Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Matthias Kn&#246;dler; Clemens R&#252;hl; Patrick Opdensteinen; Johannes  F. Buyel

doi:10.3791/59933

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Biochemistry

Agarose cross-linked attivata per lo sviluppo rapido delle resine di maromtagrafia di affinità - Cattura anticorpale come caso di studio

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/59933

Matthias Knödler^1,3, Clemens Rühl², Patrick Opdensteinen^1,3, Johannes F. Buyel^1,3

¹Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ²Sanofi Deutschland GmbH, ³Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

In questa procedura, un ligando epitope a base di DsRed viene immobilizzato per produrre una resina di affinità altamente selettiva per la cattura di anticorpi monoclonali da estratti vegetali grezzi o supernatanti della coltura cellulare, in alternativa alla Proteina A.

Abstract

La purificazione degli anticorpi monoclonali (mAbs) è comunemente ottenuta dalla cromatografia di affinità Protein A, che può rappresentare fino al 25% dei costi di processo complessivi. Le misure di cattura alternative e convenienti sono quindi preziose per la produzione su scala industriale, in cui vengono prodotte grandi quantità di un singolo mAb. Qui presentiamo un metodo per l’immobilizzazione di un ligando epiteto a base di DsRed a una resina di agarose incrociata che consente la cattura selettiva dell’anticorpo che neutralizza l’HIV 2F5 da estratti vegetali grezzi senza l’uso della proteina A. L’epitopo lineare ELDKWA è stato geneticamente fuso per la proteina fluorescente DsRed e la proteina di fusione è stata espressa in tabacco transgenico (Nicotiana tabacum) prima della purificazione dalla cromatografia dell’affinità glioni-ionive immobilizzata. Inoltre, un metodo basato sull’agarose cross-linked attivato è stato ottimizzato per un’elevata densità di ligandi, accoppiamento efficiente e bassi costi. La composizione del pH e del tampone e la concentrazione di ligando solubile sono stati i parametri più importanti durante la procedura di accoppiamento, che è stata migliorata utilizzando un approccio progettuale degli esperimenti. La resina di affinità risultante è stata testata per la sua capacità di legare selettivamente il mAb target in un estratto di impianto grezzo e il buffer di eluizione è stato ottimizzato per un elevato recupero mAb, attività del prodotto e stabilità della resina di affinità. Il metodo può essere facilmente adattato ad altri anticorpi con epitopi lineari. Le nuove resine consentono condizioni di eluizione più delicate della proteina A e potrebbero anche ridurre i costi di una fase di cattura iniziale per la produzione di mAb.

Introduction

I prodotti biofarmaceutici sono importanti per il trattamento di un ampio spettro di malattie in quasi tutti i rami della medicina¹. Gli anticorpi monoclonali (mAbs) dominano il mercato biofarmaceutico, con vendite mondiali che dovrebbero raggiungere quasi 110 miliardi di dollari nel 2020². La piattaforma di espressione favorita per mAbs sono le linee cellulari dell’ovaio del criceto cinese, che in genere producono titer mAb elevati fino a 10 g di^{L -1} nella coltura supernatant³^,⁴. Tuttavia, la produzione di mAbs nelle colture cellulari dei mammiferi è costosa a causa dell’alto costo del mezzo e della necessità di una fermentazione sterile⁵. Piattaforme di espressione alternative come gli impianti offrono potenzialmente un approccio più veloce, più semplice, meno costoso e più scalabile per la produzione industriale⁶^,⁷.

Oltre ai costi associati alle colture cellulari dei mammiferi, l’uso diffuso della cromatografia dell’affinità proteica A per la cattura dei prodotti è un importante fattore di costo per la produzione industriale di mAbs. La proteina A si trova naturalmente sulla superficie delle cellule dello Staphylococcus aureus e si lega alla regione cristallizzabile (Fc) di alcuni anticorpi murini e umani, agendo così come meccanismo di difesa per eludere il sistema immunitario umorale⁸. La proteina A è diventata il gold standard del settore per la cattura di mAbs dai supernatanti della coltura cellulare ed è anche ampiamente utilizzata dalla comunità di ricerca perché è altamente selettiva, in genere raggiungendo purità mAb del 95% in un solo passaggio⁸. Non sorprende che le vendite di Protein A negli ultimi due decenni abbiano rispecchiato da vicino le vendite di mAbs⁸. A seconda della scala di produzione, i costi della proteina A possono corrispondere a più del 25% dei costi totali di processo e quindi influenzare il prezzo di mercato dei mAbs terapeutici, che può essere fino a 2.000 g^-1⁵^,⁹. Pertanto, le resine di cromatografia alternativa con prestazioni di purificazione simili hanno il potenziale di ridurre sostanzialmente i costi di produzione, rendendo accessibili terapie basate su anticorpi per un maggior numero di pazienti¹⁰^,¹¹ ^,¹². Tali alternative possono anche aggirare gli svantaggi della cromatografia proteica A, comprese le dure condizioni di elusione a basso pH (tipicamente <3.5) che possono potenzialmente causare ai mAbs di subire cambiamenti conformazionali che promuovono l'aggregazione¹³ . È importante sottolineare che la proteina A è selettiva solo per la regione Fc di alcune sottoclassi IgG, quindi le molecole non funzionali con domini di legame troncati possono co-purificare con il prodotto intatto⁵, mentre i derivati come i frammenti variabili a catena singola non si legano affatto alla proteina A.

Qui, descriviamo una resina di cromatografia di affinità alternativa per l’acquisizione del mAb 2F5 che neutralizza l’HIV utilizzando il suo epitopo lineare ELDKWA (codice aminoacido di una lettera)⁵^,¹⁴. Abbiamo geneticamente fuso l’epitopo 2F5 al capoluogo C della proteina fluorescente DsRed, che funzionava come vettore e molecola reporter, e produceva la proteina risultante DsRed-2F5-Epitope (DFE) nel tabacco transgenico ( Impianti di Nicotiana tabacum. Il DFE è stato purificato dalla cromatografia di affinità agli ioni di metallo immobilizzata in un solo passaggio (IMAC). L’immobilizzazione del ligando di affinità DFE purificato su una resina di agarose cross-linked è stata ottenuta mediante l’accoppiamento chimico utilizzando colonne di agarose ad attivazione n-idrossisuccinimide (NHS). Sono stati poi utilizzati progetti statistici sperimentali per ottimizzare la procedura di immobilizzazione e l’efficienza di accoppiamento¹⁵. La strategia di purificazione per mAb 2F5 è stata valutata in termini di purezza, resa e stabilità del ligando degli anticorpi. A differenza della proteina A, che lega la regione fc, DFE legato alla regione di determinazione della complementarità di 2F5, garantendo la purificazione delle molecole con un paratopo intatto. Il nostro concetto può essere facilmente adattato a qualsiasi mAb con un epitopo lineare o ad altri ligandi di affinità basati su peptidi che possono essere facilmente identificati da studi di microarray¹⁶.

