アフィニティクロマトグラフィー樹脂の急速な発達のための活性化架橋アガロース - ケーススタディとしての抗体捕捉

1. トランスジェニックタバコ植物の栽培 注:DFE融合タンパク質の設計およびトランスジェニック植物の生成は、他の場所で5、17について説明されている。 トランスジェニックタバコの苗を土壌中に発芽させる。1.0 g·L-1肥料溶液。直径約0.04mに成長する際は、100mm x 100 mm x 60 mm (長さ、幅、高さ) ポットに植物を移します。 16時間の光周期(25/22°C光/暗い温度体制)で温室でトランスジェニックタバコ植物を栽培し、70%の相対湿度と1.0gで自動受精を行う·L-1肥料溶液を毎時間15分間使用します。 7週間後、植物の茎の基部にある4つのコチルドン葉を除くすべての葉を収穫する。以下に説明するように、収穫した葉を直ちに処理します。 2. 宿主細胞タンパク質の熱沈殿 ステンレス鋼の加熱容器(0.3 m x 0.3 m x 0.3 m)に20Lの作業量を持つ水浴をセットアップします。開始時に、5 L分-1の流れで液体を永久に攪拌するために水浴に磁気ポンプを置きます。温度制御のために水浴に調節可能なサーモスタットを取り付けます(ステップ2.4および2.8)。注意:2.10までの次のすべてのステップは、熱い液体の取り扱いを伴います。断熱手袋やゴーグルを含む適切な個人用保護具を着用してください。 水浴に15Lの脱イオン水を加え、液体を70°Cに加熱する。 磁気攪拌機の上に5Lの脱イオン水で満たされた10Lのバケツを置きます。リン酸ナトリウムを120mMの最終濃度に加えます。10M塩酸を使用してpHを8.14に調整します。すべての成分が溶解したら、得られた濃縮ブランチバッファ(5L)をステップ2.2から水浴に加えます。 温度が70°Cに達するまで水浴を攪拌する。必要に応じて、10 M 塩酸を使用して pH を 8.14 に調整します。必要な温度と pH に達した後、少なくとも 15 分間撹拌を続け、アセンブリ全体が熱平衡状態にあることを確認します。 20Lバケツ(0.3 m x 0.3 m x 0.3 m)を約17°Cの温度(ステップ2.9に必要)で脱イオン水で満たします。 ステップ1.3から収穫されたタバコの葉の400グラムのアリコットを準備します。穴があいたバスケットに 1 つのアリコートを置きます (0.2 m x 0.2 m x 0.2 m; 細孔幅は少なくとも 0.02 m x 0.02 m)。植物材料でバスケットを過剰に充填したり、葉をきつく詰めすぎて組織を傷つけないようにしてください。 ステップ2.4からホットブランチバッファにバスケットを完全に沈め、すべての葉が液体表面の下に残っていることを確認します。必要に応じて、表面の下に葉を保持するために、熱安定シリコーンスプーンを使用してください。 ポンプがまだ液体を攪拌している間、タバコの葉をブランチ液で1.5分間インキュベートします。インキュベーション期間中の液体温度を監視します。タバコの葉でポンプ入り込み水を塞ぐのは避けてください。 ブランチングバッファーからタバコの葉のバスケットを取り出し、30 s. 冷たい水で満たされたバケツにバスケットを移し(ステップ2.5から)、30sの葉を取り除き、残水を水から排出します。均質化の前に30sのavesを持つ(ステップ3)。 2.6から2.9までのステップを2.6から2.9に繰り返し、収穫されたバイオマス全体が処理されるまで、新鮮なアリコートを使用します。常に監視し、水浴中のブランチバッファのpHと温度を調整します。注:ブランチされた植物材料は、バイオマス全体を処理するためにいくつかのブランチサイクルが必要な場合、最大30分間氷上に保存することができます。ブランチの葉は、少なくとも3週間-80°Cで真空密封袋に保存することができます。ただし、ストレージの延長によって DFE 歩留まりが低下する可能性があるため、即時処理をお勧めします。 3. タンパク質抽出と明確化 注意:次の手順では、回転ブレードを持つブレンダーを使用します。モーターユニットに動力を与えられたり取り付けたりする場合は、ブレンダー容器で動作しないでください。 ブレンダー容器に150g(湿式質量)のタバコの葉(ステップ2.9)を入れ、抽出バッファーの450 mL(リン酸ナトリウム50m、塩化ナトリウム500m、ジズルフィットナトリウム10mM、pH 7.5)を加えます。ブレンダーキャップをしっかりと閉じて、植物材料やバッファーがこぼれないようにします。 各パルスの間に30sの休憩で、30sのための3倍のための葉を均質化する。すべての葉が均質化され、ブレンダー容器の上部に固執しないことを確認します。必要に応じて、休憩中にブレンダーを開き、きれいなシリコーンスプーンを使用して、容器の上部に付着した葉を押し下げます。 均質化後、その後の分析のためにホモジネートの1.0 mLサンプルを採取してください(ステップ7)。 