الحمض النووي عالي الكثافة وmicroarrays RNA - التوليف الضوئي، والتهجين وإعداد مكتبات الأحماض النووية الكبيرة
Summary
في هذه المقالة، نقدم ونناقش التطورات الجديدة في تركيب وتطبيقات microarrays الحمض النووي ملفقة في الموقع. على وجه التحديد، نعرض كيف يمكن توسيع بروتوكولات تخليق الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي الريبي وكيف يمكن استخدام المصفوفات الدقيقة لإنشاء مكتبات الحمض النووي القابلة للاسترداد.
Abstract
التصوير الضوئي هو تقنية قوية لتركيب oligonucleotides الحمض النووي على الشرائح الزجاجية، كما أنه يجمع بين كفاءة تفاعلات اقتران الفوسفوراميديت مع دقة وكثافة ضوء الأشعة فوق البنفسجية تنعكس من المرايا ميكرومتر الحجم. ينتج التصوير الضوئي للتصوير الضوئي مصفوفات دقيقة يمكن أن تستوعب من مئات الآلاف تصل إلى عدة ملايين من تسلسلات الحمض النووي المختلفة، 100-nt أو أكثر، في غضون ساعات قليلة فقط. مع هذا الفضاء تسلسل كبير جدا، microarrays هي منصات مثالية لاستكشاف آليات الحمض النووي · ligand التفاعلات، والتي هي ذات صلة خاصة في حالة RNA. أبلغنا مؤخرا عن إعداد مجموعة جديدة من الفوسفوراميدات RNA متوافقة مع التصوير الضوئي في الموقع والتي استخدمت في وقت لاحق لزراعة OLIgonucleotides RNA، homopolymers وكذلك تسلسل قاعدة مختلطة. هنا، نوضح بالتفصيل عملية تصنيع الصفيف الصغير RNA، من التصميم التجريبي، إلى الإعداد الآلي، وتوليف الصفيف، وإزالة الحماية، والمسح النهائي للتهجين باستخدام تسلسل قالب 25mer يحتوي على جميع القواعد الأربعة كمثال. وفي موازاة ذلك، نتجاوز التجارب القائمة على التهجين ونستغل التصوير الضوئي للصفيف اتّبأ كبوابة غير مكلفة إلى مكتبات الأحماض النووية المعقدة. وللقيام بذلك، يتم تصنيع رغائف الحمض النووي الدقيقة عالية الكثافة على مونومر حساس للقاعدة يسمح للحمض النووي أن يكون مُقَبَّلًا بشكل ملائم ويتم استرداده بعد التوليف وإزالة الحماية. يتم تحسين بروتوكول التصنيع بحيث يحد من عدد الأخطاء الاصطناعية ولهذا الغرض، يتم إدخال طبقة من محلول β-carotene لامتصاص فوتونات الأشعة فوق البنفسجية التي قد تعكس خلاف ذلك مرة أخرى على ركائز التوليف. ونحن نصف بطريقة تدريجية العملية الكاملة لإعداد المكتبة، من التصميم إلى الانقسام والقياس الكمي.