Figura 1: Schema di flusso di processo per la preparazione di resine di affinità epitope che possono essere utilizzate per la cattura di mAbs da estratti vegetali grezzi o supernatanti di coltura cellulare. (A) L’affinità ligando DFE è stata espressa in piante di tabacco transgeniche. Una fase di precipitazione termica (B) è stata inclusa prima dell’omogeneità delle foglie raccolte (C). (D) L’estratto di pianta grezza è stato chiarito dalla filtrazione del sacchetto, dalla filtrazione della profondità e dalla filtrazione sterile di 0,2 m. (E) DFE è stato poi purificato dall’IMAC. (F, G) Il ligando di affinità DFE purificato è stato immobilizzato sulle colonne di agarose incrociate attivate dall’EDC/NHS. (H) Le colture batteriche che trasportano l’anticorpo di codifica T-DNA 2F5 sono state utilizzate per l’espressione transitoria nelle piante di N. benthamiana (I) coltivate in un fitotrone. (J) N. benthamiana foglie sono state raccolte ed elaborate come descritto in D. ( (K) mAb 2F5 è stato purificato dall’estratto chiarificato utilizzando le colonne di affinità DFE (L). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Coltivare le piante di tabacco transgenico NOT:</ Il design della proteina di fusione DFE e la generazione di piante transgeniche sono descritti altrove5,17. Germina le piantine di tabacco transgeniche nel suolo. Irrigare le piante con un 1,0 g L-1 soluzione di fertilizzante. Trasferire le piante in singoli vasi da 100 mm x 100 mm x 60 mm (lunghezza, larghezza, altezza) quando crescono fino a un diametro di 0,04 m. Coltivare le piante di tabacco transgenico in una serra con un fotoperiodo di 16 ore (regime di luce/temperatura scura 25/22 gradi centigradi), con un’umidità relativa del 70% e una fecondazione automatizzata con un regime di 1,0 g L-1 soluzione fertilizzante per 15 min ogni ora. Dopo 7 settimane, raccogliere tutte le foglie tranne le quattro foglie di cotiledon alla base del gambo vegetale. Immediatamente elaborare le foglie raccolte come descritto di seguito. 2. Precipitazione termica delle proteine delle cellule ospiti Impostare un bagno d’acqua con un volume di lavoro di 20 L in un recipiente riscaldato in acciaio inossidabile (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). All’inizio, mettere una pompa magnetica nel bagno d’acqua per agitare il liquido in modo permanente con un flusso di 5 L min-1. Montare un termostato regolabile sul bagno d’acqua per il controllo della temperatura (passaggi 2.4 e 2.8).ATTENZIONE: Tutti i seguenti passaggi fino a 2.10 comportano la movimentazione di liquido caldo. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale, tra cui guanti e occhiali termoisolanti. Aggiungere 15 L di acqua deionizzata al bagno d’acqua e riscaldare il liquido a 70 gradi centigradi. Mettere un secchio da 10 L riempito con 5 L di acqua deionizzata su un agitatore magnetico. Aggiungere il fosfato di sodio ad una concentrazione finale di 120 mM. Regolare il pH a 8,14 utilizzando 10 M di acido cloridrico. Quando tutti i componenti si sono disciolti, aggiungere il buffer di sbollentamento concentrato risultante (5 L) al bagno d’acqua dal punto 2.2. Agitare il bagno d’acqua fino a raggiungere la temperatura raggiunge i 70 gradi centigradi. Utilizzare 10 M di acido cloridrico per regolare il pH a 8,14 se necessario. Continuare ad agitare per almeno 15 nodopo aver raggiunto la temperatura e il pH richiesti per garantire che l’intero assieme sia in equilibrio termico. Preparare un secchio da 20 L (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) riempito con acqua deionizzata ad una temperatura di 17 gradi (necessaria per il passaggio 2.9). Preparare 400 g di aliquote delle foglie di tabacco raccolte dal punto 1.3. Posizionare uno in un cestello forato (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; larghezza del poro di almeno 0,02 m x 0,02 m). Evitare di riempire eccessivamente il cestello con materiale vegetale o di imballare le foglie troppo strettamente per evitare di danneggiare il tessuto. Immergere completamente il cestello nel tampone di sbiancamento caldo dal punto 2.4 e assicurarsi che tutte le foglie rimangano sotto la superficie liquida. Utilizzare un cucchiaio termostabile in silicone per tenere le foglie sotto la superficie, se necessario. Incubare le foglie di tabacco per 1,5 min nel liquido di sbiancamento mentre la pompa sta ancora agitando il liquido. Monitorare la temperatura liquida durante l’intero periodo di incubazione. Evitare di bloccare l’inseridio della pompa con foglie di tabacco. Togliere il cestello delle foglie di tabacco dal tampone di sbiancamento e scolare il tampone residuo dalle foglie per 30 s. Trasferire il cestello nel secchio riempito con acqua fredda (dal punto 2.5) e immergere le foglie per 30 s. Rimuovere il cestello e drenare l’acqua residua dal le 30 s prima dell’omogeneizzazione (passaggio 3). Ripetere i passaggi da 2,6 a 2,9 con le fresche fresche da 2,6 fino a quando viene elaborata l’intera biomassa raccolta. Monitorare e regolare costantemente il pH e la temperatura del tampone di sbiancamento nel bagno d’acqua. NOT:</ Il materiale vegetale sbiancato può essere conservato sul ghiaccio fino a 30 minuti quando sono necessari diversi cicli di sbiancamento per la trattadello dell’intera biomassa. Le foglie sbiancate possono anche essere conservate in sacchetti sottovuoto a –80 gradi centigradi per almeno 3 