Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Matthias Kn&#246;dler; Clemens R&#252;hl; Patrick Opdensteinen; Johannes  F. Buyel

doi:10.3791/59933

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Biochemistry

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/59933

Matthias Knödler^1,3, Clemens Rühl², Patrick Opdensteinen^1,3, Johannes F. Buyel^1,3

¹Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ²Sanofi Deutschland GmbH, ³Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

Bei diesem Verfahren wird ein DsRed-basierter Epitopligand immobilisiert, um als Alternative zu Protein A ein hochselektives Affinitätsharz für den Abscheidung monoklonaler Antikörper aus rohen Pflanzenextrakten oder Zellkulturüberbleibsanten herzustellen.

Abstract

Die Reinigung monoklonaler Antikörper (mAbs) wird üblicherweise durch Protein-A-Affinitätschromatographie erreicht, die bis zu 25 % der gesamten Prozesskosten ausmachen kann. Alternative, kostengünstige Erfassungsschritte sind daher wertvoll für die industrielle Fertigung, bei der große Mengen eines einzelnen mAb produziert werden. Hier stellen wir eine Methode zur Immobilisierung eines DsRed-basierten Epitopligands zu einem vernetzten Agaroseharz vor, das den selektiven Abfang des HIV-neutralisierenden Antikörpers 2F5 aus Rohpflanzenextrakten ohne Verwendung von Protein A ermöglicht. Das lineare Epitop ELDKWA wurde zunächst genetisch mit dem fluoreszierenden Protein DsRed verschmolzen und das Fusionsprotein wurde in transgenen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) vor der Reinigung durch immobilisierte Metall-Ionen-Affinitätschromatographie exprimiert. Darüber hinaus wurde ein Verfahren auf Basis aktivierter vernetzter Agarose für hohe Ligandendichte, effiziente Kopplung und geringe Kosten optimiert. Die pH- und Pufferzusammensetzung und die lösliche Ligandenkonzentration waren die wichtigsten Parameter während des Kopplungsverfahrens, das durch einen Versuchsansatz verbessert wurde. Das resultierende Affinitätsharz wurde auf seine Fähigkeit getestet, das Ziel mAb selektiv in einem Rohpflanzenextrakt zu binden, und der Elutionspuffer wurde für hohe mAb-Rückgewinnung, Produktaktivität und Affinitätsharzstabilität optimiert. Die Methode kann leicht an andere Antikörper mit linearen Epitopen angepasst werden. Die neuen Harze ermöglichen schonendere Elutionsbedingungen als Protein A und könnten auch die Kosten eines ersten Erfassungsschritts für die mAb-Produktion senken.

Introduction

Biopharmazeutische Produkte sind wichtig für die Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten in fast allen Bereichen der Medizin¹. Monoklonale Antikörper (mAbs) dominieren den biopharmazeutischen Markt, der weltweite Umsatz soll 2020 fast 110 Milliarden Euro^erreichen. Die bevorzugte Expressionsplattform für mAbs sind chinesische Hamster-Ovarialzelllinien, die typischerweise hohe mAb-Titer von bis zu 10 g-L-1 im Kulturüberstand³^,⁴produzieren. Die Produktion von mAbs in Säugetierzellkulturen ist jedoch aufgrund der hohen Kosten des Mediums und der Notwendigkeit einer sterilen Fermentation⁵teuer. Alternative Ausdrucksplattformen wie Anlagen bieten potenziell einen schnelleren, einfacheren, kostengünstigeren und skalierbareren Ansatz für die industrielle Fertigung⁶^,⁷.

Zusätzlich zu den Kosten, die mit Säugetierzellkulturen verbunden sind, ist die weit verbreitete Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie für die Produkterfassung ein wichtiger Kostentreiber für die industrielle Produktion von mAbs. Protein A ist natürlicherweise auf der Oberfläche von Staphylococcus aureus Zellen gefunden und es bindet an die Fragment kristallisierbare (Fc) Region von bestimmten murinen und menschlichen Antikörpern, wodurch als Abwehrmechanismus, um das humorale Immunsystem zu umgehen⁸. Protein A hat sich zum Industriegoldstandard für die Erfassung von mAbs aus Zellkulturüberstand und ist auch weit verbreitet von der Forschungsgemeinschaft, weil es sehr selektiv ist, in der Regel erreichen mAb Reinheitvon 95% in einem einzigen Schritt⁸. Es überrascht nicht, dass der Verkauf von Protein A in den letzten zwei Jahrzehnten den Umsatz von mAbs⁸sehr genau widerspiegelte. Je nach Produktionsskala können die Kosten von Protein A mehr als 25% der gesamten Prozesskosten betragen und damit den Marktpreis von therapeutischen mAbs beeinflussen, der bis zu 2.000 g^-1⁵^,⁹betragen kann. Daher haben alternative Chromatographieharze mit ähnlicher Reinigungsleistung das Potenzial, die Produktionskosten erheblich zu senken, wodurch Antikörper-basierte Therapien für eine größere Anzahl von Patienten zugänglich sind¹⁰^,¹¹ ^,¹². Solche Alternativen können auch die Nachteile der Protein-A-Chromatographie umgehen, einschließlich der harten Elutionsbedingungen bei niedrigem pH-Wert (typischerweise <3.5), die möglicherweise dazu führen können, dass mAbs konforme Veränderungen durchlaufen, die die Aggregation fördern¹³ . Wichtig ist, dass Protein A nur für die Fc-Region bestimmter IgG-Unterklassen selektiv ist, so dass nicht-funktionelle Moleküle mit abgeschnittenen Bindungsdomänen mit dem intakten Produkt⁵ko-reinigen können, während mAb-Derivaties wie einkettige variable Fragmente nicht an Protein A binden.

Hier beschreiben wir ein alternatives Affinitätschromatographieharz zur Erfassung des HIV-neutralisierenden mAb 2F5 mit seinem linearen Epitop ELDKWA (ein Buchstabe Aminosäurecode)⁵^,¹⁴. Wir haben das 2F5-Epitop genetisch mit dem C-Terminus des fluoreszierenden Proteins DsRed verschmolzen, das als Träger- und Reportermolekül fungierte, und das resultierende Protein DsRed-2F5-EPitop (DFE) in transgenem Tabak ( Nicotiana tabacum) Pflanzen. DFE wurde durch einstufige immobilisierte Metall-Ionen-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt. Die Immobilisierung des gereinigten DFE-Affinitätsligandes auf ein vernetztes Agaroseharz wurde durch chemische Kopplung mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)-aktivierten vernetzten Agarosesäulen erreicht. Statistische Versuchsentwürfe wurden dann verwendet, um den Immobilisierungsverfahren und die Kopplungseffizienz¹⁵zu optimieren. Die Reinigungsstrategie für mAb 2F5 wurde in Bezug auf Antikörperreinheit, Ausbeute und Ligandenstabilität bewertet. Im Gegensatz zu Protein A, das die Fc-Region bindet, ist DFE an die komplementäritätsbestimmende Region 2F5 gebunden, um die Reinigung von Molekülen mit einem intakten Paratop zu gewährleisten. Unser Konzept lässt sich leicht an jedes mAb mit einem linearen Epitop oder an andere Peptid-basierte Affinitätsliganden anpassen, die durch Mikroarray-Studien leicht identifiziert werden können¹⁶.

