Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Matthias Kn&#246;dler; Clemens R&#252;hl; Patrick Opdensteinen; Johannes  F. Buyel

doi:10.3791/59933

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Biochemistry

Agarose interconnectée activée pour le développement rapide des résines de chromatographie d'affinité - Capture d'anticorps comme étude de cas

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/59933

Matthias Knödler^1,3, Clemens Rühl², Patrick Opdensteinen^1,3, Johannes F. Buyel^1,3

¹Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ²Sanofi Deutschland GmbH, ³Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

Dans cette procédure, un ligand épitope à base de DsRed est immobilisé pour produire une résine d’affinité très sélective pour la capture d’anticorps monoclonaux à partir d’extraits de plantes brutes ou de supernatants de culture cellulaire, comme alternative à la protéine A.

Abstract

La purification des anticorps monoclonaux (mAbs) est généralement réalisée par la chromatographie d’affinité de protéine A, qui peut expliquer jusqu’à 25% des coûts globaux de processus. D’autres étapes de capture rentables sont donc précieuses pour la fabrication à l’échelle industrielle, où de grandes quantités d’un seul maquillage sont produites. Nous présentons ici une méthode pour l’immobilisation d’un ligand épitope à base de DsRed à une résine d’agarose transversale permettant la capture sélective de l’anticorps neutralisant le VIH 2F5 à partir d’extraits de plantes brutes sans utiliser de protéines A. L’épitope linéaire ELDKWA a d’abord été génétiquement fusionné à la protéine fluorescente DsRed et la protéine de fusion a été exprimée dans le tabac transgénique (Nicotiana tabacum) plantes avant la purification par la chromatographie d’affinité métal-ion immobilisée. En outre, une méthode basée sur l’agarose interconnectée activée a été optimisée pour une densité de ligand élevé, un couplage efficace et des coûts faibles. Le pH et la composition tampon et la concentration soluble de ligand étaient les paramètres les plus importants pendant la procédure d’accouplement, qui a été améliorée en utilisant une approche de conception d’expériences. La résine d’affinité résultante a été testée pour sa capacité à lier sélectivement le mAb cible dans un extrait de plante brute et le tampon d’élution a été optimisé pour la récupération élevée de mAb, l’activité du produit et la stabilité de résine d’affinité. La méthode peut facilement être adaptée à d’autres anticorps avec des épitopes linéaires. Les nouvelles résines permettent des conditions d’élution plus douces que les protéines A et pourraient également réduire les coûts d’une première étape de capture pour la production de mAb.

Introduction

Les produits biopharmaceutiques sont importants pour le traitement d’un large éventail de maladies dans presque toutes les branches de la médecine¹. Les anticorps monoclonaux (mAbs) dominent le marché biopharmaceutique, avec des ventes mondiales qui devraient atteindre près de 110 milliards d’euros en 2020². La plate-forme d’expression favorisée pour les mAbs sont les lignées cellulaires d’ovaire sain de hamster chinois, qui produisent typiquement des titres élevés de mAb de jusqu’à 10 g-L^-1 dans le supernatant de culture³^,⁴. Cependant, la production de mAbs dans les cultures cellulaires de mammifères est coûteuse en raison du coût élevé du milieu et de la nécessité d’une fermentation stérile⁵. Les plates-formes d’expression alternatives telles que les usines offrent potentiellement une approche plus rapide, plus simple, moins chère et plus évolutive pour la fabrication industrielle⁶^,⁷.

