di protezione per la funzione 2′-OH, di solito una moiety silyl nella sintesi standard in fase solida che viene rimossa con reagenti a base di fluoro, sostanze chimiche incompatibili con le superfici in vetro o silicio. Tali problemi e sfide nella sintesi di microarray di DNA e RNA sono stati recentemente oggetto di un grande lavoro, in particolare con l’approccio fotolitografico16.

La fotolitografia utilizza la luce UV per sbloccare gli oligonucleotidi prima dell’accoppiamento e richiede maschere per costruire un modello di esposizione ai raggi UV, organizzando e controllando così spazialmente la crescita degli oligonucleotidi. Le maschere fisiche sono state sostituite da microspecchi controllati al computer la cui inclinazione riflette selettivamente la luce UV sul substrato microarray17,18,19. Come sorgente UV, utilizziamo una luce a 365 nm proveniente da una sorgente LED ad alta potenza20. Le attuali configurazioni fotolitografiche sono dotate di array di microspecchi contenenti specchi 1024 x 768, corrispondenti a più di 780.000 punti indirizzabili individualmente (“caratteristiche”) su una piccola area di soli 1,4 cm2o 1080p con array di 1920 x 1080, o >2 milioni di specchi. Ciascuno degli specchi nel dispositivo ha quindi il controllo diretto sulla sequenza cresciuta sulla funzione corrispondente. Ad eccezione della luce UV, la fotolitografia funziona come una tecnica di sintesi in fase solida e adotta la chimica del fosforamidite a ciclo. Solo che richiede una strategia di protezione completamente diversa per la sintesi dell’RNA per avere successo. Abbiamo sviluppato una nuova serie di fosforamiditi dell’RNA sensibili alla luce che portano i gruppi di protezione iddrina-labile21. Questi monomeri permettono all’RNA di essere deprotetto in condizioni miti che non influenzano l’integrità della superficie. Un primo passo di deprotection utilizza la trietilamina per rimuovere i gruppi di protezione del fosforestro cianoetietile, mentre l’iddrina viene utilizzata in un secondo passaggio separato per rimuovere quelle delle funzioni di amine 2′-OH ed esocicliche. In tal modo, gli oligonucleotidi di RNA di 30 nt di lunghezza e di qualsiasi sequenza possono ora essere sintetizzati in situ su microarray22,23. Parallelamente, abbiamo anche recentemente iniziato ad affrontare le questioni della produttività, della qualità e della velocità nella fotolitografia del DNA e dell’RNA. Abbiamo misurato l’efficienza di accoppiamento >99% per tutti gli amiditi di DNA e RNA (Figura 1) e studiato ogni singolo passo del ciclo di allungamento dell’oligonucleotide, dal tempo di ossidazione, alla scelta dell’attivatore e all’esposizione ottimale UV24 , 25. Abbiamo portato nuovi gruppi protettivi sensibili alla luce che possono essere rimossi in pochi secondi, trasformando la sintesi di centinaia di migliaia di 100 mercanti in un processo di poche ore26. Abbiamo anche raddoppiato la velocità effettiva della fabbricazione di array esponendo due substrati contemporaneamente27. Infine, abbiamo introdotto una fosforamidite dT contenente un gruppo di succinyl sensibile alla base come un modo conveniente per fendere, raccogliere e analizzare il DNA e gli oligonucleotidi in RNA, che è centrale per la preparazione della biblioteca28.

Nonostante l’aspetto relativamente banale della sintesi in fase solida del DNA e dell’RNA, specialmente per i chimici dell’acido nucleico, la fotolitografia dei microarray rimane un aggiornamento non banale che richiede una configurazione complessa, un attento controllo e supervisione del processo, e istruzioni separate per la manipolazione post-sintetica a seconda della natura dell’oligonucleotide e del tipo di applicazione. In questo articolo, desideriamo fornire una presentazione dettagliata dell’intera procedura passo-passo della sintesi in situ di microarray di DNA e RNA per fotolitografia, dalla progettazione sperimentale all’analisi dei dati, con particolare attenzione alla preparazione degli strumenti e Consumo. Descriviamo quindi i metodi di deprotection post-sintetici che corrispondono allo scopo previsto della fabbricazione di microarray (cioè l’ibridazione o il recupero delle librerie di acido nucleico).