適切なサイズの容器で均質を収集します(例えば、総バイオマス1.0kgで作業する場合は、少なくとも5Lの容量を持つ容器を使用してください)。すべてのブランチバイオマスが均質化されるまで、手順 3.1 ~ 3.3 を繰り返します。 袋フィルターをフィルターマウントに取り付け、アセンブリの下に別の適切なサイズの容器(3.4を参照)を配置します。均質を約0.15L分-1の割合でバッグフィルターに適用します。その後の分析(ステップ7)のために各リットルの後に袋濾過のサンプルを採取し、濁度計または類似の装置を使用して抽出バッファーの1:10希釈として袋濾過プールの濁度を測定する。 さらに、バッグ濾液プールのリットル当たりK700(上)とKS50(下)深度フィルタ層の0.02m2を用いて袋ろ過プールを明らかにする。流量3.0L分-1~m-2を最大圧力0.2MPaまで適用します。次いで、前述の5として0.2 μmの無菌フィルターを通して明確化された濾液を通過させることによって残留粒子を除去する。 4. DFEアフィニティリガンドの精製 溶出バッファー(10mMリン酸ナトリウム、300mMイミダゾール、pH 7.4)、洗浄バッファー(10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)および平衡バッファー(20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム)でフラッシングすることにより、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムを調べます。葉バイオマス1キログラム当たり約50mLのキレート架橋アガロース樹脂(約2.5L深度濾過)を含むカラムを取り付けます。 200mMの硫酸ニッケル溶液の5カラム容積(CV)を塗布してニッケルイオンでカラムを充電し、溶出バッファーの5 CVで洗浄します。50 cm h-1の流量を使用し、後続のすべてのクロマトグラフィーステップについて、260、280、558 nm の UV 信号を監視します。 平衡バッファーの 10 CV で列を平衡化します。次に、明確化された植物抽出物の50 CV(ステップ3.6から)を条件付きカラムにロードします。 10 CVの洗浄バッファーでカラムを洗います。DFE融合タンパク質を5 CV溶出バッファーで溶出し、280 nmおよび558 nmのUV信号がベースラインを超える5mAU以上に増加した後、製品含有分数を収集します。 溶離率(TSP)濃度(ステップ7.1)、DFE濃度(ステップ7.2および7.3)、およびDFE純度(ステップ7.4)を測定するために、溶離画画分から0.2 mLサンプルを採取します。 クロマトグラフィーシステム上にクロスリンクデキストラン樹脂の約50 mLを含むカラムを取り付けます。カップリングバッファーの5 CV(200 mM HEPES、500 mM塩化ナトリウム、pH 8.5)でカラムを平衡化します。バッファー交換用のDFE溶出率(ステップ4.4)の10 mLを注入し、280および558 nmで紫外線吸光度を監視します。 280 nm および 558 nm の UV 信号がベースラインより 5 mAU を超えると、DFE 含有分数を収集します。0.2 mLサンプルを採取し、TSP濃度、DFE濃度、およびDFE純度を決定します(ステップ7)。 精製されたDFEサンプル(ステップ4.7から)を遠心分離機で30分間4°Cで3,000 x gの遠心濃縮管を用いて15gL-1に濃縮します。カップリング反応を続ける(ステップ5)。注:濃度またはカップリング工程を直ちに行うことができない場合は、DFE溶液を4°Cで保存してください。 5. 活性化されたクロスリンクアガローゼ樹脂へのDFEの結合 注:カップリング用のすべての機器とソリューションの準備ができるまで、NHS活性カラムの保管に使用されるイソプロパノールを交換しないでください。カラムを乾かさせてください。 pH、バッファー組成、DFE濃度を因子として、活性樹脂へのDFEの結合を最適化する実験(DoE)モデルの設計を設定します。DoE メソッドの詳細については、他の場所15. 0.5~15gの濃度範囲でアフィニティリガンド溶液(ステップ4.8から)を調出すL-1またはDoEで定義されているように、カップリング反応が準備ができるまで氷の上に保存します(ステップ5.5)。DFEソリューションで少なくとも10個の2 mLシリンジを充填し、ベッド容積が1.0 mLのNHS活性化架橋アガロースカラムに注射器を取り付けるアダプタを準備します。 カップリングに使用される10カラムごとに、30mLの不活性化溶液(0.5Mエタノールアミン、0.5M塩化ナトリウム、pH 8.3)、低pH溶液30mL(酢酸0.1M、塩化ナトリウム0.5M、pH4.0)、10mLの貯蔵液(0.05M)を調製します。