Introduction
الاستخدام العملي للصفائف الدقيقة الحمض النووي كان تقليديا في دراسة الاختلافات في مستويات التعبير الجيني بين اثنين من السكان الخلايا، وذلك باستخدام خيوط تكميلية والفلورة كوسيلة الكشف1. في بعض الأحيان، وmicroarrays الحمض النووي المغامرة في أحداث ملزمة مع الأربطة حمض غير النووية، مثل البروتينات، مع استراتيجية من التحول تسلسل منهجي الذي يقدم نظرة شاملة على المناظر الطبيعية ملزمة2،3، 4،5. ويحول هذا النهج بشكل فعال النُصائف الصغرى من مجرد أسطح التهجين إلى منصات ذات نطاق واسع من التغطية، وهو ما سيكون رصيداً لدراسة العالم الأكثر ثراءً وتعقيداً لهيكل ووظيفة الحمض النووي الريبي. بدعم من تفاعل اقتران الفوسفوراميدات كفاءة للغاية6، يمكن الآن في الموقع صفائف الحمض النووي توليفها أن ينظر إليها الآن كمصدر رخيص للحمض النووي7، والتي أصبحت ذات أهمية خاصة بالنظر إلى الطلب المتزايد باستمرار على المواد الحمض النووي لتجميع الجينات8،9، الهياكل النانوية المستندة إلى الحمض النووي10، تخزين المعلومات أو تسلسل11،12. وبالمثل، من المرجح أن تستفيد تكنولوجيات التسلسل من تطوير الأساليب التي تسفر عن خليط معقد جدا من الحمض النووي الريبي oligonucleotides13. وفي هذا السياق، فإن بروتوكولات تصنيع الصفيف اتّبع القلة في الموقع وبكثافة عالية تكون في وضع مثالي لتلبية احتياجات مجال التكنولوجيا الأحيائية للحمض النووي الذي يتوسع بسرعة. ومع ذلك، مع مجال متنوع مثل التكنولوجيا الحيوية، قد يتطلب الغرض من كل تطبيق أن يتم إنتاج الحمض النووي على microarray إما في الإنتاجية العالية أو مع كمية منخفضة جدا من الأخطاء الاصطناعية14،15،أو كليهما، مما يتطلب نظرة فاحصة على بروتوكولات التوليف من microarrays الحمض النووي التي، تاريخيا، وقد تم الأمثل في المقام الأول لاختبارات التهجين. وفي الوقت نفسه، تم العثور على التوليف في الموقع من microarrays RNA أن يكون مسعى تحديا، مع معظم الصعوبة المرتبطة مجموعة حماية ل2′-OH وظيفة، وعادة ما moiety سيليل في توليف المرحلة الصلبة القياسية التي تتم إزالتها مع الكواشف القائمة على الفلور، والمواد الكيميائية التي تتعارض مع الأسطح الزجاجية أو السيليكون. وكانت تلك القضايا والتحديات في الحمض النووي والحمض النووي الريبي التوليف microarray في الآونة الأخيرة موضوع مجموعة كبيرة من العمل، ولا سيما مع نهج التصوير الضوئي16.
يستخدم التصوير الضوئي الضوء فوق البنفسجية لإلغاء حظر oligonucleotides قبل اقتران ويتطلب أقنعة لبناء نمط من التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وبالتالي تنظيم مكانيا والسيطرة على نمو oligonucleotides. وقد تم استبدال الأقنعة المادية بمرايا صغيرة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر والتي يعكس إمالة انتقائيضوء الأشعة فوق البنفسجية على الركيزة microarray17،18،19. كمصدر للأشعة فوق البنفسجية، ونحن نستخدم 365 نانومتر ضوء من مصدر LED عالية الطاقة20. وقد تم تجهيز الإعدادات الضوئية الحالية مع صفائف micromirror تحتوي على 1024 × 768 المرايا، المقابلة لأكثر من 780،000 البقعالقابلة للعنونة بشكل فردي (“الميزات”) على مساحة صغيرة من 1.4 سم فقط 2، أو 1080p مع صفائف من 1920 × 1080، أو > 2 مليون مرآة. كل من المرايا في الجهاز وبالتالي لديها سيطرة مباشرة على تسلسل نمت على الميزة المقابلة. باستثناء الأشعة فوق البنفسجية، وظائف التصوير الضوئي مثل تقنية التوليف في المرحلة الصلبة ويعتمد كيمياء الفوسفوراميديت القائمة على دورة. فقط هو يتطلّب تماما مختلفة حماية إستراتيجية ل [رنا] تأليف أن ينجح. قمنا بتطوير سلسلة جديدة من الفوسفوراميدات الحمض النووي الريبي الحساسة للضوء تحمل هيدرازين-لابيل حماية المجموعات21. تسمح هذه المونومرات بإزالة حماية الحمض النووي الريبي في ظل ظروف خفيفة لا تؤثر على سلامة السطح. وتستخدم الخطوة الأولى لإزالة الحماية ثلاثي إيثيلامين لإزالة مجموعات حماية الفوسفوديستر السيانوإيثيلي، في حين يستخدم الهيدرازين في خطوة ثانية منفصلة لإزالة تلك التي في وظائف الأمين 2′-OH وexocyclic. في القيام بذلك، RNA oligonucleotides ~ 30-nt في الطول وأي تسلسل يمكن الآن توليفها في الموقع على microarrays22،23. وبالتوازي مع ذلك، بدأنا مؤخرا ً في معالجة مسائل الإنتاجية والجودة والسرعة في التصوير الضوئي للحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي. قمنا بقياس كفاءة اقتران > 99٪ لجميع الحمضالنووي وRNA أميديتس (الشكل 1) وبحثت في كل خطوة فردية في دورة استطالة oligonucleotide، من وقت الأكسدة، إلى اختيار المنشط والتعرض الأمثل للأشعة فوق البنفسجية24 , 25.لقد جلبنا في جديدة حساسة للضوء 5 ‘حماية المجموعات التي يمكن إزالتها في ثوان فقط، وتحويل توليف مئات الآلاف من 100mers إلى عملية بضع ساعات طويلة26. كما ضاعفنا الإنتاجية من تصنيع مجموعة من خلال فضح اثنين من ركائز في وقت واحد27. وأخيرا، قدمنا الفوسفوراميديت dT التي تحتوي على قاعدة حساسة مجموعة succinyl كوسيلة مريحة لشق وجمع وتحليل الحمض النووي وoligonucleotides الحمض النووي الريبي، وهو أمر أساسي لإعداد المكتبة28.