Protocol

1. Progettazione di microarray Scrivere le sequenze da sintetizzate in un editor di testo, 5′-3′, una riga per sequenza. Per il controllo qualità 25mer, utilizzare la sequenza “GTCATCATCATCATACCACCGGGC”. Utilizzare le lettere A, C, G e T per i nucleotidi del DNA e i numeri 5, 6, 7 e 8 per i nucleotidi dell’RNA. In caso di preparazione della libreria, aggiungere un numero aggiuntivo (ad esempio, 9) alla fine del 3′ di ogni sequenza. Questo corrisponderà all’accoppiamento del monomero sensibile alla base. Ogni sequenza deve essere seguita da una virgola. Assegnare un nome a ogni sequenza dopo la virgola e verificare che ogni corsia segua il formato [sequence,#sequence_name] (senza parentesi). Salvare l’elenco delle sequenze come file .txt. Avviare MatLab quindi caricare il programma ChipDesign.m. Eseguire il programma. Nella finestra Pannello delle proprietà, caricare il file di layout EntireChip del microarray. Caricare il file di layout MilliChip se lo scopo è sintetizzare l’intero array in quattro posizioni identiche. Nella finestra Pannello proprietà, in Specificachip, selezionare Seleziona contenitore, quindi Area di sintesi. In Modello, selezionare il modello che restituisce la quantità corretta di feature indirizzabili, contando il numero di sequenze, ovvero il numero di repliche. Per il controllo qualità 25mer, selezionare il modello 25:36. In Seleziona contenitoreselezionare Fiducial. Le caratteristiche fiduciarie sono di solito sintetizzate agli angoli dell’area di sintesi e vengono utilizzate per estrarre i dati di ibridazione. Con l’opzione Fiducial selezionata, scrivere una sequenza (5′-3′) che verrà sintetizzata sulle feature fiduciarie e che può fungere da controllo positivo. Per l’esperimento 25mer, utilizzare la stessa sequenza di DNA. In Sequenza, caricare il file di testo contenente tutte le sequenze scritte. Assicurati che l’opzione Randomizza sia selezionata. Assegnare un titolo all’esperimento in Titolo progetto e, in Sequenza linker, scrivere TTTTT (corrispondente a un linker T5). Premere Genera, quindi individuare i file di progettazione dell’array e le maschere (Figura 2) nella cartella MaskGen_delta_rc1/Designs. Assicurarsi che contenga uno scriptdi visualizzazione, una sequenza di flusso e un file di progettazione. Per la preparazione della libreria, aprire lo script di visualizzazione. Aggiungere una riga aggiuntiva nella parte inferiore dello script di visualizzazione che copia esattamente la prima riga dello script (ad esempio, visualizzare First_Mask.bmp 150). Questo rimuoverà il gruppo fotoprotezione foto terminale alla fine 5′ di tutti gli oligonucleotidi. Avviare il programma AutoJob creatore del processo, caricare un modello facendo clic su Carica modello, quindi fare clic su Script di visualizzazione per caricare il file di script di visualizzazione generato da MatLab. Premere Genera. Questo passaggio creerà una serie di istruzioni, chiamate jobfile, che controlleranno la comunicazione del computer con i microspecchi e il sintetizzatore del DNA. 2. Preparazione e funzionalizzazione dei vetri Forare una diapositiva in due posizioni corrispondenti alla posizione del tubo di inserimento e di uscita sulla cella di sintesi. Utilizzare una punta di diamante di 0,9 mm su un router CNC per perforare con precisione e in modo affidabile. Sciacquare i vetrini forati con acqua ultrapura e disporli in un rack di diapositive. Pulire le superfici sonalgiando gli scivoli in un bagno d’acqua contenente il 5% di un detergente speciale a base di ammoniaca per 30 min a 35 gradi centigradi. Sciacquare lo scivolo con H2O a doppia distillazione e trasferirli in una cremagliera pulita e asciutta. Disporre i vetrini al microscopio forati e non forati in un rack di diapositive. In un grande cilindro graduato, preparare la soluzione di funzionalizzazione mescolando 475 mL di etanolo (EtOH) con 25 mL di ddH2O, 10 g di reagente silanizing (N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxyramiayde) e 1 mL di acido acetico. Mescolare bene fino a quando omogeneo poi trasferire in un contenitore adatto e chiuso. Posizionare il rack caricato nel contenitore, chiudere il coperchio e lasciare che il contenitore sbolleggia delicatamente su uno shaker orbitale per 4 ore a temperatura ambiente. Dopo 4 h, scartare la soluzione di funzionalizzazione e sostituire con 500 mL di soluzione di lavaggio, costituita da 475 mL di EtOH, 25 mL di ddH2O e 1 mL di acido acetico. Agitare lentamente per 20 min a temperatura ambiente, quindi scartare e sostituire con 500 mL di soluzione di lavaggio fresco. Dopo altri 20 min a temperatura ambiente, scartare la soluzione, asciugare i vetrini con un flusso di argon e curarli in un forno a vuoto preriscaldato a 120 gradi centigradi. Dopo 2 h, spegnere il forno e la pompa a vuoto, ma lasciare i vetrini sotto pressione ridotta durante la notte. Quindi, riportare il forno alla pressione atmosferica e conservare i vetrini in un desiccatore fino a ulteriore utilizzo. 3. Preparazione di reagenti e reattori di sintesi Portare le polveri di fosforamidite (Figura 1) dalla loro temperatura di conservazione (-25 o -45 ) a temperatura ambiente in un desiccatore. Quando i fosforamidi hanno raggiunto la temperatura ambiente, sciogliere la polvere con un volume di acetonitrile ultra-secco (<30 ppm H2O) al fine di raggiungere la concentrazione di 30 mM per DNA standard e fosforamidites di RNA, e 50 mM per il monomero dT sensibile alla base ( preparazione della biblioteca). Aggiungere un piccolo sacchetto di setacci molecolari per intrappolare qualsiasi traccia di umidità. Preparare una soluzione di 1% (w/w) imidazolo in DMSO sciogliendo 11 g di imidazolo in 1 L di DMSO secco. Agitare bene fino a completa dissoluzione. Fissare la soluzione al porto ausiliario del sintetizzatore del DNA. Questo sarà il solvente di esposizione necessario per la rimozione completa del gruppo di protezione da 5 foto. Per la sintesi delle librerie, preparate una soluzione dell’1% (w/v) di carotene in diclorometano sciogliendo 100 mg di carotene in 10 mL di diclorometao. Agitare bene in una bottiglia di vetro ambrato poi avvolgere in foglio di alluminio. 4. Preparazione e monitoraggio della sintesi di microarray. Registrare la temperatura e l’umidità nella sala di fabbricazione del microarray e assicurarsi che il sintetizzatore del DNA sia sotto sufficiente pressione di elio. Accendere il LED UV e la sua ventola di raffreddamento. Fissare un misuratore di intensità UV sul piano focale della luce UV in ingresso e accenderlo (Figura 3A). Nel computer avviare il software del controller dei file jobfile/micromirror/synthesis (denominato WiCell). Accendere quindi inizializzare il dispositivo micromirror e caricare un file maschera tutto bianco facendo clic con il pulsante destro del mouse su DMD, quindi selezionando Carica immagine. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull’icona UVS e selezionare UV Shutter Open. Leggere il valore di potenza (in mW/cm2) sul misuratore di intensità e contare 60 s. Dopo 60 s, leggere di nuovo il valore di potenza e annotare i valori di inizio e fine. Chiudere l’otturatore selezionando Chiudi otturatore UV e disattivare il misuratore di intensità. Calcolare il valore medio di intensità UV in mW/cm2. Calcolare il tempo di esposizione necessario per raggiungere un’energia radiante di 6 J/cm2 per fotodeprotection 5′-NPPOC (microarray di DNA e RNA) e 3 J/cm2 per la fotodeprotection 5′-BzNPPOC (librerie di DNA), semplicemente seguendo la relazione. Nel software DNA Synthesizer Workstation, creare un file di sequenza nell’Editor sequenza copiando e incollando il contenuto della sequenza di flusso generata da MatLab. Aggiungere altri due gradini di lavaggio all’estremità 3′ (lettera ciclo di default: “s”) per lavare la superficie dei substrati prima di passare al primo accoppiamento. Salvare ed esportare il file di sequenza. Nell’Editor protocollo del software Workstation, creare un protocollo che contenga un ciclo dedicato denominato dopo ciascuna delle lettere e dei numeri presenti nel file di sequenza (ad esempio, se un file di sequenza contiene solo lettere A, C, G e T, il file di protocollo deve quattro cicli, denominati A, C, G e T). Impostare il tempo di accoppiamento per i fosforamiditi del DNA (cicli A, C, G e T) a 15 s, a 120 s per rU phosphoramidite (ciclo 8) e a 300 s per rA, rC e rG fosphoramiramidites (cicli 5, 6 e 7). Per la preparazione della libreria, impostare l’accoppiamento del monomero dT sensibile alla base su 2 x 120 s (Tabella 1 e Tabella 2). Assicurarsi che il tempo di attesa tra due eventi di comunicazione Evento 2 Out in ogni ciclo corrisponda al tempo di esposizione UV calcolato per raggiungere l’energia radiante necessaria. Per quanto riguarda il file di sequenza, salvare ed esportare il file di protocollo. Nel software WiCell, caricare i file di processo, sequenza e protocollo nelle rispettive sottofinestre, quindi fare clic su Invia per inviare i file di sequenza e di protocollo al sintetizzatore DNA. Nel file di sequenza, contare il numero di accoppiamenti per ogni fosforamite. Per misurare il volume richiesto (in zL) della soluzione fosforramidite necessaria per eseguire ogni sintesi, moltiplicare il numero di accoppiamenti per 60. Aggiungere 250 L ad ogni volume per la sicurezza e l’innesco della linea sul sintetizzatore del DNA. Utilizzare un volume di base di 250 gradi per i fosforamiditi che richiedono un solo accoppiamento. Trasferire rapidamente la soluzione nelle fiale sul sintetizzatore del DNA corrispondente alla lettera/numero della porta nei cicli del protocollo. Prime le porte con le soluzioni fosforamidite con 10 impulsi primi ciascuno al fine di riempire le linee con reagente. Prima della linea di lavaggio dell’acetonitrile prima di attaccare la cella di reazione. Per assemblare la cella di sintesi, posizionare prima una spessa guarnizione perfluoroelastomer (FFKM) sul blocco di quarzo della cellula. Posizionare un vetrino a microscopio forato e funzionalizzato sopra la prima guarnizione e verificare che i fori sui vetrini si connettano con il tubo di inserimento e presa della cella di sintesi. Posizionare una seconda guarnizione in politetrafluoreetilene (PTFE) sottile (50 m) sul vetrino forato, che circonda i due fori. Infine, posizionare un secondo vetrino non funzionalato ma non forato in cima alla seconda guarnizione (Figura 3B). Posizionare un telaio metallico a 4 viti sopra la cella a doppio substrato assemblato e stringere la vite alla stessa forza di bloccaggio (0,45 Nm) utilizzando un cacciavite a coppia. Attaccare il tubo di uscita e presa al sintetizzatore del DNA. Prime la linea di lavaggio acetonitrile e verificare il corretto flusso di acetonitrile (ACN) attraverso i substrati. Smontare e rimontare la cella se è possibile osservare qualsiasi perdita di ACN in questa fase. Misurare il volume di ACN sulla linea di scarto dopo aver attraversato 7 cicli di innesco ACN. Questo volume deve essere di 2 mL. Attaccare la cella di sintesi sul piano focale della luce UV in entrata. Nel caso di preparazione della biblioteca, attaccare una linea di ritocco e uscita supplementare sul retro della cella e riempire la camera posteriore con la soluzione di carotene (2 mL di soluzione è sufficiente). Assicurarsi che non vi siano perdite (Figura 3C). Avviare la sintesi facendo prima clic su Esegui nel software WiCell. Al primo comando WAIT nel file di lavoro, premere Start sul sintetizzatore DEL DNA. Durante la sintesi, verificare regolarmente che la visualizzazione dei file di maschera coincida con l’esposizione ai raggi UV e l’apertura dell’otturatore. Dopo la sintesi di microarray regolari, scollegare la cella dal sintetizzatore, smontare la cella e utilizzare una penna a diamante per incidere il numero di sintesi sui vetrini di vetro. Incidere il numero sulla faccia non sintetizzata di ogni diapositiva. Trasferire i vetrini in tubi di centrifuga 50 mL e conservarli in un’area desiccata fino a ulteriore utilizzo. Dopo la sintesi di microarray di biblioteca, prima scolare la soluzione di carotene z fuori dalla camera quindi lavarla scorrendo 2 x 5 mL di CH2Cl2, quindi scolare. Procedere con lo smontaggio al punto 4.21. L’array sintetizzato può essere visibile ad occhio nudo (Figura 4). 5. Deprotection microarray del DNA Riempire un barattolo di vetro colorato con 20 mL di EtOH e 20 mL di etilenedia (EDA). Posizionare i microarray solo DNA verticalmente nel barattolo, chiudere il coperchio e lasciare che i vetrini deprocino per 2 ore a temperatura ambiente.SOPE: L’EDA è un liquido acutamente tossico, corrosivo e infiammabile. Lavorare con i guanti in una cappa di fumi ben ventilata. Dopo 2 h, recuperare i vetrini con una pinzetta e risciacquarli accuratamente con la doppia distillazione H2O. Asciugare i vetrini in una centrifuga microarray per alcuni secondi, quindi conservarli in un desiccatore. 