、0.1% (m/v) アジ化ナトリウム、pH 7.0) チューブに1mM塩酸の20 mLを準備し、少なくとも20分間氷の上でインキュベートし、カップリング反応中のすべてのステップのフロースルー分画を監視する精密スケールを準備します(ステップ5.7)。 密封されたNHS活性化架橋アガローズカラムを開き、カラム入り江にシリンジアダプタを取り付けます。シリンジに接続する前に、アダプターの入り江にバッファーのドロップを適用して、カラムに入る空気を防ぎます。 氷冷1 mM塩酸(ステップ5.4から)の6 mLでカラムを洗い流し、直ちにステップ5.7に進みます。 流量<1 mL min-1の流量で2 mLシリンジを使用してDFE溶液の1.5 mL(ステップ5.2)を注入し、その後の分析のために精密スケール(ステップ5.4)でフロースルー分率を収集します(ステップ7)。両端のカラムをシールし、DoEの設定に応じて22°Cで15〜45分間インキュベートします。 6 mLの不活性化溶液を注入し、続いて6 mLの低pH溶液を流量で<1 mL min-1で注入し、樹脂から非共結合リガンドを除去する。次いで6mLの不活性化溶液を注入し、カラムを15分間インキュベートする。 低pH溶液の6 mLをカラムに注入し、続いて6mLの非活性化溶液を注入する。次に、カラムに別の6mLの低pH溶液を注入する。 2 mLの貯蔵液をカラムに注入し、4°Cで保存します。 6. 明確化された植物抽出物からのmAbsの精製の試験 好ましい細胞系発現系から2F555または上清を含有する透明植物抽出物の100mLを調製し、また2F5を含有する。 平衡バッファー(20 mMリン酸ナトリウム、500m塩化ナトリウム、pH 7.4)、低pH溶出バッファー(0.05Mクエン酸塩、0.05M塩化ナトリウム、pH 4.0-3.25)、高イオン強度溶出バッファー(1.0~4.0M)を調製 クロマトグラフィーシステムをバッファでフラッシュします。クロマトグラフィーシステムにDFEアフィニティカラム(ステップ5.10から)を取り付け、流量1.0 mL min-1で5 CVの平衡バッファーで平衡化します。280 nmで紫外線吸収率を監視します。注:カラムに植物抽出物または細胞培養上清をロードすると、背圧の増加を引き起こす可能性があります。クロマトグラフィーシステムまたはDFEカラムの損傷を避けるために、高圧アラートを0.2 MPaに設定します。 明確化された植物抽出物または上清(ステップ6.1)の80mLを0.5mL min-1の流量でカラムに積み込み、2分の接触時間を保証し、2mL分のフロースルーサンプルを集めて画期的な曲線再構成を行います(ステップ7.3)。即時サンプル分析が不可能な場合は、フロースルーサンプルを4°Cに保管してください。 平衡バッファーの 6 CV でカラムを洗います。このステップの最初、中央および終わりに洗浄のサンプルを収集します。 低pH溶出バッファーまたは高イオン強度溶出バッファー(0.1 M HEPES、塩化マグネシウム1.25M、pH 8.0)の5 CVを有するElute mAb 2F5。UV 280 nm 信号がベースラインより 5 mAU に増加した場合に、DFE 分数を収集します。 各エピトープ抗体ペアの溶出バッファーを最適化します。2F5では、1.25M塩化マグネシウムが製品回収とリガンド安定性の最適なバランスを達成しました。注:塩化マグネシウム溶液は沈殿しやすい。そのため、塩化マグネシウムを約700mLの水に溶解させる。別に100 mLの水でHEPESを溶解し、pHを8.0に調整します。溶存した塩化マグネシウム溶液をHEPES溶液に加え、最終容積1.0Lに水を加えます。これは沈殿を引き起こすので、塩化マグネシウムを溶解した後にpHを調整しないでください。 ブラッドフォード法、リチウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動(LDS-PAGE)および表面プラズモン共鳴(SPR)分光法(ステップ7)を使用して、ステップ6.4〜6.6の間に採取されたすべてのサンプルを分析します。 7. サンプル分析 ブラッドフォード法18,19を用いてTSP濃度を測定する。 三量体では、各サンプルのピペット2.5 μLを96ウェルプレートの単一のウェルに入れます。0-2,000 mgの範囲をカバーする三つ三つトリケートで8つのウシ血清アルブミン(BSA)標準を使用する·L-1. 各ウェルに200 μLのブラッドフォード試薬を加え、上下にゆっくりとピペッティングして混ぜます。後続の読み出しを歪める気泡の形成を避けるために、ピペットレベルを維持します。 22 °Cで10分間プレートをインキュベートし、分光光度計で595nmで吸光度を測定します。BSA基準点を通る標準曲線に基づいてサンプル内のTSP濃度を計算します。 フッ素によるDFEの定量化 三量体では、各サンプルのピペット50 μLを黒い96ウェル半面積プレートの単一ウェルに入れます。範囲0-225 mgをカバーする6つのDsRed標準を含める·L-1. 