En plus des coûts associés aux cultures cellulaires de mammifères, l’utilisation répandue de la chromatographie d’affinité de protéine A pour la capture de produit est un moteur important de coût pour la production industrielle des mAbs. La protéine A se trouve naturellement à la surface des cellules de Staphylococcus aureus et elle se lie à la région cristallable fragment (Fc) de certains anticorps murins et humains, agissant ainsi comme un mécanisme de défense pour échapper au système immunitaire humoristique⁸. La protéine A est devenue l’étalon-or de l’industrie pour la capture des mAbs des supernatants de culture cellulaire et est également largement utilisée par la communauté de recherche parce qu’elle est très sélective, atteignant généralement des puretés de mAb de 95% en une seule étape⁸. Sans surprise, les ventes de protéines A au cours des deux dernières décennies ont étroitement reflété les ventes de mAbs⁸. Selon l’échelle de production, les coûts de la protéine A peuvent correspondre à plus de 25 % des coûts totaux du processus et affecter ainsi le prix du marché des mAbs thérapeutiques, qui peuvent atteindre 2 000 g^-1⁵^,⁹. Par conséquent, les résines de chromatographie alternatives avec une performance de purification similaire ont le potentiel de réduire considérablement les coûts de production, rendant les thérapies à base d’anticorps accessibles à un plus grand nombre de patients¹⁰^,¹¹ ^,¹². De telles alternatives peuvent également contourner les inconvénients de la chromatographie de protéine A, y compris les conditions dures d’élution à bas pH (typiquement ‘lt;3.5) qui peuvent potentiellement causer des mAbs pour subir des changements conformationnels qui favorisent l’agrégation¹³ . Fait important, la protéine A n’est sélective que pour la région Fc de certaines sous-classes IgG, de sorte que les molécules non fonctionnelles avec des domaines de liaison tronqués peuvent co-purifier avec le produit intact⁵, tandis que les dérivés mAb tels que les fragments variables à chaîne unique ne se lient pas du tout à la protéine A.

Ici, nous décrivons une résine de chromatographie alternative d’affinité pour la capture du mAb 2F5 HIV-neutralisant utilisant son épitope linéaire ELDKWA (code d’acide aminé d’une lettre)⁵^,¹⁴. Nous avons génétiquement fusionné l’épitope 2F5 au terminus C de la protéine fluorescente DsRed, qui a fonctionné comme une molécule porteuse et reporter, et produit la protéine résultante DsRed-2F5-Epitope (DFE) dans le tabac transgénique ( Nicotiana tabacum) plantes. DFE a été purifié par la chromatographie immobilisée d’affinité métal-ion immobilisée d’une seule étape (IMAC). L’immobilisation de la ligand d’affinité d’AFE purifiée sur une résine d’agarose transversale a été réalisée par couplage chimique utilisant des colonnes d’agarose croisées activées par N-hydroxysuccinimide (NHS). Des conceptions expérimentales statistiques ont ensuite été utilisées pour optimiser la procédure d’immobilisation et l’efficacité du couplage¹⁵. La stratégie de purification du mAb 2F5 a été évaluée en termes de pureté des anticorps, de rendement et de stabilité du ligand. Contrairement à la protéine A, qui lie la région de Fc, DFE lié à la région de complémentarité-déterminante de 2F5, assurant la purification des molécules avec un paratope intact. Notre concept peut facilement être adapté à n’importe quel mAb avec un épitope linéaire ou à d’autres ligands d’affinité à base de peptides qui peuvent être facilement identifiés par les études de microarray¹⁶.

Figure 1 : Schéma de flux de processus pour la préparation de résines d’affinité épitope qui peuvent être utilisées pour la capture de mAbs à partir d’extraits de plantes brutes ou de supernatants de culture cellulaire. (A) Le ligand d’affinité DFE a été exprimé dans les usines transgéniques de tabac. Une étape de précipitation de chaleur (B) a été incluse avant que les feuilles récoltées soient homogénéisées (C). (D) L’extrait brut de l’usine a été clarifié par filtration de sac, filtration de profondeur et filtration stérile de 0,2 m. (E) DFE a ensuite été purifié par l’IMAC. (F, G) Le ligand d’affinité d’EdFE purifié a été immobilisé sur les colonnes d’agarose croisées activées par EDC/NHS. (H) Les cultures bactériennes portant l’anticorps anticodage T-ADN 2F5 ont été utilisées pour l’expression transitoire dans les plantes De. benthamiana (I) cultivées dans un phytotron. (J) Les feuilles de N. benthamiana ont été récoltées et traitées comme décrit dans D. (K) mAb 2F5 a été purifiée à partir de l’extrait clarifié à l’aide des colonnes d’affinité DFE (L). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protocol