settimane. Tuttavia, l’elaborazione immediata è consigliata perché l’archiviazione prolungata può ridurre la resa DFE. 3. Estrazione e chiarificazione delle proteine ATTENZIONE: I seguenti passaggi coinvolgono un frullatore con lame rotanti. Non lavorare nel recipiente del frullatore quando alimentato o montato sul motore. Mettere 150 g (massa umida) di foglie di tabacco sbollentato (fase 2.9) nel recipiente del frullatore e aggiungere 450 mL di buffer di estrazione (50 mM di fosodio di sodio, 500 mM di cloruro di sodio, 10 mM disulfite di sodio, pH 7.5). Chiudere saldamente il tappo del frullatore per evitare la fuoriuscita di materiale vegetale o tampone. Omogeneizzare le foglie per 3x per 30 s, con 30 s si rompe tra ogni impulso. Assicurarsi che tutte le foglie siano omogeneizzate e che nessuna si attacchi alla parte superiore del recipiente del frullatore. Se necessario, aprire il frullatore durante le rotture e spingere verso il basso le foglie che si attaccano nella parte superiore del recipiente, utilizzando un cucchiaio di silicone pulito. Dopo l’omogeneizzazione, prendere un campione di 1,0 mL dell’omogeneo per l’analisi successiva (passaggio 7). Raccogliere l’omosinato in un recipiente di dimensioni adeguate (ad esempio, se si lavora con una biomassa totale di 1,0 kg, utilizzare un recipiente con una capacità di almeno 5 L). Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.3 fino a quando tutta la biomassa sbollentata non viene omogeneizzata. Montare un filtro borsa in un supporto filtro e posizionare un altro vaso di dimensioni adeguate (cfr. 3.4) sotto l’assieme. Applicare l’omolmina al filtro del sacchetto ad un tasso di 0,15 L min-1. Prelevare campioni del sacchetto filtrato dopo ogni litro per l’analisi successiva (passaggio 7) e misurare la torbidità della piscina filtrante borsa come una diluizione 1:10 nel buffer di estrazione utilizzando un turbidimetro o dispositivo simile. Chiarisci ulteriormente la piscina filtrante della borsa utilizzando 0,02 m2 di un K700 (in alto) e la combinazione di strato di filtro profondità KS50 (in basso) per litro di piscina filtrante borsa. Applicare una portata di 3,0 L min-1m-2 fino a una pressione massima di 0,2 MPa. Quindi rimuovere le particelle residue passando il filtrato chiarificato attraverso un filtro sterile di 0,2 m, come descritto in precedenza5. 4. Purificazione del LIgando di affinità DFE Preparare un sistema di cromatografia liquida proteica veloce lavando con tampone di eluizione (10 mM di fosfato di sodio, 300 mM di imidazole, pH 7,4), buffer di lavaggio (10 m di fosfato di sodio, pH 7,4) e buffer di equilibrio (20 mm di fosodio di sodio, 500 mM di cofaride di sodio, pH 7.4). Montare una colonna contenente 50 mL di resina agarosa incrociata incrociata per chilogrammo di biomassa fogliare (filtraggio di profondità di 2,5 L). Caricare la colonna con ioni di nichel applicando 5 volumi di colonna (CV) di soluzione di solfato di nichel da 200 mM e lavarlo con 5 CV di tampone di eluizione. Utilizzare una portata di 50 cm h-1 e monitorare i segnali UV a 260, 280 e 558 nm per tutti i passaggi di cromatografia successivi. Egli la colonna con 10 CV di equilibration buffer. Quindi caricare 50 CV dell’estratto della pianta chiarificata (dal punto 3.6) sulla colonna condizionata. Lavare la colonna con 10 CV di tampone di lavaggio. Elute la proteina di fusione DFE con 5 CV elusione tampone e raccogliere la frazione contenente il prodotto una volta che i segnali UV a 280 nm e 558 nm sono aumentati a più di 5 mAU al di sopra della linea di base. Prelevare un campione di 0,2 mL dalla frazione di eluizione per misurare la concentrazione totale di proteine solubili (TSP) (passaggio 7.1), la concentrazione DFE (passaggi 7.2 e 7.3) e la purezza DFE (passaggio 7.4). Montare una colonna contenente 50 mL di resina dextran cross-linked in un sistema di demografia. Equilibrio della colonna con 5 CV di tampone di accoppiamento (200 mHE HEPES, 500 mM di cloruro di sodio, pH 8.5). Iniettare 10 mL della frazione di eluizione DFE (passaggio 4.4) per lo scambio di tamponati e monitorare l’assorbimento UV a 280 e 558 nm. Raccogliere la frazione contenitore DFE una volta che i segnali UV a 280 nm e 558 nm sono aumentati a più di 5 mAU al di sopra della linea di base. Prendere un campione di 0,2 mL e determinare la concentrazione di TSP, la concentrazione DFE e la purezza DFE (passaggio 7). Concentrate il campione DFE purificato (dal passo 4.7) a 15 g L-1 utilizzando un tubo concentratore centrifugo a 3.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min in una centrifuga. Continuare con la reazione di accoppiamento (passaggio 5). NOT:</ Conservare la soluzione DFE a 4 gradi centigradi se le misure di concentrazione o di accoppiamento non possono essere eseguite immediatamente. 