Abbildung 1: Prozessflussschema zur Herstellung von Epitop-Affinitätsharzen, die für die Erfassung von mAbs aus Rohpflanzenextrakten oder Zellkulturüberstandverwendetern verwendet werden können. (A) Die Affinität Ligand DFE wurde in transgenen Tabakpflanzen ausgedrückt. Ein Wärmefällschritt (B) wurde vor der Homogenisierung der geernteten Blätter (C )einbezogen. (D) Der Rohpflanzenextrakt wurde durch Beutelfiltration, Tiefenfiltration und 0,2 m sterile Filtration geklärt. (E) DFE wurde dann von IMAC gereinigt. (F, G) Die gereinigte DFE-Affinitätsliganand wurde auf EDC/NHS-aktivierten vernetzten Agarosesäulen immobilisiert. (H) Bakterienkulturen mit T-DNA-kodierender Antikörper 2F5 wurden zur transienten Expression in N. benthamiana Pflanzen (I) verwendet, die in einem Phytotron angebaut wurden. (J) N. Benthamiana Blätter wurden geerntet und verarbeitet, wie in D. (K) mAb 2F5 beschrieben wurde aus dem geklärten Extrakt mit den DFE-Affinitätssäulen gereinigt (L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Kultivieren Sie die transgenen Tabakpflanzen HINWEIS: Das Design des DFE-Fusionsproteins und die Erzeugung transgener Pflanzen werden an anderer Stelle beschrieben5,17. Die transgenen Tabaksämlinge im Boden keimen. Bewässern Sie die Pflanzen mit einem 1,0 g L-1 Düngerlösung. Übertragen Sie die Pflanzen in einzelne, 100 mm x 100 mm x 60 mm (Länge, Breite, Höhe) Töpfe, wenn sie bis zu einem Durchmesser von 0,04 m wachsen. Kultivieren Sie die transgenen Tabakpflanzen in einem Gewächshaus mit einer 16-h-Photoperiode (25/22 °C Hell-Dunkel-Temperaturregelung), mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit und automatisierter Düngung mit einem 1,0 g L-1 Düngerlösung für 15 min pro Stunde. Nach 7 Wochen alle Blätter außer den vier Cotyledonblättern an der Basis des Pflanzenstamms ernten. Verarbeiten Sie die geernteten Blätter sofort wie unten beschrieben. 2. Hitze Niederschlag von Wirtszellproteinen Einrichtung eines Wasserbades mit einem Arbeitsvolumen von 20 l in einem beheizten Behälter aus Edelstahl (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). Legen Sie zu Beginn eine Magnetpumpe in das Wasserbad, um die Flüssigkeit dauerhaft mit einem Durchfluss von 5 L min-1zu erregen. Montieren Sie einen einstellbaren Thermostat am Wasserbad zur Temperaturregelung (Schritte 2.4 und 2.8).ACHTUNG: Alle folgenden Schritte bis 2.10 beinhalten den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstungen, einschließlich wärmegedämmter Handschuhe und Schutzbrillen. 15 L entionisiertes Wasser in das Wasserbad geben und die Flüssigkeit auf 70 °C erhitzen. Legen Sie einen 10 L Eimer gefüllt mit 5 L entionisiertem Wasser auf einen magnetischen Rührer. Natriumphosphat zu einer Endkonzentration von 120 mM hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M Salzsäure auf 8,14 ein. Wenn sich alle Komponenten gelöst haben, fügen Sie den resultierenden konzentrierten Blanchierungspuffer (5 L) ab Schritt 2.2 in das Wasserbad ein. Das Wasserbad so lange aufräumen, bis die Temperatur 70 °C erreicht. Verwenden Sie 10 M Salzsäure, um den pH-Wert bei Bedarf auf 8,14 einzustellen. Fahren Sie mindestens 15 min am Gedleiter fort, nachdem die erforderliche Temperatur und der pH-Wert erreicht sind, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Baugruppe im thermischen Gleichgewicht befindet. Bereiten Sie einen 20-Liter-Eimer (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) mit entionisiertem Wasser bei einer Temperatur von 17 °C (erforderlich für Schritt 2,9) vor. 400 g Aliquots der geernteten Tabakblätter aus Schritt 1.3 zubereiten. Legen Sie ein Aliquot in einen perforierten Korb (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; Porenbreite mindestens 0,02 m x 0,02 m). Vermeiden Sie eine Überfüllung des Korbes mit Pflanzenmaterial oder das Verpacken der Blätter zu eng, um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden. Den Korb ab Schritt 2.4 vollständig in den heißen Blanchierungspuffer untertauchen und sicherstellen, dass alle Blätter unter der flüssigen Oberfläche verbleiben. Verwenden Sie einen thermostabilen Silikonlöffel, um die Blätter bei Bedarf unter der Oberfläche zu halten. Inkubieren Sie die Tabakblätter für 1,5 min in der Blanchierungsflüssigkeit, während die Pumpe noch die Flüssigkeit aufregt. Überwachen Sie die Flüssigkeitstemperatur während der gesamten Inkubationszeit. Vermeiden Sie es, den Pumpeneinlass mit Tabakblättern zu blockieren. Entfernen Sie den Korb der Tabakblätter aus dem Blanchierungspuffer und abtropfen Sie den Restpuffer aus den Blättern für 30 s. Übertragen Sie den Korb in den mit kaltem Wasser gefüllten Eimer (ab Schritt 2.5) und tauchen Sie die Blätter für 30 s ein. Entfernen Sie den Korb und abtropfen Sie Restwasser aus dem le 30 s vor der Homogenisierung (Schritt 3). Wiederholen Sie die Schritte 2.6 bis 2.9 mit frischen Aliquots von 2,6 bis zur Gesamten Erntebiomasse. Ständig den pH-Wert und die Temperatur des Blanchierungspuffers im Wasserbad überwachen und einstellen.HINWEIS: Blanched Pflanzenmaterial kann bis zu 30 min auf Eis gelagert werden, wenn mehrere Blanchierungszyklen erforderlich sind, um die gesamte Biomasse zu verarbeiten. Blanched Blätter können auch in vakuumversiegelten Beuteln bei –80 °C für mindestens 3 Wochen gelagert werden. Eine sofortige Verarbeitung wird jedoch empfohlen, da eine längere Lagerung den DFE-Ertrag verringern kann. 3. Proteinextraktion und -klärung ACHTUNG: Die folgenden Schritte beinhalten einen Mixer mit rotierenden Klingen. Arbeiten Sie nicht im Mixerbehälter, wenn sie mit Strom versorgt oder auf der Motoreinheit montiert werden. 