6. Deprotection microarray di RNA In un tubo di centrifugazione da 50 mL, preparare una soluzione asciutta di 2:3 triethylamine/ACN (20 mL e 30 mL di ciascuno, rispettivamente). Trasferire uno scivolo a microarray di RNA nel tubo di centrifuga, chiudere il coperchio e avvolgere con pellicola di sigillazione in plastica. Scuotere delicatamente il tubo di centrifuga su uno shaker orbitale per 1h e 30 min a temperatura ambiente. Dopo 1h e 30 min, rimuovere il viscivolo, lavare con 2 x 20 mL secco ACN quindi asciugare in una centrifuga microarray per alcuni secondi.AVVISO: La trietilamina è un liquido acutamente tossico, corrosivo e infiammabile. L’acetonitricolo è tossico e infiammabile. Lavorare con i guanti in una cappa di fumi ben ventilata.NOTA: primo passaggio di deprotezione completato. Preparare una soluzione di idrato di idzina da 0,5 m in 3:2 acido piridina/acetico. In primo luogo, mescolare 20 mL di acido acetico e 30 mL di piridina in un cilindro graduato. Attendere che la soluzione si raffreddi prima di aggiungere 1,21 mL di idrato di iddrina. Trasferire circa 40 mL della soluzione risultante in un tubo di centrifuga di 50 mL.AVVISO: L’idrato di idricciosi è un liquido acutamente tossico e corrosivo. La piridina è altamente infiammabile e acutamente tossica. L’acido acetico è infiammabile e corrosivo. Lavorare con i guanti in una cappa di fumi ben ventilata. Dopo il primo passaggio di deprotection, trasferire lo scivolo RNA nella soluzione di idrato di idzina, chiudere il coperchio e avvolgere con pellicola di sigillazione in plastica. Scuotere delicatamente il tubo su uno shaker orbitale per 2 h a temperatura ambiente. Dopo 2 h, rimuovere il vetrino, lavare con 2 x 20 mL di ACN secco e asciugare in una centrifuga microarray per alcuni secondi.NOTA: secondo passaggio di deprotection completato. Se il microarray di RNA contiene anche nucleotidi di DNA, procedere con un terzo passo di deprotezione. In un tubo di centrifuga di 50 mL, mescolare 20 mL di EDA con 20 mL di EtOH. Aggiungere il microarray DNA/RNA alla soluzione 1:1 EDA/EtOH e lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Dopo 5 min, rimuovere il vetrino, lavare con 2 x 20 mL di acqua sterile poi asciugare in una centrifuga microarray e conservare in un desiccatore. 7. Ibridazione con un filo complementare con etichettatura fluorescente Scongelato albumina siero bovina (10 mg/mL) e il filamento complementare etichettato Cy3 (100 nM) e riscaldare a temperatura ambiente. In un tubo di microcentrifuga sterile da 1,5 ml, mescolare 150 – L di 2x buffer MES (200 mM 2-(N-morpholino)acido etanonico; 1,8 M NaCl; 40 mM EDTA; 0.02% Tween-20) con 26,7 -L di DNA con etichetta tura Cy3, 13,4 l di acetilla BSA e 110 L di sterileH. Vortice. Raddoppiare il volume se entrambe le diapositive devono essere utilizzate per l’ibridazione. Preriscaldare un forno di ibridazione a una temperatura inferiore al Tm del duplex ma abbastanza alto da garantire una buona discriminazione tra sequenze full-match e non corrispondenti. Per il controllo della qualità 25mer, impostarela temperatura a 42 gradi centigradi (Tm di 59 gradi centigradi). Posizionare con attenzione una camera di ibridazione autoadesiva 300 -l sull’area di sintesi su ogni vetrino e tubo nella soluzione di ibridazione preparata sopra. Coprire i fori della camera con punti adesivi e avvolgere l’intero vetrino in un foglio di alluminio. Posizionare il microarray nel forno di ibridazione, coprire e lasciare ruotare delicatamente alla temperatura di ibridazione selezionata per 2 h. Dopo 2 h, staccare lo scivolo, rimuovere il foglio di alluminio e strappare con attenzione la camera di ibridazione. Trasferire i vetrini in un tubo di centrifuga contenente 30 mL di buffer di lavaggio non stringente (NSWB; 0,9 M NaCl, 0,06 M fosfato, 6 mM EDTA, 0.01% Tween20, pH 7.4) e agitare vigorosamente per 2 min a temperatura ambiente. Trasferire la diapositiva in un tubo di centrifuga contenente 30 mL di Cordent Wash Buffer (SWB; 100 mM MES, 0.1 M NaCl, 0.01% Tween20) e agitare vigorosamente per 1 min. Infine, trasferire il vetrino in un tubo di centrifuga contenente 30 mL di Final Wash Buffer (FWB; 0.1x citrato saline di sodio) e agitare per alcuni secondi. Asciugare il vetrino in una centrifuga microarray. Posizionare il microarray secco, area di sintesi rivolta verso il basso, nel supporto scorrevole dello scanner microarray. Per i duplex con etichetta tura 3, eseguire la scansione a risoluzione 5 m con una lunghezza d’onda di eccitazione di 532 nm, un filtro da 575 nm e un fotomoltiplicatore di 350. Salvare la scansione ad alta risoluzione come file di immagine tif (Figura 5A). 8. Estrazione e analisi dei dati Prima dell’estrazione dei dati, ruotare la scansione dell’array salvata in un editor di immagini in modo da posizionare la catena più lunga di funzioni fiduciarie nell’angolo in alto a sinistra della scansione. Salvare l’immagine ruotata. Avviare NimbleScan, quindi premere File Aprire e caricare la scansione dell’array. Quindi, facendo clic su Sfoglia nella sottosezione Progetta file, caricare il file . ndf file di progettazione che è stato generato automaticamente durante la progettazione dell’esperimento microarray. Quindi fare clic su Apri. In Visualizza, fare clic su Contrastoautomatico/Luminosità . Fare clic sull’icona Allinea manualmente sopra la scansione. Posiziona quattro indicatori a forma quadrata ai quattro angoli della scansione, quindi fai di nuovo clic sull’icona verde ora. Estrarre i dati di ibridazione facendo clic su Analisi, Report e quindi Report probe. Aprire il file . sondare il file di report in un editor di fogli di calcolo. Mantenere le colonne B e I e scartare il resto prima di procedere con il calcolo dei valori medi e della deviazione standard dai dati estratti (Figura 5B). 9. Deprotezione biblioteca, scissione e recupero Per deproteggere e fendere le librerie di DNA, preparare una soluzione di 1:1 EDA/toluene secco in un tubo di centrifugadi da 50 mL. Immergere lo scivolo nella soluzione di scissione, chiudere lo scivolo e avvolgere con pellicola di sigillazione in plastica, quindi ruotare delicatamente in uno shaker orbitale per 2 h a temperatura ambiente. Dopo 2 h, togliere il vetrino e lavare con 2 x 20 mL di Scrupolosamente asciutto ACN. Rimuovere il vetrino e lasciarlo asciugare all’aria. Con una pipetta, applicare 100 L di sterile H2O sull’area di sintesi ormai distinguibile. Convogliare la soluzione su e giù un paio di volte prima di trasferirla in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Ripetere il processo e combinare il microarray eluato nello stesso tubo (Figura 6). Evaporare il 2 x 100 l di chip eluare a secco poi risciogliersiin 10 . Dissala recellare la biblioteca del DNA su una punta di pipetta da 10 luna dotata di resina C18. In primo luogo, trasformare il chip eluate in una soluzione tampone di acetato di triethylammonium (TEAA) da 0,1 M. Inumidire la resina aspirando 3 x 10 -L di H2O/ACN 1:1 ed equilibrare la resina lavandola con un buffer TEAA di 0,1 M. Legare il DNA convogliando il chip eluare 10 volte su e giù attraverso la resina. Lavare la resina con un buffer TEAA di 0,1 M, 3 x 10 L di H2O. Elutare il DNA dissalato dalla punta lavando la resina con 10 -L di H2O/ACN 1:1. Asciugare la soluzione dissalata verso il basso e riscioglierla in 10 gradi di sterile H2O. Misurare l’assorbimento su uno spettrofotometro UV-Vis (Figura 7). Evaporare la biblioteca a secco e conservare a -20 gradi centigradi fino a nuovo utilizzo.