5. Accoppiamento dfE alla Resina Agarose cross-linked attivata NOT:</ Non sostituire l’isopropanolo utilizzato per lo stoccaggio delle colonne attivate da NHS fino a quando tutte le attrezzature e le soluzioni per l’accoppiamento non sono pronte. Non lasciare mai asciugare le colonne. Impostare un modello DoE (Design Of Experiments) per ottimizzare l’accoppiamento del DFE alla resina attivata, con pH, composizione del buffer e concentrazione DFE come fattori. I dettagli del metodo DoE sono descritti altrove15. Preparare la soluzione di affinità lega-ligand (dal punto 4.8) in un intervallo di concentrazione compreso tra 0,5 e 15 g L-1 o come definito nel DoE e conservarlo sul ghiaccio fino a quando la reazione di accoppiamento è pronta (passaggio 5.5). Riempire almeno dieci siringhe da 2 mL con la soluzione DFE e preparare un adattatore per montare le siringhe su colonne di agarose incrociate attivate da NHS con un volume del letto di 1,0 mL. Per ogni 10 colonne utilizzate per l’accoppiamento, preparare 30 mL di soluzione di disattivazione (0,5 M di etanolamina, 0,5 M di cloruro di sodio, pH 8,3), 30 mL di soluzione a basso pH (0,1 M di acetato di sodio, 0,5 M di cloruro di sodio, pH 4.0) e 10 mL di soluzione di stoccaggio (0,05 M didium disamini, 0,5 M di cloruro di sodio, pH 4,0) e 10 mL di soluzione di stoccaggio (0,05 M di dissodio) , 0,1% (m/v) di azide di sodio, pH 7.0). Preparare 20 mL di acido cloridrico da 1 mM in un tubo e incubarlo sul ghiaccio per almeno 20 min. Preparare una scala di precisione per monitorare le frazioni di flusso per tutti i passaggi durante la reazione di accoppiamento (passaggio 5.7). Aprire una colonna di agarose incrociata attivata da NHS sigillata e montare l’adattatore di siringa nell’inserimento della colonna. Impedire l’ingresso dell’aria nella colonna applicando una goccia di tampone sull’ingresso dell’adattatore prima di collegarla alla siringa. Lavare la colonna con 6 mL di acido cloridrico freddo ghiaccio 1 mM (dal punto 5.4) ad una portata di <1 mL min-1 e procedere immediatamente al passaggio 5.7. Iniettare 1,5 mL di soluzione DFE (passaggio 5.2) utilizzando una siringa da 2 mL a una velocità di flusso di <1 mL min-1 e raccogliere la frazione flow-through su una scala di precisione (passaggio 5.4) per l’analisi successiva (passaggio 7). Sigillare la colonna a entrambe le estremità e incubare per 15-45 min a 22 gradi centigradi, a seconda dell’impostazione DoE. Iniettare 6 mL di soluzione di disattivazione seguita da 6 mL di soluzione a basso pH a una velocità di flusso di <1 mL min-1 per rimuovere i leganti non legati in modo covalente dalla resina. Quindi iniettare 6 mL di soluzione di disattivazione e incubare la colonna per 15 min. Iniettare 6 mL di soluzione a basso pH nella colonna, seguito da 6 mL di soluzione di disattivazione. Quindi iniettare altri 6 mL di soluzione a basso pH nella colonna. Iniettare 2 mL di soluzione di stoccaggio nella colonna e conservare a 4 gradi centigradi. 6. Test della purificazione dei mAb da estratti di piante chiarificate Preparare 100 mL di estratto vegetale chiarificato contenente 2F55 o il supernatante dal sistema di espressione basato sulle cellule preferito, contenente anche 2F5. Preparare il cuscinetto per l’equilibrio (20 mm di fosfato di sodio, 500 mM di cloruro di sodio, pH 7,4), tampone di eluizione a basso pH (0,05 M citrato, 0,05 M di cloruro di sodio, pH 4,0–3,25) e buffer di elusione ad alta forza ionica (1,0–4,0 M di cloruro di magnesio, 0,1 M HEPES, pH 8,0) Svuotare il sistema di cromatografia con i buffer. Montare una colonna di affinità DFE (dal punto 5.10) sul sistema di cromatografia ed eseguire l’equilibrato con 5 CV di buffer di equilibratione a una portata di 1,0 mL min-1. Monitorare l’assorbimento UV a 280 nm. NOT:</ Il caricamento dell’estratto di pianta o del supernatant della coltura cellulare sulla colonna può causare un aumento della pressione. Impostare un avviso di alta pressione a 0,2 MPa per evitare danni al sistema di cromatografia o alla colonna DFE. Caricare 80 mL dell’estratto vegetale chiarificato o del supernatale (passaggio 6.1) sulla colonna ad una portata di 0,5 mL min-1 per garantire un tempo di contatto di 2 min. Raccogliere i campioni di flusso in 2 frazioni mL per la ricostruzione della curva di sfondamento (passaggio 7.3). Se non è possibile eseguire un’analisi immediata del campione, conservare i campioni a 4 gradi centigradi. Lavare la colonna con 6 CV di tampone di equilibratione. Raccogliere un campione del lavaggio all’inizio, al centro e alla fine di questo passaggio. Elute mAb 2F5 con 5 CV di buffer di eluizione a basso pH o buffer di eguagliazione ad alta resistenza ionica (0,1 M HEPES, 1,25 M di cloruro di magnesio, pH 8.0). Raccogliere la frazione DFE quando il segnale UV 280 nm è aumentato a 5 mAU sopra la linea di base. Ottimizzare il buffer di eluizione per ogni coppia epitopo-anticorpo. Per 2F5, 1,25 M di cloruro di magnesio ha raggiunto un equilibrio ottimale tra il recupero del prodotto e la stabilità del ligando. NOT:</ La soluzione di cloruro di magnesio è soggetta a precipitazioni. Pertanto, sciogliere il cloruro di magnesio in 700 mL di acqua. Sciogliere separatamente gli HEPES in 100 mL d’acqua e regolare il pH a 8,0. Aggiungere la soluzione di cloruro di magnesio disciolto alla soluzione HEPES e aggiungere acqua ad un volume finale di 1,0 L. Non regolare il pH dopo aver sciolto il cloruro di magnesio perché questo causerà precipitazioni. Analizzare tutti i campioni prelevati durante i passaggi 6.4–6.6 utilizzando il metodo Bradford, lithium dodecylfate lidilfato elettroforesi gel polyacrylamide (LDS-PAGE) e spettroscopia della risonanza del plasmone superficiale (passaggio 7). 