150 g blanchierte Tabakblätter (Schritt 2,9) in das Mischgefäß geben und 450 ml Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumdisulfit, pH 7,5) hinzufügen. Schließen Sie die Mischerkappe fest, um das Verschütten von Pflanzenmaterial oder Puffer zu verhindern. Homogenisieren Sie die Blätter für 3x für 30 s, mit 30 s Pausen zwischen jedem Puls. Stellen Sie sicher, dass alle Blätter homogenisiert sind und keines an der Oberseite des Mixergefäßes klebt. Öffnen Sie bei Bedarf den Mixer während der Pausen und drücken Sie die Blätter, die am oberen Teil des Gefäßes kleben, mit einem sauberen Silikonlöffel nach unten. Nach der Homogenisierung nehmen Sie eine 1,0 ml Probe des Homogenats für die nachfolgende Analyse (Schritt 7). Sammeln Sie das Homogenat in einem Behälter mit ausreichender Größe (z. B. bei Arbeiten mit einer Gesamtbiomasse von 1,0 kg, verwenden Sie ein Gefäß mit einer Kapazität von mindestens 5 L). Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.3, bis die gesamte blanchierte Biomasse homogenisiert ist. Montieren Sie einen Beutelfilter in eine Filterhalterung und legen Sie ein weiteres Gefäß in angemessener Größe (siehe 3.4) unter die Baugruppe. Tragen Sie das Homogenat mit einer Rate von 0,15 l min-1auf den Beutelfilter auf. Nehmen Sie Proben des Beutelfiltrats nach jedem Liter für die nachfolgende Analyse (Schritt 7) und messen Sie die Trübung des Beutelfiltratbeckens als 1:10 Verdünnung im Extraktionspuffer mit einem Trübungsmesser oder einer ähnlichen Vorrichtung. Klären Sie den Beutelfiltratpool mit 0,02m2 eines K700 (oben) und KS50 (unten) Tiefenfilterschicht Kombination pro Liter Beutel Filtrat-Pool. Tragen Sie eine Durchflussmenge von 3,0 l min-1m-2 bis zu einem maximalen Druck von 0,2 MPa auf. Entfernen Sie dann Restpartikel, indem Sie das geklärte Filtrat durch einen 0,2 m sterilen Filter, wie zuvor beschrieben,5. 4. Reinigung des DFE Affinity Ligand Bereiten Sie ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographiesystem vor, indem Sie mit Elutionspuffer (10 mM Natriumphosphat, 300 mM Imidazol, pH 7,4), Waschpuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4) und Ausgleichspuffer (20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,4) spülen. Montieren Sie eine Säule mit einem Chelat-Kreuz-Verglasungsharz pro Kilogramm Blattbiomasse (2,5 l Tiefenfiltrat) mit einem Chelat-Kreuz-Verglasungsharz. Laden Sie die Säule mit Nickelionen auf, indem Sie 5 Säulenvolumina (CV) von 200 mM Nickelsulfatlösung auftragen und mit 5 CV Elutionspuffer waschen. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 50 cm h-1 und überwachen Sie die UV-Signale bei 260, 280 und 558 nm für alle nachfolgenden Chromatographieschritte. Gleichsetzen Sie die Spalte mit 10 CV Desgleichgewichtspuffer. Dann 50 CV des geklärten Pflanzenextrakts (ab Schritt 3.6) auf die konditionierte Säule laden. Waschen Sie die Säule mit 10 CV Waschpuffer. Elute das DFE-Fusionsprotein mit 5 CV-Elutionspuffer und sammeln Sie die produkthaltige Fraktion, sobald die UV-Signale bei 280 nm und 558 nm auf mehr als 5 mAU über dem Ausgangswert angestiegen sind. Nehmen Sie eine 0,2 ml-Probe aus der Elutionsfraktion, um die Gesamtkonzentration des löslichen Proteins (TSP), der DFE-Konzentration (Schritte 7.2 und 7.3) und der DFE-Reinheit (Schritt 7.4) zu messen. Montieren Sie eine Säule mit einem vernetzten Dextranharz im Wert von 50 ml auf einem Chromatographiesystem. Die Säule mit 5 CV Kupplungspuffer (200 mM HEPES, 500 mM Natriumchlorid, pH 8,5) ausdemieren. Injizieren Sie 10 ml der DFE-Elutionsfraktion (Schritt 4.4) für den Pufferaustausch und überwachen Sie die UV-Absorption bei 280 und 558 nm. Sammeln Sie die DFE-haltige Fraktion, sobald die UV-Signale bei 280 nm und 558 nm auf mehr als 5 mAU über der Basislinie angestiegen sind. Nehmen Sie eine 0,2 ml-Probe und bestimmen Sie die TSP-Konzentration, die DFE-Konzentration und die DFE-Reinheit (Schritt 7). Die gereinigte DFE-Probe (ab Schritt 4.7) auf 15 g L-1 mit einem Zentrifugalkonzentratorrohr bei 3.000 x g bei 4 °C für 30 min in einer Zentrifuge konzentrieren. Fahren Sie mit der Kupplungsreaktion fort (Schritt 5).HINWEIS: Bewahren Sie die DFE-Lösung bei 4 °C auf, wenn die Konzentrations- oder Kupplungsschritte nicht sofort durchgeführt werden können. 