على الرغم من الجانب الدنيوي نسبيا من الحمض النووي والحمض النووي الريبي توليف المرحلة الصلبة، وخاصة بالنسبة للكيميائيين حمض النووية، وmicroarray photolithography لا يزال ترقية غير تافهة تتطلب إعداد معقدة، ومراقبة دقيقة والإشراف على العملية، و تعليمات منفصلة للتعامل بعد الاصطناعية اعتمادا على طبيعة oligonucleotide ونوع التطبيق. في هذه المقالة، نود أن نقدم عرضا مفصلا لكامل الإجراء خطوة بخطوة من التوليف في الموقع من الحمض النووي والحمض النووي الريبي microarrays عن طريق التصوير الضوئي، من التصميم التجريبي لتحليل البيانات، مع التركيز على إعداد الأدوات و المواد الاستهلاكيه. ثم نقوم بوصف أساليب إزالة الحماية بعد التركيبية التي تتوافق مع الغرض المقصود من تصنيع المصفوفة الدقيقة (أي إما التهجين أو استعادة مكتبات الأحماض النووية).
Protocol
Representative Results
Discussion
تركيب الحمض النووي والحمض النووي الريبي في المرحلة الصلبة هو الخبز والزبدة من كل مختبر كيمياء حمض نووي، وعلى الرغم من أن إضافة مكون التصوير الضوئي هو عملية معقدة باعتراف الجميع، تصنيع microarray بوساطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية هو أيضا عملية موثوقة جدا . وهو، بالإضافة إلى ذلك، الطريقة الوحيدة المتاحة لتوليف الحمض النووي الريبي في الموقع على المصفوفات الدقيقة. ومع ذلك، وكما هو الحال في أي إجراء تجريبي متعدد المراحل، هناك مجال واسع للخطأ البشري.
ربما الخطوة الأكثر أهمية هي اقتران الفوسفوراميديت، كما أنه يحتاج إلى أن يكون باستمرار رد فعل كيميائي عالي الغلة من أجل تحمل oligonucleotides مع عدد قليل من الأخطاء الاصطناعية. في بروتوكول نا microarray التوليف، اقتران الفوسفوراميديت هو أكثر محورية لنوعية التوليف الشاملة منذ عملية التصنيع يتجاوز السد ويمنع تنقية oligonucleotide. وقد تم حساب كفاءة اقتران خطوة فوق 99٪ لجميع الحمض النووي الحساس ة للضوء والفوسفوراميدات الحمض النووي الريبي، حتى لأوقات اقتران قصيرة جدا (15 ق)24 ولكن انخفاض غلة اقتران يمكن أن تحدث في بعض الأحيان، لا سيما في حالة أميديات dG. وقد تم التحقيق في استقرار الفوسفوراميدات الذوبانفية في درجة حرارة الغرفة من قبل، وتبين أن تعتمد على طبيعة النيوكليوbase، مع الفوسفورالوراميدات الغوانوسين عرضة للتدهور واسعة النطاق في غضون أيام فقط29، 30. ولكن عند تخزينها في -25 درجة مئوية، تم العثور على الفوسفوراميدات dG المذاب ة في ACN كحل 30 mM لتكون مستقرة لعدة أسابيع. عدم الاستقرار النسبي لحلول الفوسفوراميديت dG في درجة حرارة الغرفة لا يعني مع ذلك أنه لا ينبغي أن تبقى تعلق على المزج الحمض النووي لعدة أيام.