7. Analisi dei campioni Misurare la concentrazione di TSP utilizzando il metodo Bradford18,19. In triplice copia, pipetta 2,5 litri di ogni campione in un unico pozzo di una piastra di 96 pozze. Utilizzare otto standard di albumina di siero bovino (BSA) in triplice copia della gamma 0–2.000 mg L-1. Aggiungere 200 l di Bradford reagente ad ogni bene e mescolare con la pipistratura delicatamente su e giù. Mantenere il livello della pipetta per evitare la formazione di bolle che distorcono la lettura successiva. Incubare la piastra per 10 min a 22 gradi centigradi e misurare l’assorbimento a 595 nm in uno spettroscopio. Calcolare la concentrazione di TSP nei campioni in base a una curva standard attraverso i punti di riferimento BSA. Quantificare il DFE mediante fluorimetria In triplice copia, pipetta 50 -L di ogni campione in singoli pozze di una piastra nera da 96 pozzetto. Includere sei standard DsRed che coprono la gamma da 0 a 225 mg L-1. Misurare la fluorescenza due volte utilizzando un filtro di eccitazione da 530 x 30 nm e un filtro di emissione da 590 x 35 nm in uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione DFE nei campioni in base a una curva standard attraverso i punti di riferimento DsRed. Misurare la concentrazione di 2F5 con spettroscopia SPR20. Preparare il buffer di corsa HBS-EP (10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulnic acid (HEPES), 3 mM ethylediamineatraacetic acid (EDTA), 150 mM di cloruro di sodio, 0,005% v/v Tween-20, pH 7.4) e filtrare sterilizzarlo passandolo attraverso un vuoto di 0,2 m filtro in bottiglia. Degas il buffer per 15 min. Collegare il buffer di corsa HBS-EP allo strumento SPR prima di agganciare un chip di superficie dextran carboxymethylated e equilibrate il sistema utilizzando la funzione prime. Avviare una corsa manuale con una portata di 30 min-1 e condizionare la superficie del truciolo iniettando alternativamente 30 mM di acido cloridrico e 25 mM di idrossido di sodio (due iniezioni ciascuna) sulle celle di flusso 1 e 2 ad una velocità di flusso di 30 min-1 per 1 min. Preparare 300 l di 500 mg L-1 Proteina Una soluzione in acetato di sodio da 10 mM (pH 4.0). Scongelare le fiale contenenti 0,4 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) di clordimide idrocloruro (EDC) e 0,1 M NHS e centrifugare a 16.000 x g per 1 min prima di mescolare 70 -L di EDC e 70 -L di NHS. Trasferire la miscela EDC/NHS e la soluzione Protein A su fiale di campione di plastica da 7 mm e metterle nel rack del campione. Attivare la superficie del chip dextran carboxymethylated iniettando la miscela EDC/NHS sulle celle a flusso 1 e 2 ad una portata di 10 -L min-1 per 10 min. Coppia di ai carichi di 15 min -1 attivati per 15 min iniettando la soluzione Protein A sulla cella di flusso 2 ad una portata di 15 -1 l -1 per 15 min. Durante l’accoppiamento della Proteina A, scongelare una fiala di idrocloruro di etanolamina da 1,0 M e centrifugare a 16.000 x g per 1 min. Una volta completato il passaggio 7.3.5, disattivare la superficie del chip iniettando la soluzione di etanolamina sulle celle a flusso 1 e 2 ad una portata di 10 -1 l-1 per 7 min. Condizionare la superficie del truciolo iniettando alternativamente 30 mm di acido cloridrico e 25 mM di idrossido di sodio (due iniezioni ciascuna) sulle celle di flusso 1 e 2 ad una portata di 30 -l-1 per 0,5 min. Preparare gli standard dell’anticorpo 2F5 nel buffer di corsa HBS-EP ad una concentrazione di 500 g Campioni di diluizione di 2F5 in HBS-EP fino a una concentrazione finale nell’intervallo 20-1.000 L-1. Iniettare campioni e standard sulle celle di flusso 1 e 2 ad una portata di 30 min-1 per 3 min. iniettare uno standard 2F5 dopo ogni 15 campioni. Sottrarre il segnale delle unità relative (RU) della cella di flusso 1 (cella di riferimento) dal segnale della cella di flusso 2 (cella di misurazione) per ogni campione e calcolare la concentrazione di anticorpi in base al segnale RU di 2F5 iniezioni standard. Dopo ogni campione o iniezione standard, rigenerare la superficie del chip iniettando 30 mM di acido cloridrico ad una portata di 30 -L min-1 per 0,5 min sulle celle di flusso 1 e 2. Tracciare la concentrazione di 2F5 per ogni campione di flusso dal passaggio 6.4 contro il flusso attraverso il volume per ottenere la curva di svolta 2F5. Calcolare la quantità di iniettato 2F5 quando è stato raggiunto il 10% della concentrazione di carico 2F5 per ottenere la capacità di rilegatura dinamica del 10% (DBC). Analizza i campioni di proteine di LDS-PAGE. Aprire un gel di poliacrilammide da 4-12% BisTris LDS pronto all’uso e posizionarlo in un modulo di elettroforesi. Trasferire 800 mL di buffer in esecuzione (50 mM MES, 50 mM Tris base, 0.1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7.3) nel modulo e aggiungere 0,5 mL di soluzione antiossidante. In un tubo di reazione di 1,5 mL, mescolare 10 l di tampone di carico con 4 : L di agente di riduzione e 26 l del campione di proteine. Incubare il tubo in un blocco di calore per 10 minuti a 80 gradi centigradi. Centrifugare il tubo a 500 x g per 30 s. Caricare il gel di poliacrilamide LDS (10 l of sample per corsia) e caricare 5 l. di proteine pre-colorato standard (10–180 kDa) in una corsia separata. Chiudere la camera di elettroforesi e collegare l’alimentazione. L’elettroforesi deve funzionare per 40 min e a costante 200 V. Rimuovere il gel dalla camera di elettroforesi. Aprire la riscosina in gel e lavare il gel per 15 min in acqua su uno shaker a 19 giri. Macchiare il gel per 1 h in soluzione di colorazione su uno shaker a 19 rpm. Destain il gel per 1 h in acqua su uno shaker a 19 giri. Eseguire la scansione del gel utilizzando uno scanner per pellicole.