5. Koppeln von DFE an das aktivierte vernetzte Agaroseharz HINWEIS: Ersetzen Sie das Isopropanol, das für die Lagerung von NHS-aktivierten Säulen verwendet wird, erst, wenn alle Geräte und Lösungen für die Kopplung bereit sind. Lassen Sie die Säulen niemals trocken laufen. Einrichtung eines Versuchsmodells (DoE) zur Optimierung der Kopplung von DFE an das aktivierte Harz mit pH-Wert, Pufferzusammensetzung und DFE-Konzentration als Faktoren. Die Einzelheiten der DoE-Methode werden an anderer Stelle beschrieben15. Bereiten Sie die Affinitätsligadenlösung (ab Schritt 4.8) in einem Konzentrationsbereich von 0,5–15 g L-1 oder wie im DoE definiert und auf Eis lagern, bis die Kupplungsreaktion bereit ist (Schritt 5.5). Füllen Sie mindestens zehn 2 ml Spritzen mit der DFE-Lösung und bereiten Sie einen Adapter vor, um die Spritzen auf NHS-aktivierten vernetzten Agarosesäulen mit einem Bettvolumen von 1,0 ml zu montieren. Für je 10 für die Kopplung verwendete Säulen 30 ml Deaktivierungslösung (0,5 M Ethanolamin, 0,5 M Natriumchlorid, pH 8,3), 30 ml NiedrigpH-Lösung (0,1 M Natriumacetat, 0,5 M Natriumchlorid, pH 4,0) und 10 ml Speicherlösung (0,05 M 0,1% (m/v) Natriumazid, pH 7,0). Bereiten Sie 20 ml 1 mM Salzsäure in einem Rohr vor und inkubieren Sie sie mindestens 20 min auf Eis. Bereiten Sie eine Präzisionsskala vor, um die Durchflussfraktionen für alle Schritte während der Kopplungsreaktion zu überwachen (Schritt 5.7). Öffnen Sie eine versiegelte, MIT NHS aktivierte vernetzte Agarosesäule und montieren Sie den Spritzenadapter am Säuleneinlass. Verhindern Sie, dass Luft in die Säule gelangt, indem Sie einen Tropfen Puffer auf den Adaptereinlass auftragen, bevor Sie ihn an die Spritze anschließen. Waschen Sie die Säule mit 6 ml eiskalte 1 mM Salzsäure (ab Schritt 5.4) mit einer Durchflussrate von <1 ml min-1 und fahren Sie sofort mit Schritt 5.7 fort. 1,5 ml DFE-Lösung (Schritt 5.2) mit einer 2 ml Spritze mit einer Durchflussrate von <1 ml min-1 injizieren und den Durchflussanteil auf einer Präzisionsskala (Schritt 5.4) für die nachfolgende Analyse (Schritt 7) sammeln. Versiegeln Sie die Säule an beiden Enden und brüten Sie je nach DoE-Setup 15 bis 45 min bei 22 °C. Injizieren Sie 6 ml Deaktivierungslösung, gefolgt von 6 ml Low-pH-Lösung mit einer Durchflussrate von <1 ml min-1, um nicht kovalent gebundene Liganden aus dem Harz zu entfernen. Dann 6 ml Deaktivierungslösung injizieren und die Säule 15 min inkubieren. Injizieren Sie 6 ml Low-pH-Lösung in die Säule, gefolgt von 6 ml Deaktivierungslösung. Dann injizieren Sie weitere 6 ml Low-pH-Lösung in die Säule. 2 ml Speicherlösung in die Säule injizieren und bei 4 °C lagern. 6. Prüfung der Reinigung von mAbs aus geklärten Pflanzenextrakten Bereiten Sie 100 ml geklärten Pflanzenextrakt mit 2F55 oder den Überstand aus dem bevorzugten zellbasierten Expressionssystem, ebenfalls mit 2F5, vor. Herstellung des Ausgleichspuffers (20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,4), des niedrigen pH-Elutionspuffers (0,05 M Citrat, 0,05 M Natriumchlorid, pH 4,0–3,25) und des elutionshohen Elutionspuffers mit hoher Ionikstärke (1,0–4,0 M Magnesiumchlorid, 0,1 M HEPES, pH 8,0) Spülen Sie das Chromatographiesystem mit den Puffern. Montieren Sie eine DFE-Affinitätssäule (ab Schritt 5.10) auf dem Chromatographiesystem und gleichnden Sie mit 5 CV Ausgleichspuffer bei einer Durchflussrate von 1,0 mL min-1. Überwachen Sie die UV-Absorption bei 280 nm.HINWEIS: Das Laden von Pflanzenextrakten oder Zellkulturüberstand auf die Säule kann zu einer Erhöhung des Gegendrucks führen. Stellen Sie einen Hochdruckalarm auf 0,2 MPa ein, um Schäden am Chromatographiesystem oder an der DFE-Säule zu vermeiden. 80 ml des geklärten Pflanzenextrakts oder Überstandes (Schritt 6.1) mit einer Durchflussrate von 0,5 ml min-1 auf die Säule laden, um eine Kontaktzeit von 2 min zu gewährleisten. Sammeln Sie die Durchflussproben in 2 ml-Fraktionen für die Bahnbrechende Kurvenrekonstruktion (Schritt 7.3). Bewahren Sie die Durchflussproben bei 4 °C auf, wenn eine sofortige Probenanalyse nicht möglich ist. Waschen Sie die Säule mit 6 CV Desgleichgewichtspuffer. Sammeln Sie eine Probe der Wäsche am Anfang, in der Mitte und am Ende dieses Schritts. Elute mAb 2F5 mit 5 CV niedrig pH-Elutionspuffer oder hochionisch-stärkeisitärer Elutionspuffer (0,1 M HEPES, 1,25 M Magnesiumchlorid, pH 8,0). Sammeln Sie den DFE-Anteil, wenn das UV 280 nm Signal auf 5 mAU über der Basislinie angestiegen ist. Optimieren Sie den Elutionspuffer für jedes Epitop-Antikörper-Paar. Für 2F5 erreichten 1,25 M Magnesiumchlorid ein optimales Gleichgewicht zwischen Produktrückgewinnung und Ligandenstabilität.HINWEIS: Die Magnesiumchloridlösung ist anfällig für Ausfällungen. Lösen Sie daher das Magnesiumchlorid in 700 ml Wasser auf. Lösen Sie die HEPES in 100 ml Wasser separat auf und stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein. Fügen Sie die gelöste Magnesiumchloridlösung in die HEPES-Lösung ein und geben Sie Wasser zu einem Endvolumen von 1,0 l hinzu. Stellen Sie den pH-Wert nach dem Lösen des Magnesiumchlorids nicht ein, da dies zu Niederschlägen führt. Analysieren Sie alle Proben, die in den Schritten 6.4–6.6 mit der Bradford-Methode, Lithium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (LDS-PAGE) und Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR)-Spektroskopie (Schritt 7) entnommen wurden. 