بالنسبة للفسفور الريبي، يعتمد عائد الاقتران بشكل كبير على جودة الفوسفوراميديت (والتي يمكن تقييمها بواسطة مطيافية P NMR 31)ووقت الاقتران. أوقات اقتران 5 دقائق لrA، rG، rC و 2 دقيقة لrU تبدو ضرورية. في الواقع، وجدنا أن تقصير وقت التكثيف إلى 2 دقيقة لجميع الفوسفوراميدات الحمض النووي الريبي أدى إلى إشارات التهجين أقل بكثير.
المزج الحمض النووي نفسه، فضلا عن الكواشف والمذيبات، يحتاج بالتأكيد إلى أن تكون نظيفة قدر الإمكان من أجل تحقيق أعلى عائد من توليف oligonucleotide. ومع ذلك، المواد غير القابلة للذوبان، والأملاح أو الجسيمات، يمكن أن تتراكم مع مرور الوقت في خطوط وأنابيب نظام التسليم، مما يؤدي إلى انخفاض تدريجي في استهلاك الكواشف والفاعلين. حيث التنظيف العام للمركب لا يحل انخفاض حجم الإخراج، يمكن أن تكون زيادة في عدد البقول حلا بديلا. مفيدة بشكل خاص في حالة انخفاض استهلاك الفوسفوراميديت، يمكن أن يكون الخط في بروتوكول اقتران المقابلة لضخ مزيج من الفوسفوراميدات والمنشط (السطر الثالث من القسم الفرعي اقتران في الجدول 1 والجدول 2) تعديل، من 6 إلى 9 نبضات دون أي تأثير سلبي ملموس على جودة التوليف. وعلاوة على ذلك، فإن عدد نبضات المنشط اللازمة لجلب مزيج أميديت/المنشط إلى الركيزة التوليفية (حاليا6، السطر الرابع في القسم الفرعي اقتران، انظر الجدول 1 والجدول 2)يعتمد على المزج الحمض النووي نفسه وكذلك على طول الأنابيب في الخلية التوليفية. ويمكن تعديل هذا الرقم بعد استبدال الفوسفوراميديت مع محلول ملون وحساب عدد البقول اللازمة لدفع المزيج الملون إلى الركيزة الزجاجية لاقتران.
الطريقة الموصوفة هنا يسمح لتوليف الحمض النووي والحمض النووي الريبي للمضي قدما في وقت واحد، على نفس المصفوفة الدقيقة. ويمكن أيضا ً إعداد هجين اتّاس الحمض النووي والحمض النووي الريبيّ دون أي تغيير في بروتوكولات تصنيع الصفيف، وطالما تم اتباع بروتوكول إزالة الحماية الثلاثي الخطوات. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النُحِشّيات الدقيقة الحمض النووي الريبي فقط لا تتطلب سوى إزالة الحماية من خطوتين: التفكيك أولاً مع Et3N متبوعاً بالهيدروكسيل وإزالة الحماية الأساسية مع الهيدرازين. وقد تبين أن النيوكليوالقواعد النووية للحمض النووي غير محمية تماماً في ظل هذه الظروف، وتحتاج إلى خطوة إضافية في هيئة النهوض بالجماعة من أجل إحداث الإزالة الكاملة لمجموعات فينوكسياسيتيل (باك). هذا العلاج الإضافي مع EDA أقصر (5 دقائق) من لإزالة الحماية القياسية من microarrays الحمض النووي31، ولكن يكفي لدفعه إلى الانتهاء بعد العلاج ثلاثي إيثيلامين والهيدرازين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وقت رد الفعل القصير مع EDA يحد من تعرض oligonucleotide RNA غير المحمية بالكامل إلى الظروف الأساسية.
ميزة توليف مجموعة RNA في الموقع على طرق بديلة مثل اكتشاف أو نسخ الحمض النووي32،33،34 هو القدرة على تخزين رقاقة RNA توليفها في شكل محمي حتى الاستخدام ، وبالتالي تجنب خطر تدهور الحمض النووي الريبي المحتمل. الإجراءات ما بعد الاصطناعية لRNA لا، من ناحية أخرى، يعني أن المواد الاستهلاكية والكواشف يتم الاحتفاظ معقمة وأن يتم التعامل في ظل ظروف خالية من RNase. وتجدر الإشارة إلى أن إضافة مثبطRNase إلى مزيج التهجين لم تسفر عن إشارات تهجين أقوى لميزات RNA.