Representative Results

Espressione e purificazione del ligando di affinità La proteina di fusione DFE è stata espressa in piante di tabacco transgenico coltivate in una serra. La produzione è stata di 120mg-kg -1 massa foglia con una biomassa media di 130 g per pianta. La purezza del DFE è stata pari a 97% delle proteine cellulari ospiti. La fase di sbiancamento è stata facilmente integrata nella routine di raccolta e estrazione (Figura 1) e ha richiesto meno di 2 h di tempo supplementare, compresa l’impostazione del bagno d’acqua. Il recupero complessivo del DFE è stato di 23,5 kg1 con una purezza di >90%. Le misure responsabili della perdita di prodotto sono state la sbiancamento, la filtrazione della profondità e l’IMAC, con perdite specifiche rispettivamente del 40%, 27% e 45%. La capacità del filtro di profondità era in media di 135 X 36 L m-2 ( SD, n) e quindi nell’intervallo superiore di valori riportati nella letteratura21. La resa del DFE è aumentata con l’età dell’impianto (Figura 2). Immobilizzazione del ligando di affinità sulle colonne di cromatografia attivate da NHS Durante i primi test di accoppiamento, abbiamo scoperto che il buffer HEPES (pH 8.3) ha aumentato l’efficienza di accoppiamento a 89 x 6% (-SD, n-3) rispetto al 78% del calibro 9% (SD, n.3) per il buffer di bicarbonato raccomandato dal produttore. Pertanto, HEPES è stato utilizzato per tutti i successivi esperimenti di accoppiamento. È stato scelto un approccio DoE per ottimizzare l’efficienza di accoppiamento di DFE in resina agarose cross-linked attivata da NHS. La quantità assoluta di DFE immobilizzata sulla resina aumentata con la massa di DFE iniettata nella colonna e annusata a 15 g di dollari L-1, mentre il rendimento dell’accoppiamento è diminuito continuamente con l’iniezione di un maggior numero di DFE (Figura2). Anche il rendimento dell’accoppiamento è stato del >50% inferiore in un buffer acido, indicando la necessità di verificare le condizioni di accoppiamento adeguate per ogni ligando caso per caso. Le condizioni ideali in termini di resa di accoppiamento, quantità assoluta di DFE immobilizzati e costi delle colonne sono state identificate utilizzando lo strumento di ottimizzazione numerica del software DoE. Le condizioni più desiderabili (pH 9.0 e 7.0 mg di DFE per 1 mL di resina agarose cross-linked) si trovavano su un grande altopiano ed erano quindi robuste. Le molecole DFE mantennero la loro fluorescenza rossa anche dopo l’accoppiamento, e l’intensità del colore corrispondeva alla quantità totale di DFE immobilizzato (Figura 2). Pertanto, il colore della colonna può essere utilizzato come semplice parametro di controllo qualità per stimare l’efficienza di accoppiamento e la qualità della colonna. La fluorescenza ha anche confermato che la proteina di fusione DFE assemblata nello stato tetramerico di DsRed nativo. Figura 2: Ottimizzazione dell’immobilizzazione DFE in resina agarosa incrociata attivata da NHS. (A) Gel LDS-PAA con sovrapposizione western di campioni di omogenate ed eluizione da estratti di piante DFE transgeniche non sbiancate e sbollentate. La raccolta delle piante è stata eseguita 38, 45 o 52 giorni dopo la semazione. Le macchie occidentali sono state eseguite utilizzando un anticorpo anti-I-IS65. (B) Quantità totale di legatura di affinità DFE accoppiata in dipendenza se il pH di accoppiamento e la massa complessiva di DFE purificati iniettati su colonne ad agarose incrociate attivate da NHS. I punti rossi indicano gli esperimenti effettivi eseguiti per creare il modello di superficie di risposta. (C) Colonne di affinità DFE dopo la procedura di accoppiamento. I numeri corrispondono alle condizioni di accoppiamento evidenziate nel pannello B. dps – giorni dopo il seeding. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Test dell’isolamento 2F5 utilizzando la resina di affinità DFE L’anticorpo ricombinante 2F5 è stato prodotto transitoriamente nelle piante di Nicotiana benthamiana coltivate in un fitotrone5. La cattura di 2F5 dall’estratto di pianta grezza è stata testata utilizzando colonne di affinità accoppiate con DFE purificata da 7,0 mg (passaggio 6). L’eluzione dalle resine acquisioni di proteina A di solito comporta un buffer acido (pH 3,3)13. Pertanto, inizialmente abbiamo valutato diversi buffer di eluzione a basso pH (pH 6.0–3.25) per le colonne DFE. L’eluizione di 2F5 ha avuto successo con valori di pH inferiori a 4,5 con il più alto recupero del 35% a 3,25 pH. Tuttavia, l’elusione a basso pH ha disattivato sia l’anticorpo (come confermato dalla spettrometria SPR) sia il ligando DFE (come indicato dalla perdita di colore e il DBC inferiore, Figura 3). Quest’ultimo era previsto dato che la DsRed nativa denatura a pH <4.022,23. Per evitare la denaturazione del prodotto e del ligando, abbiamo testato il cloruro di magnesio come agente di eguaglianza alternativa perché in precedenza è stato utilizzato per eluire mAbda altre resine di affinità24. Una concentrazione di cloruro di magnesio di 1,25 M era sufficiente per eluire 2F5 dalla resina di affinità DFE con un recupero del 105 x 11% (11%) e una purezza del 97 % Questa prestazione era paragonabile alle resine proteicheA 25,26. La costante di dissociazione dell’equilibrio (KD)dell’anticorpo 2F5 purificato da DFE e il ligando sintetico Fuzeon era di 791 pM, mentre quella di una controparte purificata dalle proteine A era di 763 pM5. Inoltre, non è stata osservata alcuna perdita di colore sostanziale nella resina su un totale di 25 cicli bind-and-elute. Il DBC della resina di affinità DFE al 10% 2F5 svolta è sceso linearmente nel corso di 25 cicli a ,15% del valore iniziale (Figura 3). Figura 3: Test dell’isolamento di 2F5 da estratti di piante chiarificati utilizzando le resine di affinità DFE. (A) Resine di affinità DFE dopo un ciclo di eluizione utilizzando buffer con valori di pH diversi nell’intervallo 4.0–3.0 e le stesse resine dopo una fase di neutralizzazione a pH 6.0. (B) Resine di affinità DFE dopo uno e sei cicli di purificazione 2F5 utilizzando 1,25 M o 4,00 M di cloruro di magnesio come eluente. (C) I cromatogrammi degli esperimenti di caricamento frontale (curve di rottura) per determinare la capacità di legame dinamica dipendente dal ciclo della resina DFE utilizzando il cloruro di magnesio come eluente. Le curve di spareggio sono state misurate per tamponi di elusione di cloruro di magnesio da 4,0 M e 1,25 M e vari numeri di ciclo. (D) Capacità di legatura dinamica dipendente dal ciclo di DFE utilizzando il cloruro di magnesio da 1,25 M come eluente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Applicazioni della nuova resina di affinità

Abbiamo dimostrato che le resine di cromatografia di affinità personalizzate per la cattura di mAbs possono essere prodotte immobilizzando un ligando contenente un epitopo specifico di mAb all’agarose cross-linked attivata da NHS. Per progettare una tale resina, è stato necessario conoscere la sequenza dell’epitopo e utilizzare un epitopo lineare. Le resine risultanti sono vantaggiose per la cattura di mAbs perché potrebbero potenzialmente sostituire costosi passaggi di cromatografia di affinità proteica A. L’interazione tra 2F5 e DFE nel nostro caso di studio è stata mediata dal legame epitopo-paratopo, quindi il nostro ligando dovrebbe essere più selettivo della proteina A, che si lega alla regione Fc della maggior parte degli IGM murini e umani. Poiché i singoli leganti sono necessari per ogni mAb, il nostro metodo può inizialmente sembrare adatto principalmente per gli anticorpi che vengono prodotti su larga scala. Tuttavia, combinando il nostro approccio con una rapida espressione proteica transitoria a base vegetale, i nuovi ligandi di affinità possono essere preparati in meno di 2 settimane²⁷ con il minimo sforzo²⁸. Quindi, il metodo è adatto anche per la purificazione mAb su piccola scala.

Produzione e potenziali miglioramenti del ligando di affinità

Le piante offrono una piattaforma di produzione veloce e sicura per i ligandi di affinità⁵^,²⁹^,³⁰, come la proteina di fusione DFE presente nel nostro case study. Sbiancare il materiale vegetale ha ridotto notevolmente la quantità di proteine delle cellule ospiti in un unico passaggio ed è stato facilmente integrato in una routine di chiarificazione standard. Tuttavia, il recupero del ligando è stato basso nella configurazione attuale, probabilmente a causa della sua moderata stabilità termica e di qualche legame non specifico agli strati del filtro, come riportato per altri prodotti³¹^,³²^,³³. Ingegneria del vettore per aumentare la sua stabilità termica può quindi contribuire a migliorare la resa del ligando in futuro, come descritto per il vaccino antimalarico candidato CCT, l’enzima antitumorPpADI o un glucosidase mesofilo³⁴^, ³⁵^,³⁶. Lo stesso vale per la fase di filtrazione della profondità, in cui l’ingegneria proteica può contribuire a ridurre il legame non specifico al materiale filtrante³⁷. I costi di produzione per DFE e legature simili potrebbero anche essere ridotti migliorando l’efficienza complessiva del chiarimento utilizzando flocculanti o additivi filtranti³⁸^,³⁹.