1. Cultiver les plantes de tabac transgéniques REMARQUE: La conception de la protéine de fusion DFE et la génération de plantes transgéniques sont décrites ailleurs5,17. Germer les semis transgéniques de tabac dans le sol. Irriguer les plantes avec un 1,0 g L-1 solution d’engrais. Transférer les plantes dans des pots simples de 100 mm x 100 mm x 60 mm (longueur, largeur, hauteur) lorsqu’elles atteignent un diamètre de 0,04 m. Cultiver les plants de tabac transgéniques dans une serre à feu de 16 h (25/22 oC de lumière/régime de température foncée), avec une humidité relative de 70 % et une fertilisation automatisée avec un régime de 1,0 g L-1 solution d’engrais pendant 15 min toutes les heures. Après 7 semaines, récoltez toutes les feuilles sauf les quatre feuilles de cotylédon à la base de la tige de la plante. Traiter immédiatement les feuilles récoltées comme décrit ci-dessous. 2. Précipitation de chaleur des protéines de cellules hôtes Mettre en place un bain d’eau avec un volume de travail de 20 L dans un récipient chauffé en acier inoxydable (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). Au début, placez une pompe magnétique dans le bain d’eau pour agiter le liquide de façon permanente avec un débit de 5 L min-1. Montez un thermostat réglable sur le bain d’eau pour le contrôle de la température (étapes 2.4 et 2.8).MISE EN GARDE: Toutes les étapes suivantes jusqu’à 2.10 impliquent la manipulation du liquide chaud. Portez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des lunettes thermiquement isolés. Ajouter 15 L d’eau déionisée au bain d’eau et chauffer le liquide à 70 oC. Placez un seau de 10 L rempli de 5 L d’eau déionisée sur un agitateur magnétique. Ajouter le phosphate de sodium à une concentration finale de 120 mM. Ajuster le pH à 8,14 à l’aide de 10 M d’acide chlorhydrique. Lorsque tous les composants se sont dissous, ajouter le tampon de blanchiment concentré (5 L) qui en résulte au bain d’eau à partir de l’étape 2.2. Agiter le bain d’eau jusqu’à ce que la température atteigne 70 oC. Utilisez 10 M d’acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 8,14 si nécessaire. Continuer à agiter pendant au moins 15 min après la température et le pH requis pour s’assurer que l’ensemble de l’assemblage est en équilibre thermique. Préparer un seau de 20 L (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) rempli d’eau déionisée à une température de 17 oC (obligatoire pour l’étape 2,9). Préparer 400 g d’aliquots des feuilles de tabac récoltées à partir de l’étape 1.3. Placer un aliquot dans un panier perforé (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; largeur des pores d’au moins 0,02 m x 0,02 m). Évitez de trop remplir le panier avec du matériel végétal ou d’emballer les feuilles trop étroitement pour éviter d’endommager le tissu. Immerger complètement le panier dans le tampon de blanchiment chaud de l’étape 2.4 et assurez-vous que toutes les feuilles restent sous la surface liquide. Utilisez une cuillère thermostable en silicone pour tenir les feuilles sous la surface si nécessaire. Incuber les feuilles de tabac pendant 1,5 min dans le liquide de blanchiment pendant que la pompe agite encore le liquide. Surveillez la température du liquide pendant toute la période d’incubation. Évitez de bloquer l’inlet de la pompe avec des feuilles de tabac. Retirer le panier de feuilles de tabac du tampon de blanchiment et égoutter le tampon résiduel des feuilles pendant 30 s. Transférer le panier dans le seau rempli d’eau froide (à partir de l’étape 2.5) et immerger les feuilles pendant 30 s. Enlever le panier et égoutter l’eau résiduelle du le aves pour 30 s avant homogénéisation (étape 3). Répétez les étapes 2,6 à 2,9 avec des aliquots frais de 2,6 jusqu’à ce que toute la biomasse récoltée soit traitée. Surveillez et ajustez constamment le pH et la température du tampon de blanchiment dans le bain d’eau.REMARQUE: Les matières végétales blanchies peuvent être stockées sur la glace jusqu’à 30 min lorsque plusieurs cycles de blanchiment sont nécessaires pour traiter toute la biomasse. Les