إن تركيب مكتبات الحمض النووي على مونومر حساس للقاعدة أكثر تعقيداً من تركيب عدد قليل من تسلسلات التحكم على السطح، وعلى هذا النحو فهو بالتأكيد أكثر عرضة لأخطاء التصميم. ومع ذلك، وعلى افتراض أن تصميم التسلسل (أي طبيعة التسلسلات وعددها) صحيح، فإن تحويل هذه القائمة إلى مجموعة من أقنعة التعرض وسلسلة مرتبة من دورات الاقتران لا يزال عملية مباشرة. ومع ذلك، توجد اختلافات هامة من توليف الصفيفات الدقيقة القياسية وهي حاسمة لنجاح تصنيع صفيف مكتبة عالي الكثافة.
أولاً، يتم الجمع بين مونومر dT الحساس ة القاعدة كأول فوسفوريميت بعد تركيب الرابط. تم العثور على العائداقتران من هذا مونومر (الشكل 1) أن تكون منخفضة نسبيا، حوالي 85٪28،وهذا هو السبب في بذل الجهود لتحسين معدل التأسيس، إما عن طريق زيادة تركيزها في ACN من 30 MM إلى 50 MM، أو عن طريق تكرار خطوة اقتران: اثنين من ردود الفعل اقتران متتالية باستخدام مونومرات جديدة، أو اثنين من دورات اقتران منفصلة ولكن متتالية.
التغيير الثاني هو إضافة محلول بيتا كاروتين في الغرفة الخلفية للخلية التوليفية، والتي تمتص مريح 365 نانومتر الضوء. هذا هو تعديل مهم من إعداد التصوير الضوئي كما أنه يمنع ضوء الأشعة فوق البنفسجية من التفكير مرة أخرى على الركيزة مجموعة. في الواقع، بعد عبور الوسط الخلالي بين الركائز، يخرج ضوء الأشعة فوق البنفسجية الواردة من خلال الشريحة حفر وتصل إلى كتلة الكوارتز من الخلية. المعادلات فريسنل توقع أن ~ 4٪ من الأشعة فوق البنفسجية الحادث عموديا سوف تعكس من كل من واجهات الهواء والزجاج المصب الثلاثة (الجانب الخروج من الركيزةالثانية وكلا الجانبين من كتلة الكوارتز) والعودة إلى الركيزة التوليف، مما يؤدي إلى التعرض غير المقصود للoligonucleotides المحمية ضوئيا. كما يسهم الانعراج والتشتت في إزالة الحماية الضوئية “خارج الهدف”، وبالتالي في إدراج النيوكليوتيد، مما يؤثر بشكل مباشر على معدل الخطأ في التوليف، ولكن هذه المساهمات أصغر بكثير من الانعكاسات ويمكن معالجتها أساساً عن طريق الحد من الكثافة التوليفية (ترك الفجوات بين الميزات). لقد وجدنا أن مستوى محلول بيتا كاروتين في الغرفة السفلى من الخلية يميل إلى الانخفاض قليلا فقط خلال الدقائق الأولى من توليف مجموعة، وبالتالي يحتاج إلى رصد هاوتعديلها.
وأخيراً، فإن التغيير الثالث هو حل إزالة الحماية، ليحل محل EtOH للتولوين، الذي يحافظ على مكتبة الحمض النووي المُلَفَلّة مرتبطة بالسطح، ويفترض أن يكون ذلك من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. تطبيق كمية صغيرة من المياه على منطقة التوليف بعد غسل ACN يسمح للمكتبة ليتم جمعها بسهولة. العملية مهما فقط ناجحة إن الماء محتوى في [إدا] و [تولوين] حدّ أدنى, يجعل ال [نوكليك سد] تماما غيرقابل للذوبان في الحماية كوكتيل. بدلا من ذلك، قد تكون مكتبات الحمض النوويمقطع قبالة رقاقة باستخدام الأمونيا 9،10،14،35،ثم مزيد من الحماية عن طريق تسخين محلول الأمونيا المائية التي تحتوي على الحمض النووي إلى 55 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إن استعادة مكتبات الحمض النووي باستخدام الأمونيا غير متوافقة مع الحمض النووي الريبي. يمكن أن يكون rna oligonucleotides على الركيزة قاعدة مقولبة من السطح باستخدام نفس الإجراء EDA / التولوين المذكورة أعلاه، ولكن فقط في المرحلة قبل الأخيرة بعد Et3N وhydrazine اثنين من خطوة استراتيجية إزالة الحماية28.