Quando DsRed viene utilizzato come vettore, forma un complesso tetramerico. Questo è vantaggioso perché aumenta il numero di epitopi per ligando, ma può anche rendere il ligando più suscettibile allo smontaggio o alla denaturazione durante la cromatografia di affinità. Una proteina portante monomerica come mCherry può quindi essere preferibile, perché è stabile a basso pH⁴⁰, e l’inclusione di ripetizioni tandem dell’epitopo aumenterebbe l’avidità del ligando e quindi aumenterebbe la capacità di resina⁵^, ²⁶ del sistema di ^, ^41.Per le semplici proteine portante-epitopia (cioè quelle senza legami disulfide o modifiche post-traduzionali) i sistemi di produzione microbica possono ridurre i costi di produzione e rendere i ligandi più competitivi con la proteina A. Ad esempio, la proteina fluorescente verde è stata espressa in cellule batteriche con una resa di biomassa di 1^g-1 kg, che ridurrebbe significativamente i costi di produzione di ligandi⁴².

Indipendentemente dall’host dell’espressione, durante l’accoppiamento è stato necessario un ligando di affinità purificato per ridurre al minimo l’immobilizzazione delle proteine cellulari ospiti o dei componenti multimediali che altrimenti possono ridurre la selettività e la capacità della resina. L’inclusione di un tag poli-istidina per la purificazione IMAC ha aumentato la purezza al 90% in un unico passaggio, facilitando la produzione rapida e poco costosa di ligando⁵^,⁴³^,⁴⁴. Tuttavia, la posizione del tag di fusione è importante perché ha il potenziale di ostacolare di tipo sterically il legame dell’epito posta o di indurre la scissione del tag o dell’epitopo dal vettore⁴⁵^,⁴⁶.

Immobilizzazione del ligando di affinità sulle colonne di cromatografia attivate da NHS

L’immobilizzazione è stata eseguita manualmente o utilizzando un sistema di cromatografia. I piccoli volumi di buffer per colonna sembravano favorire la gestione manuale (ad esempio, a causa dei minimi volumi di rifiuti). Tuttavia, se sono necessarie più colonne o più grandi, il sistema di cromatografia rende le condizioni di accoppiamento più facili da controllare (ad esempio, velocità di flusso regolamentate) ed è quindi più probabile ottenere risultati riproducibili in termini di DBC. I nostri dati suggeriscono che il buffer di accoppiamento e il pH hanno un effetto importante sull’efficienza di accoppiamento e sui costi complessivi delle colonne. I fattori di screening che influenzano la reazione di accoppiamento e la loro regolazione per ogni proteina portante (o anche per ogni fusione carrier-ligando) potrebbero quindi migliorare l’efficienza e le prestazioni della resina di accoppiamento, e consigliamo questo approccio.

Test dell’isolamento 2F5 utilizzando la resina di affinità DFE

La resa e la purezza dei prodotti sono aspetti importanti della resa della resina, e nel caso del DFE abbiamo raggiunto una resa del 105 % e una purezza del 97 % (SD, n. 3), che è paragonabile alle prestazioni delle resine di proteine di riferimento^{A 25} ^,²⁶. Un altro indicatore chiave delle prestazioni per le resine in generale (e in particolare per quelle basate su ligandi di affinità) è il DBC al 10% di svolta del prodotto, perché questo parametro influisce sulla quantità di resina necessaria per un processo specifico e quindi sui costi. Per il ligando DFE, il DBC iniziale era di 4 g L^-1 resina, che è il 13% del valore corrispondente per la Proteina A in condizioni simili (solo 2 min tempo di contatto)²⁵^,⁴⁷ ma circa 15 volte superiore rispetto ad altre resine di affinità personalizzate come la lige anti-FSH-immunoaffinità utilizzando lo stesso tempo di residenza di 2 min⁴⁸. Il DBC di DFE è sceso al 15% del valore iniziale dopo 25 cicli di legame e di elizione, mentre più di 50 cicli sono necessari per la stessa perdita di DBC nelle resine commerciali^{A 49}. Tuttavia, è importante notare che il nostro vettore non è ancora stato ottimizzato nella stessa misura della proteina A, che è stata studiata e migliorata in modo completo negli ultimi quattro decenni⁸.

Finora abbiamo migliorato la stabilità della resina e il recupero del prodotto passando da un buffer di eguagliazione a basso pH a un’alta concentrazione di cloruro di magnesio (Figura 3), come raccomandato negli studi precedenti¹³. Il caratteristico colore rosso del ligando di affinità non è sbiadito sostanzialmente durante i 25 cicli bind-and-elute, quindi ipotizziamo che le proteasi endogene delle piante negli estratti chiarificati della pianta³¹ possano aver troncato e quindi inattivato l’epitopo di il ligando. Pertanto, la progettazione di linker resistenti alle proteasi per collegare il vettore e l’epitopo può aiutare a mantenere il DBC iniziale su un numero prolungato di cicli. Data la rapida e semplice espressione e purificazione del ligando DFE, il suo semplice accoppiamento alle resine di cromatografia commerciale e la sua eccellente resa e purezza del prodotto, crediamo che il nostro metodo offra un’alternativa adatta alla ProteinA per Purificazione di mAbs e derivati anticorpo che non si legano alla proteina A, soprattutto se i miglioramenti al vettore e al linker possono migliorare la stabilità del DBC e del ligando. Questa ipotesi è stata supportata dalla piccola differenza nella costante di dissociazione dell’anticorpo2F5 2F5 purificato da DFE e dalla proteina A, il che indica che il nostro nuovo ligando di affinità consente il recupero di mAb di alta qualità.

Vantaggi e attuali limitazioni del metodo

La produzione del ligando di affinità come fusione genetica con una proteina portante aumenta la solubilità in tamponi acquosi e quindi la compatibilità con le tipiche condizioni di accoppiamento dei ligandi. Al contrario, i peptidi vuoti derivati dalla sintesi dei peptidi a fase solida possono avere una solubilità limitata in queste condizioni a causa della loro sequenza⁵⁰, che non può essere modificata perché è dettata dalla sequenza di epitopo di amminoacidi riconosciuta dal mAb essere purificato. Altri hanno quindi utilizzato una sintesi in resina di ligandi peptidi⁵¹. La capacità di legatura statica della resina risultante era elevata (80 g di L^-1), ma il processo di preparazione della resina è lungo, non è stata riportata una capacità di legame dinamico e la purezza e il recupero ottenuti sono stati inferiori a quelli del nostro approccio. Un ulteriore vantaggio di un ligando di proteine di fusione in scala di laboratorio è che il ligando e le relative varianti possono essere rapidamente prodotti, purificati e testati con il minimo sforzo in un sistema di espressione ad alta velocità di utilizzo⁵².