分光光度計で530±30nm励起フィルターと590±35nm発光フィルタを使用して蛍光を2回測定します。DsRed 基準点を通る標準曲線に基づいてサンプル内の DFE 濃度を計算します。 SPR分光法20による2F5濃度を測定する。 HBS-EPランニングバッファー(10 mM 4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸(HEPES)、3mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)、150mM塩化ナトリウム、0.005%v/v Tween-20、pH 7.4を介して真空を通過するボトルトップフィルター。バッファーを15分間ドガします。 カルボキシメチル化デキストランサーフェスチップをドッキングする前に、HBS-EPランニングバッファをSPR計測器に接続し、素数機能を使用してシステムを平衡化します。流量30μL min-1の手動実行を開始し、30 mM塩酸と25mMの水酸化ナトリウム(各2回の注入)をフローセル1と2に交互に注入し、1分間30μL min-1の流量でチップ表面を調整します。 500 mg の 300 μL を準備 ·L-1タンパク質 10 mM 酢酸ナトリウム(pH 4.0)中の溶液。0.4 M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)を含むバイアルを解凍し、0.1 M NHSおよび0.1 M NHSおよび遠心分離機を1分間16,000xgで混合してから、70 μLのEDCと70μLのNHSを混合する。 EDC/NHS混合物とプロテインA溶液を7mmのプラスチックサンプルバイアルに移し、サンプルラックに入れます。流量10μL分-1の流量でEDC/NHS混合物を10分間注入することにより、カルボキシメチル化デキストランチップ表面を活性化します。 カップルタンパク質Aを活性化カルボキシメチル化デキストラン表面に、15μL分-1の流量でフローセル2上にタンパク質A溶液を15分間注入する。 プロテインAを結合しながら、1.0Mエタノールアミン塩酸塩(pH 8.5)のバイアルを解凍し、遠心分離機を1分間16,000 x gで解凍し、150 μLを7mmのプラスチックバイアルに移し、器具に入れて置きます。ステップ7.3.5が完了したら、7分間10 μL分-1の流量で流量セル1および2上にエタノールアミン溶液を注入してチップ表面を非活性化します。 30mMの塩酸と25mMの水酸化ナトリウム(各2回の注入)を流量セル1と2に交互に注入し、流量30μLmin-1を0.5分間注入してチップ表面を調整します。 500 μgの濃度でHBS-EPランニングバッファーで抗体2F5の基準を調製·HBS-EP中の2F5を含むL-1および希釈サンプルは、20〜1,000 μgの範囲の最終濃度に及ぶ·L-1.3分間30μL分-1の流量でフローセル1および2上のサンプルおよび標準を注入し、15サンプルごとに2F5標準を注入する。 各試料のフローセル2(測定セル)のシグナルからフローセル1(参照セル)の相対単位(RU)信号を引き出し、2F5標準注射のRUシグナルに基づいて抗体濃度を算出します。 すべての試料または標準注入の後、30 mM塩酸を流量30μL分-1の流量で注入してチップ表面を再生し、フローセル1および2に対して0.5分の間。 ステップ 6.4 からの各フロースルー サンプルの 2F5 濃度を、流量を通すフローに対してプロットし、2F5 ブレークスルー カーブを取得します。荷重2F5濃度の10%に達したときの注入された2F5の量を計算し、10%の動的結合能力(DBC)を得る。 LDS-PAGEでタンパク質サンプルを分析します。 すぐに使用可能な4-12%のBisTris LDSポリアクリルアミドゲルを開き、電気泳動モジュールに入れください。800 mLのランニングバッファー(50 mM MES、50 mMトリスベース、0.1%(m/v)SDS、1 mM EDTA、pH 7.3)をモジュールに転送し、0.5 mLの抗酸化溶液を追加します。 1.5 mLの反応管で、10 μLのローディングバッファーを還元剤の4μLとタンパク質サンプルの26μLと混合します。80°Cで10分間熱ブロックでチューブをインキュベートします。チューブを 500 x gで 30 s の遠心分離します。 LDSポリアクリルアミドゲル(レーンあたりサンプルの10 μL)をロードし、予め染められたタンパク質標準(10-180 kDa)の5 μLを別のレーンにロードします。 電気泳動室を閉じ、電源装置を接続します。電気泳動は40分間、定数200Vで実行する必要があります。 電気泳動室からゲルを取り出します。ゲルシースを開き、19 rpmでシェーカーで水で15分間ゲルを洗います。19 rpmでシェーカーの染色溶液で1時間ゲルを染色します。 19 rpmでシェーカーで水に1時間ゲルを汚します。フィルムスキャナを使用してゲルをスキャンします。