Representative Results

ibridazione del microarray di DNA e RNALa figura 5 mostra i risultati di un analisi di ibridazione eseguita su un microarray contenente le versioni di DNA e RNA di una sequenza di 25 metri (5′-GTCATCATGAACCCTGGTC’ in forma di DNA). La scansione nella Figura 5A viene visualizzata in un formato su scala verde corrispondente allo spettro di eccitazione/emissione della fluorescenza Cy3, con intensità di fluorescenza registrata in unità arbitrarie comprese tra 0 e 65536. La progettazione dell’array segue il layout delle funzionalità 25:36 descritto nella sezione del protocollo. La scansione viene visualizzata dopo il corretto orientamento dell’array, con l’angolo in alto a sinistra popolato con la catena più lunga di caratteristiche fiduciarie. Qui, le caratteristiche fiduciarie contengono la versione DNA del 25mer e dovrebbero, in linea di principio, dare sempre un segnale di fluorescenza positiva al fine di eseguire l’allineamento della scansione e l’estrazione dei dati. Il microarray ibridato dovrebbe apparire uniformemente luminoso, con i bordi dell’area di sintesi che sono tuttavia di solito più luminosi rispetto al centro (fino al 50% più luminoso). La grande quantità di repliche di sequenza, distribuite in modo casuale in tutta l’area, riduce l’impatto degli artefatti spaziali. Qui, ogni sequenza (DNA e RNA) è stata sintetizzata in 2.000 posizioni casuali. C’è tipicamente basso rumore di fluorescenza (sfondo), <50 a.u., che porta ad un rapporto segnale/rumore nell'ordine di 200:1 a 800:1 nei saggi di ibridazione. Dopo l'estrazione dei dati, le intensità di fluorescenza vengono mediate e tracciate l'SD. C’è una significativa variabilità nei valori di fluorescenza assoluta tra gli esperimenti. Qui, mostriamo i risultati per tre sintesi indipendenti utilizzando gli stessi parametri di fabbricazione e la stessa gestione post-sintetica. Il DNA dei 25meri, quando si ibrida al suo filamento di DNA complementare con etichettatura Cy3, produrrà segnali di fluorescenza che vanno da 20.000 a 30.000, molto raramente sopra o sotto. L’RNA da 25mipiedi, quando ibridato allo stesso complemento di DNA con etichettatura Cy3, darà intensità di fluorescenza sulle caratteristiche corrispondenti che vanno da 15.000 a 20.000. Tuttavia, l’intensità di fluorescenza dei duplex RNA/DNA scenderà occasionalmente sotto 8.000, quando i corrispondenti duplex DNA/DNA fluoreranno ancora all’interno dell’intervallo di 20.000-30.000. In questi casi, i risultati per l’RNA possono essere considerati sub-ottimali. Un fallimento di sintesi o ibridazione, sia per il DNA che per l’RNA, sarà immediatamente evidente durante la scansione dall’evidente mancanza di fluorescenza. Ci sono molteplici opportunità per la sintesi dell’RNA di fallire o di avere parzialmente successo e saranno delineate nella parte di discussione. Deprotezionità biblioteca, scissione e recuperoA seconda della complessità e della densità della libreria, la forma e il contorno dell’array sintetizzato possono essere visti senza ingrandimento ma sotto una corretta illuminazione (Figura 4), con il DNA ancora in forma protetta. Dopo la deprotection con EDA/toluene, e prima dell’aggiunta di acqua per raccogliere la biblioteca scissa, l’area di sintesi contenente gli oligonucleotidi ora deprotetti può risaltare come una zona idrofila, quando il resto dello scivolo di vetro apparirà ricoperti da uno strato idrofobico torbido. L’osservazione diretta dell’area di sintesi dipende dall’area totale utilizzata per sintetizzare gli oligonucleotidi: un maggiore uso dell’area di sintesi corrisponderà a una maggiore possibilità di chiara distinzione tra regioni idrofile e idrofobiche sulla superficie. Al contrario, le librerie sintetizzate utilizzando un numero inferiore di specchi e con funzionalità più piccole potrebbero non essere immediatamente osservabili. Allo stesso modo, la quantità di DNA recuperato dopo il dealpendalismo è direttamente proporzionale all’area totale utilizzata per la sintesi. Se tutte le caratteristiche sono utilizzate per la sintesi oligonucleotide, la scissione e la procedura di recupero dovrebbero produrre tra 25 e 30 pmol di DNA. Un utilizzo del 10% dell’area di sintesi offrirà quindi solo circa 3 pmol di DNA. Figura 1 . Strutture chimiche del DNA e del fosforamiramiditos dell’RNA utilizzati nella sintesi oligonucleotide dalla fotolitografia microarray. I gruppi di protezione fotosensibili al 5′-OH sono utilizzati nella sintesi regolare di DNA e RNA microarray per scopi di ibridazione. Per la sintesi di librerie complesse di DNA, il più fotolabile benzyl-NPPOC (BzNPPOC) sono preferiti al 5′-OH, come BzNPPOC viene rimosso due volte più velocemente di NPPOC, che riduce significativamente il tempo totale di sintesi microarray. Gli oligonucleotidi di DNA per le biblioteche richiedono anche l’accoppiamento di un monomero dT scissione all’estremità 3′. Questo monomero, che svolge una funzione di succinyl ester, sarà scisso durante la deprotection, consentendo la raccolta del DNA dal microchip. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 . Esempio di maschera come file di immagine inviato al dispositivo microspecchio durante l’esposizione ai raggi UV. I pixel bianchi corrispondono a specchi che saranno inclinati nella posizione “ON”, riflettendo la luce UV sulla cella di sintesi. I pixel neri corrispondono agli specchi “OFF”, dove la luce UV verrà riflessa lontano dalla cella. I pixel bianchi consentiranno quindi l’accoppiamento della prossima fosforaramidite in arrivo sugli oligonucleotidi che si trovano nelle caratteristiche corrispondenti dei substrati di vetro. Gli oligonucleotidi sintetizzati sulle caratteristiche i cui specchi corrispondenti sono, in questo file maschera, i pixel neri rimarranno comunque inenero durante il prossimo evento di accoppiamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 . Fotografie della configurazione ottica e sintetizzazione della fotolitografia microarray. (A) Circuito ottico per l’esposizione ai raggi UV. La luce UV del LED UV viene prima omogeneizzata attraverso un tubo di luce rettangolare-trasversale, quindi riflette sui microspecchi. I microspecchi che sono stati inclinati in una posizione “OFF” rifletteranno la luce UV lontano dalla cella di sintesi, ma i microspecchi nella posizione “ON” rifletteranno la luce sulla cella di sintesi, situata sul piano focale, passando per la prima volta attraverso un relè Offner 1:1 sistema di imaging. (B) La cella di sintesi, una volta assemblata, è costituita da uno scivolo forato posto per primo sul blocco di quarzo della cellula, separato da una spessa guarnizione PTFE (non mostrata). Un secondo vetrino non forato viene quindi posizionato sopra il vetrino forato, separato da una sottile guarnizione PTFE. Un telaio metallico (non mostrato) tiene insieme l’assieme. (C). Per la preparazione della biblioteca, una volta che la cella di sintesi è attaccata al piano focale della luce UV in entrata, la camera situata tra il blocco di quarzo e il vetrino forato viene riempita con una soluzione dell’1% di carotene in CH2Cl2. A tale scopo, al blocco di quarzo è collegato un ulteriore tubo di entrata e presa e la soluzione arancione scorre dalla posizione più a destra a quella più a sinistra. Il flusso di reagenti e solventi per la sintesi è mostrato in frecce bianche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 . L’areadi sintesi è di solito visibile ad occhio nudo. Qui, una biblioteca del DNA può essere vista sulla superficie del vetro subito dopo la sintesi, con il DNA ancora in forma protetta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 . I test di ibridazione alle sequenze di DNA e RNA 25mer sintetizzato in situ su microarray. (A) Scansione della fluorescenza dell’intero microarray ibrido di DNA e RNA. Gli oligonucleotidi di DNA e RNA 25mer sono ibridati nei loro filamenti complementari etichettati con etichettatura Cy3. L’array è stato scansionato con un laser a una lunghezza d’onda di eccitazione di 532 nm, con una risoluzione di 5 m. (B) Intensità di fluorescenza (unità arbitrarie) del DNA:DNA e RNA:DNA duplex in tre esperimenti separati. I dati verde chiaro per gli oligonucleotidi RNA sintetizzati in situ possono essere considerati non ottimali, rispetto all’intensità di fluorescenza delle sequenze di DNA corrispondenti. Le barre di errore sono SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 . Rappresentazione schematica della procedura di deprotection, scissione e recupero per le librerie di DNA sintetizzate su microarray. Le sequenze di DNA vengono coltivate su un nucleoside dT clevibile sensibile alla base (mostrato nell’area ingrandita). Dopo la sintesi, la deprotezione degli oligonucleotidi del DNA (i gruppi di protezione di base sono rappresentati come sfere rosse) in EDA/toluene lascia il materiale deprotetto elettrostaticamente legato alla superficie e può quindi essere convogliato applicando una piccola quantità di acqua sull’area sintetizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 . Spettro di assorbimento rappresentativo (220 – 350 nm) di una libreria di DNA squarciata e dissalata contenente 4.000 sequenze diverse, di lunghezza 100 nt. Un totale di 940 ng di DNA è stato isolato da una sintesi a matrice singola, corrispondente a 30 pmol di DNA totale, o 15 pmol per substrato di vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1. Protocollo di ciclo rappresentativo per l’accoppiamento/ossidazione/fotodeprotezione del 5′-BzNPPOC-dA, supponendo che il fosfororamidito corrispondente sia stato caricato sulla porta “A”. Il tempo di accoppiamento (in secondi) viene visualizzato sulla linea “coppia monomera”. Il tempo di fotodeprotezione UV, qui corrispondente a un’energia radiante di 3 J/cm2 (fotochimica BzNPPOC), è calcolato come il tempo trascorso tra i due segnali di comunicazione “Evento 2 Out”. Tabella 2. Protocollo di ciclo rappresentativo per l’accoppiamento/ossidazione/fotodeprotezione di 5′-NPPOC-rA, supponendo che la corrispondente fossforramidite dell’RNA sia stata caricata sulla porta “A”. Il tempo di accoppiamento (in secondi) viene visualizzato sulla linea “coppia monomera”. Il tempo di fotodeprotezione UV, qui corrispondente a un’energia radiante di 6 J/cm2 (fotochimica NPPOC), è calcolato come il tempo trascorso tra i due segnali di comunicazione “Evento 2 Out”.