Le due attuali limitazioni del metodo qui presentate sono la bassa capacità di legame dinamico di 3 g L^-1 e la sua riduzione del 90% nel corso di 25 cicli di legatura-e-elute⁵. Queste limitazioni possono essere affrontate in futuro applicando condizioni di carico meno rigorose e sostituendo l’attuale supporto DsRed con una variante ingegnerizzata e più stabile rispettivamente. Ad esempio, raddoppiare il tempo di contatto corrente da 2 a 4 minuti ha il potenziale per raddoppiare la capacità di legame dinamico come è stato mostrato per alcune resine proteiche²⁶.

risoluzione f dei problemi

Nella tabella seguente vengono evidenziati i potenziali problemi che possono essere riscontrati durante questo protocollo e vengono forniti suggerimenti su come risolverli (Tabella 1).

Tabella 1: Potenziali problemi che possono essere riscontrati e possibili correzioni.
Passaggio del protocollo	problema	Couse	correzione
1	Le piante non crescono	Condizioni di crescita compromesse	Controllare il pH e la conduttività del fertilizzante
			Controllare la temperatura e le condizioni della luce
2 e 3	Grandi quantità di proteine delle cellule ospiti sono presenti dopo l’estrazione	Precipitazioni incomplete	Controllare la temperatura durante lo sbollentamento
			Controllare l’agitazione nel bagno di sbiancamento
2 e 3	Nessun prodotto trovato nell’estratto di pianta	Temperatura di sbiancamento troppo alta	Controllare la temperatura e il pH durante la sbiancamento
		pH in buffer sbollentamento troppo basso
3	Grandi parti del gambo o della foglia rimangono dopo l’estrazione	Miscelazione incompleta nel frullatore	Assicurarsi che il materiale dell’impianto non formi una spina nel frullatore
3	Rapido aumento della pressione durante la filtrazione della profondità	Selezione e/o orientamento del filtro non corretti	Controllare il tipo di filtro e l’orientamento
4	Piccola proteina di fusione durante l’elusione / un sacco di proteina di fusione	La resina IMAC non è stata caricata con ioni metallici	Verificare se la resina IMAC è stata caricata correttamente con ioni
		La proteina fusione ha perso il tag di affinità	Evitare l’intensa luce solare e le alte temperature durante la coltivazione delle piante
4	Proteina di fusione persa durante la concentrazione	Proteina di fusione legata alla membrana	Controllare il tipo di membrana
			Assicurarsi che il fattore di concentrazione non sia troppo alto
5	Basso rendimento di accoppiamento	Sequenza errata di aggiunta di reagente di accoppiamento	Controllare le etichette dei reagenti e la sequenza di
		Preparazione errata delle colonne prima dell’accoppiamento	Controllare le condizioni di colonna preparaiton
5 e 6	Basso rendimento mAb	Bassa espressione mAb nella biomassa vegetale	Testare l’espressione mAb nella biomassa
		Bassa densità di ligando	Controllare la purezza della preparazione della proteina di fusione
7	Concentrazioni proteiche molto basse/alte nell’ambito di Bradford	Formazione di bolle durante la pipettatura	Controllare le bolle nel palte 96-well
7	Bassa concentrazione di mAb durante la misurazione SPR	Proteina A compromessa	Confrontare con i risultati di mAb standard con concentrazione nota
		Diluizione del campione non corretta	Controllare il tasso di diluizione e il buffer

Tabella 1: Risoluzione dei problemi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere Ibrahim Al Amedi per aver coltivato le piante di tabacco transgenico e il Dr. Thomas Rademacher per aver fornito il vettore di espressione del tabacco. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Richard M. Twyman per l’assistenza editoriale e Markus Sack per fruttuose discussioni sulla struttura del ligando di affinità DFE. Questo lavoro è stato finanziato in parte dai programmi interni Fraunhofer-Gesellschaft sotto Grant No. Attirare 125-600164 e lo stato del Nord-Reno-Vestfalia sotto il Leistungszentrum grant n. 423 “Produzione in rete e adattiva”. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) nel quadro della sovvenzione “Tumor-targeted Drug Delivery” del Gruppo di formazione per la ricerca 331065168. GE healthcare ha sostenuto la pubblicazione ad accesso aperto di questo articolo.

Materials

10L/20L Bucket	n/a	n/a	Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
ÄKTApure	GE Helthcare	29018226	Chromatography system
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Centrifuge
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Antibody 2G12	Fraunhofer IME	n/a	Standard for SPR quantification
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Bag filter
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chelating Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	Chromatography resin
Cond 3320	WTW	EKA 3338	Conductometer
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Multichannel pipette
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Diverse bottles	Schott Duran	n/a	Glas bottles
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Heat block
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Buffer component
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plate reader
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Thermometer
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraction collector
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200	Hettich	2400	Centrifuge
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatography columns
Hydrochloric acid	Carl Roth GmbH	4625.1	Buffer component
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	Buffer component
K700	Pall	5302305	Depth filter layer
KM02 basic	IKA	n/a	Magnetic stirrer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Immersion circulator
Magnesium chloride	Carl Roth GmbH	KK36.2	Buffer component
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm	Sartorius	16534K	Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate	Carl Roth GmbH	T111.1	Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer	Invitrogen	NP0002	Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant	Invitrogen	NP0005	Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Perforated bucked	n/a	n/a	Blanching
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatography resin
Silicone spoon	n/a	n/a	Spoon
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Gel staining solution
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	6773.1	Buffer component
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	X891.1	Media component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-100G	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Buffer component
Sodium citrate	Carl Roth GmbH	HN13.2	Buffer component
Sodium bisulfite	Carl Roth GmbH	243973-100G	Media component
Sodium phosophate	Carl Roth GmbH	T877.2	Media component
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR device
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L	Clatronic	n/a	Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL	B. Braun	4606027V	Syringes
Syringe adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Syringe adapter
TE6101	Sartorius	TE6101	Precision scale
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Buffer component
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Chromatography software
Vacuum bags	Ikea	203.392.84	Plant storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
XK-26/20 column housing	GE Helthcare	28-9889-48	Chromtography column

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Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins – Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

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