7. Stichprobenanalyse Messen Sie die TSP-Konzentration nach der Bradford-Methode18,19. In dreifacher Ausführung wird die Pipette 2,5 l jeder Probe in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte einfließen. Verwenden Sie acht Rinderserumalbumin (BSA) Standards in dreifacher Ausfertigung, die den Bereich von 0–2.000 mg abdeckt. L-1. Fügen Sie jedem Brunnen 200 L Bradford-Reagenz hinzu und mischen Sie sie, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen. Halten Sie die Pipettenebene, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die die nachfolgende Auslesung verzerren. Inkubieren Sie die Platte 10 min bei 22 °C und messen Sie die Absorption bei 595 nm in einem Spektralphotometer. Berechnen Sie die TSP-Konzentration in den Proben basierend auf einer Standardkurve durch die BSA-Referenzpunkte. Quantifizieren von DFE durch Fluorimmetrie In dreifacher Ausführung wird die Pipette 50 l jeder Probe in einzelne Brunnen einer schwarzen 96-Well-Halbflächenplatte eingebracht. Einbeziehen sie sechs DsRed-Standards für den Bereich 0–225 mg L-1. Messen Sie die Fluoreszenz zweimal mit einem 530 x 30 nm Anregungsfilter und einem Emissionsfilter von 590 x 35 nm in einem Spektralphotometer. Berechnen Sie die DFE-Konzentration in den Stichproben basierend auf einer Standardkurve durch die DsRed-Referenzpunkte. Messen Sie die 2F5-Konzentration durch SPR-Spektroskopie20. Bereiten Sie den HBS-EP-Laufpuffer (10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES), 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 150 mM Natriumchlorid, 0,005% v/v Tween-20, pH 7,4) vor und filtern sie durch ein 0,2-mm-Vakuum sterilisieren, indem Sie es durch ein 0,2-mm-Vakuum Flaschen-Top-Filter. Entgasen Sie den Puffer für 15 min. Schließen Sie den HBS-EP-Laufpuffer an das SPR-Instrument an, bevor Sie einen carboxymethylierten Dextran-Oberflächenchip andocken und das System mit der Prime-Funktion ausdemieren. Starten Sie einen manuellen Lauf mit einer Durchflussrate von 30 l min-1 und konditionieren Sie die Spanoberfläche, indem Sie abwechselnd 30 mM Salzsäure und 25 mM Natriumhydroxid (jeweils zwei Injektionen) über die Durchflusszellen 1 und 2 mit einer Durchflussrate von 30 l min-1 für 1 min injizieren. Bereiten Sie 300 l eines 500 mg L-1 Protein A Lösung in 10 mM Natriumacetat (pH 4.0). Durchstechflaschen mit 0,4 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid (EDC) und 0,1 M NHS und Zentrifuge bei 16.000 x g für 1 min vor dem Mischen von 70 l EDC und 70 l NHS. Übertragen Sie die EDC/NHS-Mischung und die Protein-A-Lösung auf 7 mm Kunststoff-Probenfläschchen und legen Sie sie in das Probenregal. Aktivieren Sie die carboxymethylierte Dextran-Chipoberfläche, indem Sie das EDC/NHS-Gemisch über die Durchflusszellen 1 und 2 mit einer Durchflussrate von 10 l min-1 für 10 min injizieren. Koppe Protein A an die aktivierte carboxymethylierte Dextranoberfläche, indem die Protein-A-Lösung über Durchflusszelle 2 mit einer Durchflussrate von 15 ‘L min-1 für 15 min injiziert wird. Während der Kopplung des Proteins A eine Durchstechflasche mit 1,0 M Ethanolaminhydrochlorid (pH 8,5) und Zentrifuge bei 16.000 x g für 1 min auftauen. 150 l in eine 7-mm-Kunststoffdurchstechflasche geben und in das Gerät geben. Wenn Schritt 7.3.5 abgeschlossen ist, deaktivieren Sie die Spanoberfläche, indem Sie die Ethanolaminlösung über die Durchflusszellen 1 und 2 mit einer Durchflussrate von 10 l min-1 für 7 min injizieren. Konditionieren Sie die Spanoberfläche durch abwechselnde Injektion von 30 mM Salzsäure und 25 mM Natriumhydroxid (jeweils zwei Injektionen) über die Durchflusszellen 1 und 2 bei einer Durchflussrate von 30 l min-1 für 0,5 min. Vorbereitung von Antikörperstandards 2F5 im HBS-EP-Laufpuffer in einer Konzentration von 500 L-1 und verdünnte Proben mit 2F5 in HBS-EP bis zu einer Endkonzentration im Bereich von 20–1.000 L-1. Injektion von Proben und Standards über durchflusszellen 1 und 2 bei einer Durchflussrate von 30 ‘L min-1 für 3 min. Injizieren Sie einen 2F5-Standard nach jeder 15 Probe. Subtrahieren Sie das relative Einheitensignal (RU) der Durchflusszelle 1 (Referenzzelle) vom Signal der Durchflusszelle 2 (Messzelle) für jede Probe und berechnen Sie die Antikörperkonzentration basierend auf dem RU-Signal von 2F5-Standardinjektionen. Regenerieren Sie nach jeder Probe oder Standardinjektion die Spanoberfläche, indem Sie 30 mM Salzsäure mit einer Durchflussrate von 30 ml min-1 für 0,5 min über den Durchflusszellen 1 und 2 injizieren. Zeichnen Sie die 2F5-Konzentration für jede Durchflussprobe ab Schritt 6.4 gegen den Durchflussvolumen, um die 2F5-Durchbruchskurve zu erhalten. Berechnen Sie die Menge der injizierten 2F5, wenn 10% der Belastungskonzentration 2F5 erreicht wurde, um die dynamische Bindungskapazität (DBC) von 10 % zu erhalten. Analysieren Sie Proteinproben von LDS-PAGE. Öffnen Sie ein gebrauchsfertiges 4–12% BisTris LDS Polyacrylamid-Gel und legen Sie es in ein Elektrophoresemodul. 800 ml Laufpuffer (50 mM MES, 50 mM Tris Basis, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) in das Modul übertragen und 0,5 ml antioxidative Lösung hinzufügen. In einem 1,5 ml Reaktionsrohr 10 l Ladepuffer mit 4 l Reduktionsmittel und 26 l der Proteinprobe mischen. Inkubieren Sie das Rohr in einem Wärmeblock für 10 min bei 80 °C. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x g für 30 s. Das LDS-Polyacrylamid-Gel (10 l Probe pro Spur) und 5 l vorgefärbten Proteinstandards (10–180 kDa) in eine separate Spur laden. Schließen Sie die Elektrophoresekammer und schließen Sie das Netzteil an. Die Elektrophorese sollte 40 min und konstant 200 V laufen. Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophoresekammer. Öffnen Sie die Gelummantelung und waschen Sie das Gel für 15 min wasser auf einem Shaker bei 19 Rpm. Das Gel für 1 h in Färbelösung auf einem Shaker bei 19 Rpm färben. Das Gel für 1 h in Wasser auf einem Shaker bei 19 Rpm abweisen. Scannen Sie das Gel mit einem Filmscanner.