Discussion

La sintesi del DNA e dell’RNA in fase solida è il pane e il burro di ogni laboratorio di chimica dell’acido nucleico, e anche se l’aggiunta del componente fotolitografia è certamente un’operazione complessa, la fabbricazione di microarray mediata dalla luce UV è anche un processo molto affidabile . È, inoltre, l’unico metodo disponibile per la sintesi dell’RNA in situ su microarray. Tuttavia, come in qualsiasi procedura sperimentale multifase, c’è ampio spazio per l’errore umano.

Forse il passo più critico è l’accoppiamento di un fosforamidite, in quanto deve essere una reazione chimica costantemente ad alto rendimento al fine di permettersi oligonucleotidi con pochi errori sintetici. Nel nostro protocollo di sintesi di microarray, l’accoppiamento del fosforamidito è ancora più fondamentale per la qualità complessiva della sintesi poiché il processo di fabbricazione bypassa il limite e previene la purificazione degli oligonucleotidi. Per tutti i fosforamiramidi fotosensibili sono stati calcolati un accoppiamento graduale superiore al 99% per tutti i fosforamiramidi fotosensibili e i fosforamiditi dell’RNA, anche per tempi di accoppiamento molto brevi (15 s)24 ma possono occasionalmente verificarsi rendimenti di accoppiamento inferiori, in particolare nel caso di amiditi del dG. La stabilità dei fosforamiramidi solubiliti a temperatura ambiente è stata studiata in precedenza e si è dimostrata dipendere dalla natura del nucleobase, con fosfosofi di guanosina inclini a una decomposizione estesa in pochi giornie 29, 30. Ma quando vengono stoccati a -25 gradi centigradi, i fosforamiditi dG si sono sciolti in ACN come soluzione di 30 mM sono stati trovati stabili per diverse settimane. La relativa instabilità delle soluzioni di fosforamidite dG a temperatura ambiente significa tuttavia che non dovrebbero essere attaccate al sintetizzatore del DNA per diversi giorni.

Per le fosforamiramidite dell’RNA, la resa dell’accoppiamento dipende molto dalla qualità della fosforamidite (che può essere valutata con una spettroscopia NMR di 31P) e dal tempo di accoppiamento. I tempi di accoppiamento di 5 minuti per rA, rG, rC e 2 min per rU appaiono necessari. Infatti, abbiamo scoperto che accorciare il tempo di condensa a 2 min per tutti i fosforamiramidi dell’RNA ha portato a segnali di ibridazione significativamente più bassi.

Il sintetizzatore del DNA stesso, così come i reagenti e i solventi, deve certamente essere il più pulito possibile per ottenere la massima resa di sintesi oligonucleotide. Tuttavia, il materiale insolubile, i sali o le particelle, possono accumularsi nel tempo nelle linee e nei tubi del sistema di erogazione, portando ad una graduale diminuzione del consumo di reagenti e reagenti. Se una pulizia generale del sintetizzatore non risolve un volume di potenza basso, un aumento del numero di impulsi può essere una soluzione alternativa. Particolarmente utile nel caso di basso consumo di fosforamidi, la linea del protocollo di accoppiamento corrispondente al pompaggio di un mix di fosforamidite e attivatore (terza riga della sottosezione di accoppiamento nella tabella 1 e nella tabella2) può essere modificato, da 6 a 9 impulsi senza alcun effetto negativo apprezzabile sulla qualità della sintesi. Inoltre, il numero di impulsi di attivatore necessari per portare il mix amidite/attivatore nel substrato di sintesi (attualmente 6, quarta riga nella sottosezione di accoppiamento, vedi tabella 1 e tabella 2) dipende dal sintetizzatore del DNA stesso e lunghezza del tubo nella cella di sintesi. Questo numero può essere regolato dopo aver sostituito la fosforamidite con una soluzione colorata e contando il numero di impulsi necessari per spingere il mix colorato al substrato di vetro per l’accoppiamento.

Il metodo descritto nel presente documento consente alla sintesi di DNA e RNA di procedere contemporaneamente, sullo stesso microarray. Gli ibridi di DNA e RNA possono anche essere preparati senza alcuna modifica ai protocolli di fabbricazione dell’array e finché viene seguito il protocollo di deprotection in tre fasi. Tuttavia, va notato che i microarray solo RNA richiedono solo una deprotection in due fasi: una decianoethylazione prima con Et3N seguita da idrossile e deprotezione di base con idrossimina. I nucleobase di DNA sono stati trovati incompletamente deprotetti in queste condizioni, e hanno bisogno del passo aggiuntivo nell’EDA al fine di effettuare la completa rimozione dei gruppi di fenossiaceti (Pac). Questo trattamento supplementare con l’EDA è più breve (5 min) che per la deprotezione standard dei microarray di DNA31, ma è sufficiente per portarlo al completamento dopo i trattamenti di triethylamina e idzina. Inoltre, un breve tempo di reazione con EDA limita l’esposizione di un oligonucleotide di RNA completamente deprotetto alle condizioni di base.

Un vantaggio della sintesi dell’array di RNA in situ rispetto a metodi alternativi come spotting o trascrizione del DNA32,33,34 è la capacità di memorizzare il microchip RNA sintetizzato in forma protetta fino all’uso, evitando così il potenziale degrado dell’RNA. Le procedure post-sintetiche per l’RNA, d’altra parte, implicano che i materiali di consumo e i reagenti siano mantenuti sterili e che la manipolazione venga eseguita in condizioni prive di RNase. Va notato, abbiamo scoperto che l’aggiunta dell’inibitore di RNase al mix di ibridazione non produceva segnali di ibridazione più forti per le caratteristiche dell’RNA.

La sintesi di librerie di DNA su un monomero sensibile alla base è più complessa della sintesi di alcune sequenze di controllo su una superficie, e come tale è certamente più incline agli errori di progettazione. Tuttavia, supponendo che il progetto della sequenza (cioè la natura e il numero di sequenze) sia corretto, trasformando questo elenco in una raccolta di maschere di esposizione e una serie ordinata di cicli di accoppiamento rimane un processo semplice. Tuttavia, esistono importanti variazioni dalla sintesi di microarray standard e sono fondamentali per una fabbricazione di successo di una matrice di librerie ad alta densità.

In primo luogo, un monomero dT sensibile alla base viene accoppiato come il primo fosforamidite dopo la sintesi del linker. Il rendimento di accoppiamento di questo monomero (Figura 1) è risultato essere relativamente basso, per questo circa l’85%28, motivo per cui si cerca di migliorare il suo tasso di incorporazione, aumentando la sua concentrazione in ACN da 30 mM a 50 mM, o ripetendo il fase di accoppiamento: due reazioni di accoppiamento consecutive con monomeri freschi o due cicli di accoppiamento separati ma consecutivi.

Il secondo cambiamento è l’aggiunta di una soluzione di cartene nella camera posteriore della cella di sintesi, che assorbe comodamente la luce 365 nm. Si tratta di un’importante modifica della configurazione della fotolitografia in quanto impedisce alla luce UV di riflettersi sul substrato dell’array. Infatti, dopo aver attraversato il mezzo interstiziale tra i substrati, la luce UV in entrata esce attraverso lo scivolo forato e raggiunge il blocco di quarzo della cellula. Le equazioni di Fresnel prevedono che il 4% della luce UV perpendicolare rifletterà da ciascuna delle tre interfacce a valle del vetro d’aria (lato di uscita del 2nd substrate ed entrambi i lati del blocco di quarzo) e di nuovo sul substrato di sintesi, che porta all’esposizione involontaria di oligonucleotidi fotoprotetti. La diffrazione e la dispersione contribuiscono anche alla fotodeprotezione “off-target” e, quindi, all’inserimento dei nucleotidi, che influisce direttamente sul tasso di errore di sintesi, ma questi contributi sono molto più piccoli delle riflessioni e possono essere affrontati principalmente riducendo la densità di sintesi (lasciando spazi tra le caratteristiche). Abbiamo scoperto che il livello di soluzione di carotene z nella camera inferiore della cellula tende a diminuire leggermente solo durante i primi minuti di sintesi dell’array, e quindi deve essere monitorato e riadattato.