feuilles blanchies peuvent également être conservées dans des sacs scellés sous vide à 80 oC pendant au moins 3 semaines. Cependant, un traitement immédiat est recommandé parce que le stockage prolongé peut réduire le rendement DuFE. 3. Extraction et clarification des protéines MISE EN GARDE: Les étapes suivantes impliquent un mélangeur avec des lames rotatives. Ne pas travailler dans le récipient de mélangeur lorsqu’il est actionné ou monté sur l’unité motrice. Placer 150 g (masse humide) de feuilles de tabac blanchies (étape 2,9) dans le récipient du mélangeur et ajouter 450 ml de tampon d’extraction (50 mM de phosphate de sodium, 500 mm de chlorure de sodium, 10 mM de disulfite de sodium, pH 7,5). Fermez fermement le bouchon du mélangeur pour éviter le déversement de matières végétales ou de tampons. Homogénéiser les feuilles pendant 3x pendant 30 s, avec 30 s pauses entre chaque impulsion. Assurez-vous que toutes les feuilles sont homogénéisées et qu’aucune ne colle au sommet du récipient du mélangeur. Si nécessaire, ouvrez le mélangeur pendant les pauses et poussez vers le bas les feuilles qui collent à la partie supérieure du récipient, à l’aide d’une cuillère en silicone propre. Après homogénéisation, prélever un échantillon de 1,0 ml de l’homogénéisme pour une analyse ultérieure (étape 7). Recueillir l’homogénéisme dans un navire de taille adéquate (p. ex. si vous travaillez avec une biomasse totale de 1,0 kg, utilisez un navire d’une capacité d’au moins 5 L). Répétez les étapes 3.1 à 3.3 jusqu’à ce que toute la biomasse blanchie soit homogénéisée. Montez un filtre à sac dans un masquage de filtre et placez un autre navire de taille adéquate (voir 3.4) sous l’assemblage. Appliquer l’homogénéisme sur le filtre du sac à une vitesse de 0,15 L min-1. Prélever des échantillons du sac filtrate après chaque litre pour l’analyse ultérieure (étape 7) et mesurer la turbidité de la piscine de filtrate sac comme une dilution 1:10 dans le tampon d’extraction à l’aide d’un turbidimètre ou un dispositif similaire. Clarifier davantage la piscine de filtrate sac en utilisant 0,02 m2 d’un K700 (en haut) et KS50 (bas) combinaison de couche de filtre de profondeur par litre de piscine de filtrate sac. Appliquer un débit de 3,0 L min-1m-2 jusqu’à une pression maximale de 0,2 MPa. Ensuite, retirez les particules résiduelles en passant le filtrate clarifié à travers un filtre stérile de 0,2 m tel que décrit précédemment5. 4. Purification de la Ligand d’affinité DFE Préparer un système de chromatographie liquide à protéines rapides en rinçant avec un tampon d’élution (10 mM de phosphate de sodium, 300 mM d’imidazole, pH 7,4), un tampon de lavage (10 mM de phosphate de sodium, pH 7,4) et un tampon d’équilibre (20 mM de phosphate de sodium, 500 mM de chlorure de sodium, pH 7,4). Monter une colonne contenant 50 ml de résine d’agarose trachée par kilogramme de biomasse folique (filtrate de profondeur de 2,5 L). Chargez la colonne avec des ions nickel en appliquant 5 volumes de colonne (CV) de 200 mM de sulfate de nickel solution et laver avec 5 CV de tampon d’élution. Utilisez un débit de 50 cm h-1 et surveillez les signaux UV à 260, 280 et 558 nm pour toutes les étapes de chromatographie ultérieures. Équilibrez la colonne avec 10 CV de tampon d’équilibre. Chargez ensuite 50 CV de l’extrait de plante clarifié (à partir de l’étape 3.6) sur la colonne conditionnée. Laver la colonne avec 10 CV de tampon de lavage. Elute la protéine de fusion DFE avec 5 CV tampon d’élution et de recueillir la fraction contenant le produit une fois que les signaux UV à 280 nm et 558 nm ont augmenté à plus de 5 mAU au-dessus de la ligne de base. Prenez un échantillon de 0,2 ml de la fraction d’élution afin de mesurer la concentration totale de protéines solubles (TSP) (étape 7.1), la concentration de DFE (étapes 7.2 et 7.3), et la pureté d’EsTO (étape 7.4). Monter une colonne contenant 50 ml de résine dextran reliée croisée sur un système de chromatographie. Équilibrez la colonne avec 5 CV de tampon de couplage (200 mM HEPES, 500 mM de chlorure de sodium, pH 