Representative Results

Ausdruck und Reinigung der Affinität Liganden Das Fusionsprotein DFE wurde in transgenen Tabakpflanzen exprimiert, die in einem Gewächshaus angebaut wurden. Der Ertrag betrug 120 mg-kg-1 Blattmasse mit einer durchschnittlichen Biomasse von 130 g pro Pflanze. Die DFE-Reinheit betrug vor dem Blanchieren 97% der Wirtszellproteine ausgefällt wurden. Der Blanchierungsschritt wurde leicht in die Ernte- und Extraktionsroutine integriert (Abbildung 1) und benötigte weniger als 2 h zusätzliche Zeit, einschließlich des Aufbaus des Wasserbades. Die Gesamterholung von DFE betrug 23,5 mg kg1 mit einer Reinheit von >90%. Die für den Produktverlust verantwortlichen Schritte waren Blanchierung, Tiefenfiltration und IMAC mit spezifischen Verlusten von 40 %, 27 % bzw. 45 %. Die Tiefenfilterkapazität betrug durchschnittlich 135 x 36 l m-2 (SD, n=3) und damit im oberen Wertebereich, der in der Literatur21berichtet wurde. Der DFE-Ertrag stieg mit dem Pflanzenalter (Abbildung 2). Immobilisierung des Affinitätsligandens auf NHS-aktivierten Chromatographiesäulen Bei ersten Kopplungstests stellten wir fest, dass der HEPES-Puffer (pH 8.3) den Kopplungs-Wirkungsgrad auf 89 x 6 % (SD, n=3) im Vergleich zu 78 x 9 % (SD, n=3) für den vom Hersteller empfohlenen Bicarbonatpuffer erhöhte. Daher wurde HEPES für alle nachfolgenden Kopplungsexperimente eingesetzt. Ein DoE-Ansatz wurde gewählt, um die Kopplungseffizienz von DFE mit NHS-aktiviertem vernetztem Agaroseharz zu optimieren. Die absolute Menge an DFE, die auf dem Harz immobilisiert wurde, erhöhte sich mit der Masse von DFE, die in die Säule injiziert und bei 15 g hochgeschraubt wurde. L-1 während die Kopplungsausbeute kontinuierlich zurückging, da mehr DFE injiziert wurde (Abbildung 2). Die Kopplungsausbeute war auch in einem sauren Puffer um >50 % niedriger, was darauf hindeutet, dass für jeden Liganden von Fall zu Fall geeignete Kopplungsbedingungen geprüft werden müssen. Mit dem numerischen Optimierungstool der DoE-Software wurden ideale Bedingungen in Bezug auf Kopplungsausbeute, absolute Menge an immobilisierten DFE und Säulenkosten ermittelt. Die wünschenswertesten Bedingungen (pH 9,0 und 7,0 mg DFE pro 1 ml vernetztes Agaroseharz) lagen auf einem großen Plateau und waren daher robust. Die DFE-Moleküle behielten ihre rote Fluoreszenz auch nach der Kopplung bei, und die Farbintensität entsprach der Gesamtmenge der immobilisierten DFE (Abbildung 2). Daher kann die Spaltenfarbe als einfacher Qualitätskontrollparameter verwendet werden, um die Kopplungseffizienz und Spaltenqualität zu schätzen. Die Fluoreszenz bestätigte auch, dass DFE-Fusionsprotein im tetramerischen Zustand der nativen DsRed zusammengebaut wurde. Abbildung 2: Optimierung der DFE-Immobilisierung auf NHS-aktiviertes vernetztes Agaroseharz. (A) LDS-PAA Gel mit Western Blot Overlay von Homogenats- und Elutionsproben aus unblanched transgenen DFE-Pflanzenextrakten. Die Ernte der Pflanzen erfolgte 38, 45 oder 52 Tage nach der Aussaat. Westliche Flecken wurden mit einemAnti-His 6-Antikörper5durchgeführt. (B) Gesamtmenge der gekoppelten DFE-Affinitätsliganden in Abhängigkeit, wenn der pH-Wert und die Gesamtmasse des gereinigten DFE auf NHS-aktivierte vernetzte Agarosesäulen injiziert werden. Rote Punkte geben die tatsächlichen Experimente an, die zum Erstellen des Antwortoberflächenmodells durchgeführt wurden. (C) DFE-Affinitätssäulen nach dem Kopplungsverfahren. Die Zahlen entsprechen den Innungsbedingungen, die in Panel B hervorgehoben sind. dps = Tage nach der Aussaat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Testen der 2F5-Isolierung mit dem DFE-Affinitätsharz Der rekombinante 2F5-Antikörper wurde vorübergehend in Nicotiana Benthamiana-Pflanzen hergestellt, die in einem Phytotron5angebaut wurden. Die Erfassung von 2F5 aus dem Rohpflanzenextrakt wurde mit Affinitätssäulen in Verbindung mit 7,0 mg gereinigtem DFE (Schritt 6) getestet. Die Elution aus Protein-A-Harzen beinhaltet in der Regel einen sauren Puffer (pH 3,3)13. Daher haben wir zunächst verschiedene Low-pH-Elutionspuffer (pH 6.0–3.25) für die DFE-Spalten ausgewertet. Die Elution von 2F5 war bei pH-Werten unter 4,5 erfolgreich, wobei die höchste Erholung s35% bei pH 3,25 betrug. Allerdings inaktivierte die Low-pH-Elution sowohl den Antikörper (wie durch SPR-Spektrometrie bestätigt) als auch den DFE-Ligand (wie durch den Farbverlust und den unteren DBC angezeigt, Abbildung 3). Letzteres wurde erwartet, da native DsRed denaturiert bei pH <4.022,23. Um eine Produkt- und Ligandendenaturierung zu vermeiden, haben wir Magnesiumchlorid als alternatives Elutionsmittel getestet, da es zuvor verwendet wurde, um mAbs aus anderen Affinitätsharzen zu entkernen24. Eine Magnesiumchloridkonzentration von 1,25 m reichte aus, um 2F5 aus dem DFE-Affinitätsharz mit einer Rückgewinnung von 105 x 11 % (SD, n=3) und einer Reinheit von 97 x 3 % (SD, n=3) zu entkernen. Diese Leistung war vergleichbar mit Protein A Harzen25,26. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) des DFE-gereinigten 2F5-Antikörpers und des synthetischen Ligandfuzeons betrug 791 pM, während das eines Protein A-gereinigten Gegenstücks 763 pM5betrug. Darüber hinaus wurden im Harz über insgesamt 25 Binde- und Elutezyklen kein nennenswerter Farbverlust beobachtet. Der DBC des DFE-Affinitätsharzes bei 10% 2F5 Durchbruch sank linear im Laufe von 25 Zyklen auf 15% des Ausgangswertes (Abbildung 3). Abbildung 3: Testen der Isolierung von 2F5 aus geklärten Pflanzenextrakten mit den DFE-Affinitätsharzen. (A) DFE-Affinitätsharze nach einem Elutionszyklus mit Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten im Bereich 4.0–3.0 und den gleichen Harzen nach einem Neutralisationsschritt bei pH 6.0. (B) DFE-Affinitätsharze nach einem und sechs Zyklen 2F5-Reinigung mit 1,25 m oder 4,00 m Magnesiumchlorid als Eluent. (C) Chromatogramme von Frontalbelastungsexperimenten (Durchbrüche), um die zyklusabhängige dynamische Bindungskapazität von DFE-Harz unter Verwendung von Magnesiumchlorid als Eluent zu bestimmen. Die Durchbrüche wurden für 4,0 M und 1,25 M Magnesiumchlorid-Elutionspuffer und verschiedene Zykluszahlen gemessen. (D) Zyklusabhängige dynamische Bindungskapazität von DFE mit 1,25 M Magnesiumchlorid als Eluent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Anwendungen des neuartigen Affinitätsharzes

Wir haben gezeigt, dass kundenspezifische Affinitätschromatographieharze für die Aufnahme von mAbs hergestellt werden können, indem ein Liganden, der ein mAb-spezifisches Epitop enthält, zu NHS-aktivierter vernetzter Agarose immobilisiert wird. Um ein solches Harz zu entwerfen, war es notwendig, die Epitopsequenz zu kennen und ein lineares Epitop zu verwenden. Die resultierenden Harze sind vorteilhaft für die Erfassung von mAbs, da sie möglicherweise teure Protein-A-Affinitätschromatographieschritte ersetzen könnten. Die Wechselwirkung zwischen 2F5 und DFE in unserer Fallstudie wurde durch Epitop-Paratopbindung vermittelt, daher sollte unser Liganden selektiver sein als Protein A, das an die Fc-Region der meisten murinen und menschlichen IgGs bindet. Da für jeden mAb individuelle Liganden benötigt werden, kann unsere Methode zunächst vor allem für Antikörper geeignet sein, die in sehr großem Maßstab produziert werden. Durch die Kombination unseres Ansatzes mit einer schnellen pflanzlichen transienten Proteinexpression können jedoch neue Affinitätsliganden in weniger als 2 Wochen²⁷ mit minimalem Aufwand²⁸zubereitet werden. Daher eignet sich das Verfahren auch für die kleinräumige mAb-Reinigung.

Produktion und mögliche Verbesserungen der Affinität Ligand

Pflanzen bieten eine schnelle und sichere Produktionsplattform für Affinitätsliganden⁵^,²⁹^,³⁰, wie das DFE-Fusionsprotein, das in unserer Fallstudie vorgestellt wird. Das Blanchieren des Pflanzenmaterials reduzierte die Menge an Wirtszellproteinen in einem einzigen Schritt erheblich und wurde problemlos in eine Standard-Klärungsroutine integriert. Allerdings war die Rückgewinnung des Liganden im aktuellen Aufbau gering, wahrscheinlich aufgrund seiner moderaten thermischen Stabilität und einiger unspezifischer Bindung an die Filterschichten, wie für andere Produkte berichtet³¹^,³²^,³³. Die Entwicklung des Trägers zur Erhöhung seiner thermischen Stabilität kann daher dazu beitragen, die Ligandenausbeute in Zukunft zu verbessern, wie für den Malaria-Impfstoff-Kandidaten CCT, das Antitumor-Enzym PpADI oder ein mesophiles³⁵^,³⁶. Dasselbe gilt für den Tiefenfiltrationsschritt, bei dem die Proteintechnik dazu beitragen kann, die unspezifische Bindung an das Filtermaterial³⁷zu reduzieren. Die Produktionskosten für DFE und ähnliche Liganden könnten auch durch die Verbesserung der Gesamteffizienz der Klärung mit Flockungsmitteln oder Filterzusätzen³⁸^,³⁹reduziert werden.