Infine, il terzo cambiamento è la soluzione di deprotection, che sostituisce EtOH per il toluene, che mantiene la libreria di DNA slittalegata legata alla superficie, presumibilmente attraverso interazioni elettrostatiche. L’applicazione di una piccola quantità di acqua all’area di sintesi dopo il lavaggio ACN consente di raccogliere comodamente la libreria. Il processo ha tuttavia successo solo se il contenuto di acqua nell’EDA e nel toluene è minimo, rendendo l’acido nucleico completamente insolubile nel cocktail di deprotezione. In alternativa, le librerie di DNA possono essere scissi dal chip utilizzando ammoniaca9,10,14,35, per poi essere ulteriormente deprotette riscaldando la soluzione di ammoniaca acquosa contenente il DNA a 55 gradi durante la notte. Il recupero delle librerie di DNA con l’ammoniaca non è tuttavia compatibile con l’RNA. Gli oligonucleotidi di RNA su un substrato cleavabile di base possono essere eluiti dalla superficie utilizzando la stessa procedura EDA/toluene descritta sopra, ma solo al penultimo stadio dopo l’Et3N e l’idzina strategia di deprotezione in due fasi28.

Strategie alternative per recuperare le piscine di oligonucleotidi da microarray senza la necessità di un trattamento di base specifico esistono, sono in linea di principio compatibili con la fotolitografia e si basano sull’uso di enzimi. Ad esempio, un singolo nucleotide deoxyuracil può essere il bersaglio della glicosillasi uracile-DNA (UDG) e ascisa dal resto della sequenza di DNA, oppure una singola unità di RNA può essere riconosciuta dagli enzimi RNase H di tipo 2 e dal legame del fosforo 5′ all’RNA scisto , rilasciando la parte23del DNA da 5′.

Ora abbiamo un metodo potente, affidabile e ad alta densità per la sintesi di DNA, RNA e microarray ibridi DNA/RNA. Questi possono non solo servire come piattaforme per l’ibridazione o l’associazione di saggi36, ma rappresentano anche un modo veloce ed economico per produrre complesse librerie di acido nucleico. Per l’archiviazione di dati digitali basati sul DNA, la fotolitografia dei microarray può diventare una potenziale soluzione al collo di bottiglia della “scrittura” (cioè alla codifica delle informazioni per sintesi). Il successo nella codifica digitale sul DNA e nell’assemblaggio genico de novo dipende dalla fedeltà della sequenza che, a livello di sintesi, si traduce nel tasso di errore. Gli errori sintetici e ottici nei nostri attuali protocolli di fabbricazione dell’array saranno discussi e riportati altrove. Parallelamente, sono in corso sforzi per aumentare ulteriormente la scala di fabbricazione e la produttività.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo scientifico austriaco (FWF concede P23797, P27275 e P30596) e dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza (Grant #PBBEP2_146174).

Materials

Slide functionalization
Acetic acid >99.8% Sigma 33209 For RNA deprotection
CNC router Stepcraft 300 CK
Ethanol absolute VWR 1.07017.2511 For deprotection and functionalization
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide Gelest SIT8189.5 Silanizing reagent
Nexterion Glass D microscope slides Schott 1095568
Polymax 1040 Heidolph Orbital shaker
Proclean 507 Ultrasonic water bath Ulsonix To clean slides after drilling
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner Sigma Z860086 To clean slides after drilling
Microarray synthesis
0.25 M dicyanoimidazole in ACN Biosolve 0004712402BS Activator
0.7 XGA DMD Texas Instruments Digital Micromirror Device
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF Sigma L860020-06 Oxidizer
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer FFKM Lower teflon gasket
2'-O-ALE RNA phosphoramidites ChemGenes
365 nm high-power UV-LED Nichia NVSU333A
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites Orgentis
5'NPPOC DNA phosphoramidites FlexGen
Acetonitrile Biosolve 0001205402BS For DNA synthesis
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma L010010 For dissolving phosphoramidites
Cleavable dT ChemGenes Base-sensitive monomer for library preparation
DMSO Biosolve 0004474701BS As exposure solvent
DNA and RNA microarray deprotection
Ethylenediamine >99.5% Sigma 3550 For deprotection
Expedite 8909 PerSeptive Biosystems DNA synthesizer
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine Sigma 225819 For RNA deprotection
Imidazole Sigma 56750
Industrial Strength lower-density PTFE tape Gasoila Thin, upper teflon gasket
Pyridine >99% Sigma P57506 For RNA deprotection
Triethylamine >99% Sigma T0886 For RNA deprotection
β-carotene Sigma C9750 For library preparation
Hybridization and scanning
20x Sodium Saline Citrate Roth 1054.1
5'Cy3-labelled complementary strand Eurogentec For duplex hybridization
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube Eppendorf
BSA (10 mg/mL) Promega R3961
EDTA molecular biology grade Promega H5031
GenePix 4100A Molecular Devices Microarray scanner
Hybridization oven Boekel Scientific 230500
MES monohydrate Sigma 69889
MES sodium Sigma M3058
NaCl >99.5% Sigma 71376
SecureSeal SA200 hybridization chamber Grace BioLabs 623503
Spectrafuge mini Labnet C1301 Microarray centrifuge
Tween-20 molecular biology grade Sigma P9416
Data extraction
Excel Microsoft For data extraction
MatLab MathWorks Microarray design
NimbleScan 2.1 Roche NimbleGen
Desalting and quantification
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Scientific
Toluene Merck
ZipTip C18 Millipore ZTC18s008 Desalting pipet tips
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References

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Lietard, J., Schaudy, E., Hölz, K., Ameur, D., Somoza, M. M. High-Density DNA and RNA microarrays – Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries. J. Vis. Exp. (150), e59936, doi:10.3791/59936 (2019).
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