8,5). Injecter 10 ml de la fraction d’élution DFE (étape 4.4) pour l’échange de tampons et surveiller l’absorption UV à 280 et 558 nm. Recueillir la fraction contenant du DFE une fois que les signaux UV à 280 nm et 558 nm ont augmenté à plus de 5 mAU au-dessus de la ligne de base. Prenez un échantillon de 0,2 ml et déterminez la concentration de TSP, la concentration de DFE et la pureté DFE (étape 7). Concentrez l’échantillon purifié de DFE (de l’étape 4.7) à 15 g L-1 à l’aide d’un tube de concentrateur centrifuge à 3 000 x g à 4 oC pendant 30 min dans une centrifugeuse. Continuer avec la réaction d’accouplement (étape 5).REMARQUE: Entreposez la solution DFE à 4 oC si les étapes de concentration ou d’accouplement ne peuvent pas être effectuées immédiatement. 5. Couplage d’Adoumois DFE à la résine d’Agarose REMARQUE: Ne remplacez pas l’isopropanol utilisé pour le stockage des colonnes activées par le NHS jusqu’à ce que tous les équipements et solutions pour le couplage soient prêts. Ne laissez jamais les colonnes s’assécher. Configurer un modèle d’expériences (DoE) pour optimiser le couplage de DFE à la résine activée, avec le pH, la composition tampon et la concentration DFE comme facteurs. Les détails de la méthode DoE sont décrits ailleurs15. Préparer la solution ligand d’affinité (à partir de l’étape 4.8) dans une plage de concentration de 0,5 à 15 g L-1 ou tel que défini dans le DoE et le stocker sur la glace jusqu’à ce que la réaction d’accouplement soit prête (étape 5.5). Remplissez au moins dix seringues de 2 ml avec la solution DFE et préparez un adaptateur pour monter les seringues sur les colonnes d’agarose croisées activées par le NHS avec un volume de lit de 1,0 mL. Pour chaque 10 colonnes utilisées pour le couplage, préparer 30 ml de solution de désactivation (0,5 M d’éthanolamine, 0,5 M de chlorure de sodium, pH 8,3), 30 mL de solution à faible teneur en pH (0,1 M d’acétate de sodium, 0,5 M de chlorure de sodium, pH 4,0) et 10 mL de solution de stockage (0,05 M de phosphate de disodium , 0,1 % (m/v) azide de sodium, pH 7,0). Préparer 20 ml d’acide chlorhydrique de 1 mm dans un tube et l’incuber sur la glace pendant au moins 20 min. Préparer une balance de précision pour surveiller les fractions d’écoulement pour toutes les étapes pendant la réaction d’accouplement (étape 5.7). Ouvrez une colonne d’agarose reliée croisée activée par le NHS et montez l’adaptateur de seringue à l’entrée de colonne. Empêchez tout air d’entrer dans la colonne en appliquant une goutte de tampon sur l’entrée de l’adaptateur avant de la connecter à la seringue. Laver la colonne avec 6 ml d’acide chlorhydrique glacé de 1 mm (à partir de l’étape 5,4) à un débit de 1 ml min-1 et passer immédiatement à l’étape 5,7. Injecter 1,5 ml de solution DFE (étape 5.2) à l’aide d’une seringue de 2 ml à un débit de 1 ml min-1 et recueillir la fraction de débit sur une échelle de précision (étape 5.4) pour une analyse ultérieure (étape 7). Scellez la colonne aux deux extrémités et incubez pendant 15 à 45 min à 22 oC, selon la configuration du DoE. Injecter 6 ml de solution de désactivation suivie de 6 ml de solution à faible pH à un débit de 1 ml min-1 pour éliminer les ligands non-covalents de la résine. Ensuite, injectez 6 ml de solution de désactivation et incubez la colonne pendant 15 min. Injecter 6 mL de solution à faible pH dans la colonne, suivie de 6 ml de solution de désactivation. Puis injecter un autre 6 ml de solution à faible pH dans la colonne. Injecter 2 ml de solution de stockage dans la colonne et stocker à 4 oC. 6. Test de la purification des mAbs à partir d’extraits de plantes clarifiées Préparer 100 ml d’extrait végétal clarifié contenant 2F55 ou le supernatant du système d’expression cellulaire préféré, contenant également 2F5. Préparer un tampon d’équilibre (20 mM de phosphate de sodium, 500 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), un tampon d’élution à faible pH (0,05 M de citrate, 0,05 M de chlorure de sodium, pH 4,0 à 3,25) et un tampon d’élution à haute résistance ionique (1,0 à 4,0 M de chlorure de magnésium, 