الاستراتيجيات البديلة لاستعادة برك oligonucleotide من المصفوفات الدقيقة دون الحاجة إلى علاج أساسي محدد موجودة، متوافقة من حيث المبدأ مع التصوير الضوئي وتعتمد على استخدام الإنزيمات. على سبيل المثال، يمكن أن يكون النيوكليوتيد الديوكسيأوراسيل واحد هدفا لorcil-DNA غليكوزيلاز (UDG) ومقتطعة من بقية تسلسل الحمض النووي، أو وحدة RNA واحدة يمكن التعرف عليها من قبل إنزيمات RNase H من النوع 2 ورابطة فوسفوديستر 5′ إلى RNA مقطع ، والإفراج عن جزء الحمض النووي 5 ‘23.
لدينا الآن طريقة قوية وموثوق بها وعالية الكثافة لتركيب الحمض النووي، RNA، والحمض النووي الهجين / RNA microarrays. هذه لا يمكن أن تكون فقط بمثابة منصات للتهجين أو الاختبارات ملزمة36، ولكنها تمثل أيضا وسيلة سريعة وغير مكلفة لإنتاج مكتبات الأحماض النووية المعقدة. وبالنسبة لتخزين البيانات الرقمية المستندة إلى الحمض النووي، قد يصبح التصوير الضوئي للصفيف اتّصالي ّ ة حلمحتمل لاختناق “الكتابة” (أي ترميز المعلومات عن طريق التوليف). يعتمد النجاح في الترميز الرقمي على الحمض النووي وفي تجميع الجينات دي نوفو على الإخلاص التسلسل الذي، على مستوى التوليف، يترجم إلى معدل الخطأ. سيتم مناقشة الأخطاء التركيبية والبصرية في بروتوكولات تصنيع الصفيف الحالية الخاصة بنا والإبلاغ عنها في أماكن أخرى. وبالتوازي مع ذلك، تُبذل الآن جهود لزيادة حجم التصنيع والإنتاجية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل صندوق العلوم النمساوي (منح الاتحاد من الهبات P23797 وP27275 وP30596) والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة #PBBEP2_146174).
Materials
| Slide functionalization | |||
| Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
| CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
| Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
| N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
| Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
| Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
| Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
| Microarray synthesis | |||
| 0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
| 0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
| 20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
| 250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
| 2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
| 365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
| 5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
| 5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
| Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
| Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
| DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
| DNA and RNA microarray deprotection | |||
| Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
| Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
| Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
| Imidazole | Sigma | 56750 | |
| Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
| Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
| Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
| β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
| Hybridization and scanning | |||
| 20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
| 5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
| Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
| BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
| EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
| GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
| Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
| MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
| MES sodium | Sigma | M3058 | |
| NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
| SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
| Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
| Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
| Data extraction | |||
| Excel | Microsoft | For data extraction | |
| MatLab | MathWorks | Microarray design | |
| NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
| Desalting and quantification | |||
| NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Toluene | Merck | ||
| ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |
References
- Bumgarner, R. . Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules. Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).
- Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).
- Franssen-van Hal, N. L. W., et al. Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays. Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support. Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides. Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).
- Kosuri, S., et al. Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).
- Richmond, K. E., et al. Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis. Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).
- Schmidt, T. L., et al. Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries. Nature Communications. 6, (2015).
- Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).
- Erlich, Y., Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Science. 355 (6328), 950-953 (2017).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Cleary, M. A., et al. Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis. Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).
- LeProust, E. M., et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).
- Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M., Fernández-Lucas, J. . Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. , (2018).
- Fodor, S. P. A., et al. Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. Science. 251 (4995), 767-773 (1991).
- Singh-Gasson, S., et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).
- Pease, A. C., et al. Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).
- Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).
- Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays. Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).
- Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition. Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).
- Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography. Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).
- Agbavwe, C., et al. Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays. Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).
- Sack, M., et al. Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups. Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).
- Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis. Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).
- Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression. Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).
- Lietard, J., et al. Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography. Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).
- Krotz, A. H., et al. Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).
- Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).
- McGall, G. H., et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).
- Collett, J. R., et al. Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers. Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).
- Buenrostro, J. D., et al. Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes. Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).
- Wu, C. -. H., Holden, M. T., Smith, L. M. Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).
- Tian, J., et al. Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips. Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).
- Lietard, J., et al. Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2’F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).