Wenn DsRed als Träger verwendet wird, bildet es einen tetramerischen Komplex. Dies ist vorteilhaft, da es die Anzahl der Epitope pro Liganden erhöht, aber es kann auch den Liganden anfälliger für Demontage oder Denaturierung während der Affinitätschromatographie machen. Ein monomeres Trägerprotein wie mCherry kann daher vorzuziehen sein, da es bei niedrigem pH-Wert⁴⁰stabil ist und die Einbeziehung von Tandemwiederholungen des Epitops die Avidität des Liganden erhöhen und damit die Harzkapazität erhöhen würde⁵^, ²⁶ ^, ⁴¹. Bei einfachen Träger-Epitop-Proteinen (d. h. solchen ohne Disulfidbindungen oder posttranslationalen Modifikationen) können mikrobielle Produktionssysteme die Herstellungskosten senken und die Liganden mit Protein A wettbewerbsfähiger machen. Zum Beispiel wurde grünes fluoreszierendes Protein in Bakterienzellen mit einer Ausbeute von 1 g-kg^-1 Biomasse exprimiert, was die Ligandenproduktionskosten deutlich senken würde⁴².

Unabhängig vom Expressionswirt war während der Kopplung eine gereinigte Affinitätsligadeand erforderlich, um die Immobilisierung von Wirtszellproteinen oder Medienkomponenten zu minimieren, die ansonsten die Selektivität und Kapazität des Harzes reduzieren können. Die Aufnahme eines Polyhistidin-Tags für die IMAC-Reinigung erhöhte die Reinheit in einem einzigen Schritt auf 90 %, was eine schnelle und kostengünstige Ligandenproduktion⁵^,⁴³^,⁴⁴ermöglicht. Die Position des Fusionstags ist jedoch wichtig, da es das Potenzial hat, die Epitopbindung sterisch zu behindern oder die Spaltung des Tags oder des Epitops vom Träger⁴⁵^,⁴⁶zu induzieren.

Immobilisierung des Affinitätsligandens auf NHS-aktivierten Chromatographiesäulen

Die Immobilisierung erfolgte manuell oder mit einem Chromatographiesystem. Die geringen Puffervolumina pro Kolonne schienen die manuelle Handhabung zu begünstigen (z.B. aufgrund der minimalen Abfallmengen). Wenn jedoch mehrere/größere Säulen benötigt werden, erleichtert das Chromatographiesystem die Steuerung der Kopplungsbedingungen (z. B. regulierte Durchflussraten) und ist daher eher zu reproduzierbaren Ergebnissen in Bezug auf DBC. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der Kopplungspuffer und der pH-Wert einen wichtigen Einfluss auf die Kopplungseffizienz und die Gesamtsäulenkosten haben. Screening-Faktoren, die die Kopplungsreaktion beeinflussen und sie für jedes Trägerprotein (oder sogar für jede Träger-Ligand-Fusion) anpassen, könnten daher die Kopplungseffizienz und Harzleistung verbessern, und wir empfehlen diesen Ansatz.

Testen der 2F5-Isolierung mit dem DFE-Affinitätsharz

Produktausbeute und Reinheit sind wichtige Aspekte der Harzleistung, und bei DFE erreichten wir eine Ausbeute von 105 x 11 % (SD, n=3) und eine Reinheit von 97 x 3 % (SD, n=3), die mit der Leistung von Benchmark-Protein-A-Harzen²⁵ ^{vergleichbar ist. ,}²⁶. Ein weiterer wichtiger Leistungsindikator für Harze im Allgemeinen (und insbesondere für solche, die auf Affinitätsliganden basieren) ist der DBC bei 10% Produktdurchbruch, da dieser Parameter die für einen bestimmten Prozess benötigte Harzmenge und damit die Kosten beeinflusst. Für den DFE-Ligand betrug der anfangse DBC L^-1 Harz, das unter ähnlichen Bedingungen 13 % des entsprechenden Wertes für Protein A beträgt (nur 2 min Kontaktzeit)²⁵^,^47, aber etwa 15-fach höher im Vergleich zu anderen kundenspezifischen Affinitätsharzen wie Anti-FSH-Immunoaffinitätligand mit der gleichen Verweilzeit von 2 min⁴⁸. Die DBC von DFE sank auf 15% des Startwertes nach 25 Bind-and-Elute-Zyklen, während mehr als 50 Zyklen für den gleichen Verlust von DBC in kommerziellen Protein A Harzen⁴⁹erforderlich sind. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass unser Träger noch nicht im gleichen Maße optimiert wurde wie Protein A, das in den letzten vier Jahrzehnten umfassend untersucht und verbessert wurde⁸.

Bisher haben wir die Harzstabilität und Produktrückgewinnung verbessert, indem wir von einem niedrigen pH-Elutionspuffer auf eine hohe Konzentration von Magnesiumchlorid umgestellt haben (Abbildung 3), wie in früheren Studien^{empfohlen 13}. Die charakteristische rote Farbe des Affinitätsligands verblasste während der 25 Binde-und-Elut-Zyklen nicht wesentlich, so dass wir spekulieren, dass endogene Pflanzenproteasen in den geklärten Pflanzenextrakten³¹ das Epitop von den Liganden. Daher kann das Entwerfen von proteaseresistenten Linkern, um den Träger und das Epitop zu verbinden, dazu beitragen, den anfänglichen DBC über eine längere Anzahl von Zyklen aufrechtzuerhalten. Angesichts der schnellen und einfachen Expression und Reinigung des DFE-Ligands, seiner einfachen Kopplung an kommerzielle Chromatographieharze und seiner hervorragenden Produktausbeute und -reinheit glauben wir, dass unsere Methode eine geeignete Alternative zu Protein A für die Reinigung von mAbs und Antikörperderivaten, die nicht an Protein A binden, insbesondere wenn Verbesserungen am Träger und Linker die DBC- und Ligandenstabilität verbessern können. Diese Annahme wurde durch den geringen Unterschied in der Dissoziationskonstante von DFE-gereinigtem und Protein A-gereinigtem 2F5-Antikörper⁵gestützt, was darauf hindeutet, dass unser neuer Affinitätsligand die Rückgewinnung hochwertiger mAbs ermöglicht.

Vorteile und aktuelle Einschränkungen der Methode

Die Herstellung des Affinitätsligands als genetische Fusion mit einem Trägerprotein erhöht die Löslichkeit in wässrigen Puffern und damit die Kompatibilität mit typischen Liganden-Kopplungsbedingungen. Im Gegensatz dazu können blanke Peptide, die aus der Volumenphasenpeptidsynthese abgeleitet werden, aufgrund ihrer Sequenz⁵⁰eine begrenzte Löslichkeit aufweisen, die nicht geändert werden kann, da sie durch die vom mAb erkannte Aminosäuresequenz des Epitops gereinigt werden. Andere haben daher eine On-Harz-Synthese von Peptid-Ligen⁵¹verwendet. Die statische Bindungskapazität des resultierenden Harzes war hoch (ca. 80 g L^-1), aber der Prozess der Harzvorbereitung ist langwierig, eine dynamische Bindungskapazität wurde nicht gemeldet und die erhaltene Reinheit und Rückgewinnung waren niedriger als in unserem Ansatz. Ein weiterer Vorteil eines Fusionsproteinsligenden im Labormaßstab ist, dass der Ligand und dessen Varianten schnell in einem einfach zu bedienenden High-Through-Expressionssystem⁵²mit minimalem Aufwand produziert, gereinigt und getestet werden können.