0,1 M HEPES, pH) Rincer le système de chromatographie avec les tampons. Monter une colonne d’affinité DFE (à partir de l’étape 5.10) sur le système de chromatographie et équilibrer avec 5 CV de tampon d’équilibre à un débit de 1,0 ml min-1. Surveillez l’absorption UV à 280 nm.REMARQUE: Chargement de l’extrait de plante ou de la culture cellulaire supernatant sur la colonne peut provoquer une augmentation de la contre-pression. Définir une alerte haute pression à 0,2 MPa pour éviter d’endommager le système de chromatographie ou la colonne DFE. Chargez 80 ml de l’extrait ou du supernatant de plante clarifié (étape 6.1) sur la colonne à un débit de 0,5 ml min-1 pour garantir un temps de contact de 2 min. Recueillir les échantillons de débit en 2 ml de fractions pour la reconstruction de la courbe de percée (étape 7.3). Entreposez les échantillons à débit à 4 oC si une analyse immédiate de l’échantillon n’est pas possible. Laver la colonne avec 6 CV de tampon d’équilibre. Recueillir un échantillon du lavage au début, au milieu et à la fin de cette étape. Elute mAb 2F5 avec 5 CV de tampon d’élution à faible pH ou tampon d’élution à haute résistance ionique (0,1 M HEPES, 1,25 M de chlorure de magnésium, pH 8,0). Recueillir la fraction DFE lorsque le signal UV 280 nm a augmenté à 5 mAU au-dessus de la ligne de base. Optimisez le tampon d’élution pour chaque paire d’épitope-anticorps. Pour 2F5, 1,25 M de chlorure de magnésium a atteint un équilibre optimal entre la récupération du produit et la stabilité du ligand.REMARQUE: La solution de chlorure de magnésium est sujette aux précipitations. Par conséquent, dissoudre le chlorure de magnésium dans 700 ml d’eau. Dissoudre séparément le HEPES dans 100 ml d’eau et ajuster le pH à 8,0. Ajouter la solution de chlorure de magnésium dissous à la solution HEPES et ajouter de l’eau à un volume final de 1,0 L. N’ajustez pas le pH après avoir dissous le chlorure de magnésium, car cela causera des précipitations. Analyser tous les échantillons prélevés au cours des étapes 6.4-6.6 en utilisant la méthode Bradford, le lithium dodecylsulfate polyacrylamide gel électrophoresis (LDS-PAGE) et la spectroscopie de résonance plasmon de surface (SPR) (étape 7). 7. Analyse de l’échantillon Mesurer la concentration de TSP à l’aide de la méthode Bradford18,19. En triple, pipette 2,5 L de chaque échantillon dans un seul puits d’une plaque de 96 puits. Utilisez huit normes d’albumine de sérum bovin (BSA) en triplicate couvrant la gamme 0-2,000 mg L-1. Ajouter 200 l de réactif Bradford à chaque puits et mélanger en pipetting doucement de haut en bas. Maintenez le niveau de pipette pour éviter la formation des bulles qui déforment la lecture suivante. Incuber la plaque pendant 10 min à 22 oC et mesurer l’absorption à 595 nm dans un spectrophotomètre. Calculer la concentration de TSP dans les échantillons en fonction d’une courbe standard à travers les points de référence BSA. Quantifier le DFE par fluorimétrie En triplicate, pipette 50 ‘L de chaque échantillon dans un seul puits d’une plaque noire de 96 puits demi-zone. Inclure six normes DsRed couvrant la gamme 0-225 mg L-1. Mesurer la fluorescence deux fois à l’aide d’un filtre d’excitation de 530 à 30 nm et d’un filtre d’émission de 590 à 35 nm dans un spectrophotomètre. Calculer la concentration de DFE dans les échantillons en fonction d’une courbe standard à travers les points de référence DsRed. Mesurer la concentration 2F5 par spectroscopie SPR20. Préparer le tampon de fonctionnement HBS-EP (10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 3 mM d’acide éthylènediaminetetratraacetic (EDTA), 150 mM de chlorure de sodium, 0,005% v/v Tween-20, pH 7.4) et filtre le stériliser en le passant à travers un vide de 0,2 m filtre de bouteille-dessus. Degas le tampon pendant 15 min. Connectez le tampon de fonctionnement HBS-EP à l’instrument SPR avant d’amarrer une puce de surface dextran carboxymethylée et équilibrez le système en utilisant la fonction principale. Démarrer une course manuelle avec un débit de 30 min-1 et conditionner la surface de la puce en injectant alternativement 30 mM d’acide chlorhydrique et 25 mM d’hydroxyde de sodium (deux injections chacune) sur les cellules d’écoulement 1 et 2 à un débit de 30 min ll-1 pour 1 min. Préparer 300 l d’un 500 mg L-1 Protéine Une solution en acétate de sodium de 10 mM (pH 4,0). Décongeler les flacons contenant 0,4 M 1-éthylique-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorure (EDC) et 0,1 M NHS et centrifugeuse à 16 000 x g pendant 1 min avant de mélanger 70 OL d’EDC et 70 OL de NHS. Transférer le mélange EDC/NHS et la solution Protein A sur des flacons d’échantillons en plastique de 7 mm et les placer dans le support de l’échantillon. Activez la surface de la puce dextran carboxymethylated en injectant le mélange EDC/NHS sur les cellules d’écoulement 1 et 2 à un débit de 10 min ll-1 pendant 10 min. Couple Protéine A à la surface dextran activée de carboxymethylated en injectant la solution de protéine A au-dessus de la cellule d’écoulement 2 à un débit de 15 min de L-1 pendant 15 min. Pendant l’accouplement de la protéine A, décongeler une fiole de 1,0 M d’hydrochlorure d’éthanolamine (pH 8,5) et une centrifugeuse à 16 000 x g pendant 1 min. Transférer 150 l à une fiole en plastique de 7 mm et placer dans l’instrument. Lorsque l’étape 7.3.5 est terminée, désactivez la surface de la puce en injectant la solution d’éthanolamine sur les cellules d’écoulement 1 et 2 à un débit de 10 minl -1 pendant 7 min. Conditionner la surface de la puce en injectant alternativement 30 mM d’acide chlorhydrique et 25 mm d’hydroxyde de sodium (deux injections chacune) sur les cellules d’écoulement 1 et 2 à un débit de 30 min ll-1 pendant 0,5 min. Préparer les normes de l’anticorps 2F5 dans le tampon de fonctionnement HBS-EP à une concentration de 500 g L-1 et diluer les échantillons contenant 2F5 dans HBS-EP à une concentration finale dans la gamme 20 à 1 000 g L-1. Injecter des échantillons et des normes sur les cellules d’écoulement 1 et 2 à un débit de 30 min-1 l pendant 3 min. Injecter une norme 2F5 après 15 échantillons. Soustrayez le signal des unités relatives (RU) de la cellule d’écoulement 1 (cellule de référence) du signal de la cellule d’écoulement 2 (cellule de mesure) pour chaque échantillon et calculez la concentration d’anticorps en fonction du signal RU des injections standard 2F5. Après chaque échantillon ou injection standard, régénérer la surface de la puce en injectant 30 mM d’acide chlorhydrique à un débit de 30 min ll-1 pour 0,5 min sur les cellules d’écoulement 1 et 2. Tracer la concentration 2F5 pour chaque échantillon d’écoulement à partir de l’étape 6.4 contre le flux à travers le volume pour obtenir la courbe de percée 2F5. Calculez la quantité de 2F5 injectée lorsque 10 % de la concentration de chargement 2F5 a été atteinte pour obtenir la capacité de liaison dynamique de 10 % (DBC). Analyser des échantillons de protéines par LDS-PAGE. Ouvrez un gel polyacrylamide BisTris LDS prêt à l’emploi et placez-le dans un module d’électrophorèse. Transférer 800 mL de tampon de fonctionnement (50 mM MES, base Tris de 50 mM, 0,1 % (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) dans le module et ajouter 0,5 mL de solution antioxydante. Dans un tube de réaction de 1,5 ml, mélanger 10 l de tampon de chargement avec 4 l d’agent réductur et 26 l de l’échantillon protéique. Incuber le tube dans un bloc de chaleur pendant 10 min à 80 oC. Centrifugeler le tube à 500 x g pour 30 s. Chargez le gel polyacrylamide LDS (10 l de l’échantillon par voie) et chargez 5 ll de norme de protéines pré-tachées (10 à 180 kDa) dans une voie séparée. Fermez la chambre d’électrophorèse et connectez l’alimentation. L’électrophoresis devrait fonctionner pendant 40 min et à 200 V constants. Retirer le gel de la chambre d’électrophoresis. Ouvrez le selage de gel et lavez le gel pendant 15 min dans l’eau sur un shaker à 19 tr/min. Tainer le gel pendant 1 h dans la solution de coloration sur un shaker à 19 tr/min. Détainer le gel pendant 1 h dans l’eau sur un shaker à 19 tr/min. Scanner le gel à l’aide d’un scanner de film.