Die beiden aktuellen Einschränkungen der hier vorgestellten Methode sind die geringe dynamische Bindungskapazität von 3 L^-1 und seine 90%ige Reduktion im Laufe von 25 Binde-und-Elut-Zyklen⁵. Diese Einschränkungen können in Zukunft durch weniger strenge Belastungsbedingungen und den Austausch des aktuellen DsRed-Trägers durch eine konstruierte, stabilere Variante behoben werden. Beispielsweise hat die Verdoppelung der aktuellen Kontaktzeit von 2 auf 4 Minuten das Potenzial, die dynamische Bindungskapazität zu verdoppeln, wie für einige Protein A Harze²⁶gezeigt wurde.

Problembehandlung

In der folgenden Tabelle werden potenzielle Probleme aufgezeigt, die während dieses Protokolls auftreten können, und es werden Hinweise zur Lösung dieser Probleme (Tabelle1) angezeigt.

Tabelle 1: Potenzielle Probleme, die auftreten können, und mögliche Korrekturen.
Protokollschritt	problem	Couse	Lösung
1	Pflanzen wachsen nicht	Gefährdete Wachstumsbedingungen	Überprüfen Sie den pH-Wert und die Leitfähigkeit des Düngers
			Überprüfen Sie die Temperatur- und Lichtverhältnisse
2 und 3	Große Mengen an Wirtszellproteinen sind nach der Extraktion vorhanden	Unvollständiger Niederschlag	Überprüfen Sie die Temperatur während des Blanchierens
			Überprüfen Sie die Rührung im Blanchierungsbad
2 und 3	Kein Produkt im Pflanzenextrakt gefunden	Blanchiertemperatur zu hoch	Temperatur und pH-Wert beim Blanchieren prüfen
		pH-Wert im Blanchierungspuffer zu niedrig
3	Große Stamm- oder Blattteile bleiben nach der Extraktion	Unvollständige Mischung im Mixer	Stellen Sie sicher, dass das Pflanzenmaterial keinen Stecker im Mixer bildet
3	Schnelle Druckerhöhung bei tiefen Filtration	Falsche Filterauswahl und/oder Ausrichtung	Überprüfen Sie den Filtertyp und die Ausrichtung
4	Wenig Fusionsprotein während der Elution / viel Fusionsprotein im Durchfluss	IMAC-Harz wurde nicht mit Metallionen aufgeladen	Prüfen Sie, ob das IMAC-Harz korrekt mit Ionen aufgeladen wurde
		Fusion-Protein verlor das Affinitäts-Tag	Vermeiden Sie intensives Sonnenlicht und hohe Temperaturen während des Pflanzenanbaus
4	Fusionsprotein während der Konzentration verloren	Fusionsprotein an die Membran gebunden	Überprüfen Sie den Membrantyp
			Stellen Sie sicher, dass der Konzentrationsfaktor nicht zu hoch war
5	Geringe Kupplungsausbeute	Falsche Reihenfolge der Kopplungreagenzzugabe	Überprüfen Sie die Reagenzienetiketten und die Reihenfolge der
		Falsche Vorbereitung der Säulen vor der Kopplung	Überprüfen Sie die Bedingungen der Säulenvorparaiton
5 und 6	Niedriger mAb-Ertrag	Niedrige mAb-Expression in der pflanzlichen Biomasse	Test mAb-Expression in Biomasse
		Niedrige Ligandendichte	Überprüfen Sie die Reinheit der Fusionsproteinzubereitung
7	Sehr niedrige/hohe Proteinkonzentrationen in Bradford Assay	Blasenbildung beim Pipetieren	Prüfen Sie auf Blasen im 96-Well-Palte
7	Niedrige mAb-Konzentration bei SPR-Messung	Compromised Protein A Chip	Vergleichen Sie mit den Ergebnissen der Standard-mAb mit bekannter Konzentration
		Falsche Probenverdünnung	Überprüfen Sie die Verdünnungsrate und den Puffer

Tabelle 1: Trouble-Shooting.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Ibrahim Al Amedi für den Anbau der transgenen Tabakpflanzen und Dr. Thomas Rademacher für die Bereitstellung des Tabakexpressionsvektors danken. Die Autoren danken Dr. Richard M. Twyman für die redaktionelle Unterstützung und Markus Sack für die fruchtbaren Diskussionen über die DFE-Affinitätsliganandstruktur. Diese Arbeit wurde zum Teil von der Fraunhofer-Gesellschaft Interne Programme unter Grant No. Attraktion 125-600164 und das Land Nordrhein-Westfalen unter dem Leistungszentrum Zuschuss Nr. 423 “Vernetzte, adaptive Produktion”. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Forschungstrainings “Tumor-targeted Drug Delivery” gefördert. GE healthcare unterstützte die Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels.

Materials

10L/20L Bucket	n/a	n/a	Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
ÄKTApure	GE Helthcare	29018226	Chromatography system
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Centrifuge
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Antibody 2G12	Fraunhofer IME	n/a	Standard for SPR quantification
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Bag filter
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chelating Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	Chromatography resin
Cond 3320	WTW	EKA 3338	Conductometer
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Multichannel pipette
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Diverse bottles	Schott Duran	n/a	Glas bottles
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Heat block
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Buffer component
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plate reader
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Thermometer
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraction collector
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200	Hettich	2400	Centrifuge
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatography columns
Hydrochloric acid	Carl Roth GmbH	4625.1	Buffer component
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	Buffer component
K700	Pall	5302305	Depth filter layer
KM02 basic	IKA	n/a	Magnetic stirrer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Immersion circulator
Magnesium chloride	Carl Roth GmbH	KK36.2	Buffer component
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm	Sartorius	16534K	Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate	Carl Roth GmbH	T111.1	Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer	Invitrogen	NP0002	Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant	Invitrogen	NP0005	Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Perforated bucked	n/a	n/a	Blanching
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatography resin
Silicone spoon	n/a	n/a	Spoon
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Gel staining solution
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	6773.1	Buffer component
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	X891.1	Media component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-100G	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Buffer component
Sodium citrate	Carl Roth GmbH	HN13.2	Buffer component
Sodium bisulfite	Carl Roth GmbH	243973-100G	Media component
Sodium phosophate	Carl Roth GmbH	T877.2	Media component
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR device
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L	Clatronic	n/a	Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL	B. Braun	4606027V	Syringes
Syringe adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Syringe adapter
TE6101	Sartorius	TE6101	Precision scale
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Buffer component
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Chromatography software
Vacuum bags	Ikea	203.392.84	Plant storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
XK-26/20 column housing	GE Helthcare	28-9889-48	Chromtography column

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Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins – Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

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