Representative Results

Expression et purification du ligand d’affinité La protéine de fusion DFE a été exprimée dans les plants de tabac transgéniques cultivés dans une serre. Le rendement était de 120 mg-kg-1 masse de feuilles avec une biomasse moyenne de 130 g par plante. La pureté de DFE était de 5 % du TSP dans les extraits de plantes brutes avant le blanchiment, mais elle est passée à 40 % après traitement thermique à 70 oC pendant 1,5 min, ce qui a précipité les protéines des cellules hôtes. L’étape de blanchiment a été facilement intégrée dans la routine de récolte et d’extraction (figure 1) et a pris moins de 2 h de temps supplémentaire, y compris la mise en place du bain d’eau. La récupération globale de DFE a été de 23,5 mg kg1 avec une pureté de ‘gt;90%. Les étapes responsables de la perte de produit ont été blanchissant, filtration de profondeur et IMAC, avec des pertes spécifiques de 40%, 27% et 45%, respectivement. La capacité de filtre de profondeur était en moyenne de 135 à 36 L m-2 (SD, n-3) et donc dans la fourchette supérieure des valeurs rapportées dans la littérature21. Le rendement du DFE a augmenté avec l’âge des plantes (figure 2). Immobilisation du ligand d’affinité sur les colonnes de chromatographie activées par le NHS Au cours des premiers tests d’accouplement, nous avons constaté que le tampon HEPES (pH 8.3) a augmenté l’efficacité du couplage à 89 à 6 % (SD, n-3) comparativement à 78 à 9 % (SD, n-3) pour le tampon de bicarbonate recommandé par le fabricant. Par conséquent, HEPES a été utilisé pour toutes les expériences de couplage ultérieures. Une approche DoE a été choisie pour optimiser l’efficacité de couplage de DFE à la résine d’agarose interconnectée activée par le NHS. La quantité absolue de DFE immobilisée sur la résine a augmenté avec la masse de DFE injectée dans la colonne et plafonnée à 15 g L-1 alors que le rendement du couplage a diminué continuellement à mesure que davantage de DFE était injecté (figure 2). Le rendement de couplage a également été plus faible dans un tampon acide, ce qui indique la nécessité de filtrer les conditions d’accouplement appropriées pour chaque ligand au cas par cas. Des conditions idéales en termes de rendement d’accouplement, de quantité absolue de DFE immobilisé et de coûts de colonne ont été identifiées à l’aide de l’outil d’optimisation numérique du logiciel DoE. Les conditions les plus souhaitables (pH 9,0 et 7,0 mg de DFE par 1 ml de résine d’agarose transversale) étaient situées sur un grand plateau et étaient donc robustes. Les molécules DFE ont conservé leur fluorescence rouge même après le couplage, et l’intensité des couleurs correspondait à la quantité totale de DFE immobilisé (figure2). Par conséquent, la couleur de colonne peut être employée comme paramètre simple de contrôle de qualité pour estimer l’efficacité et la qualité de colonne d’accouplement. La fluorescence a également confirmé que la protéine de fusion DFE assemblé dans l’état tétramérique de DsRed indigène. Figure 2 : Optimisation de l’immobilisation du DFE à la résine d’agarose interconnectée activée par le NHS. (A) Gel LDS-PAA avec superpose de taches occidentales d’échantillons d’homogénéisme et d’élution provenant d’extraits transgéniques non blanchis et blanchis de plantes DFE. La récolte des plantes a été effectuée 38, 45 ou 52 jours après l’ensemencement. Des taches occidentales ont été exécutées utilisant un anti-His6-anticorps5. (B) Quantité totale de ligand d’affinité Couplé d’Affinité de DFE dans la dépendance si le pH de couplage et la masse globale de DFE purifié injecté sur les colonnes d’agarose croisées ACTIVÉes par LE NHS. Les points rouges indiquent les expériences réelles effectuées pour construire le modèle de surface de réponse. (C) Colonnes d’affinité DFE après la procédure de couplage. Les nombres correspondent aux conditions d’accouplement mises en évidence dans le panneau B. dps – jours après l’ensemencement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Test de l’isolement 2F5 à l’aide de la résine d’affinité DFE L’anticorps recombinant 2F5 a été produit avec transitoire dans les plantes Detritiennes de Nicotiana cultivées dans un phytotron5. La capture de 2F5 de l’extrait brut de la plante a été testée à l’aide de colonnes d’affinité couplées à un DFE purifié de 7,0 mg (étape 6). L’élution des résines protéinées A implique généralement un tampon acide (pH 3,3)13. Par conséquent, nous avons initialement évalué différents tampons d’élution à faible pH (pH 6.0-3.25) pour les colonnes DFE. L’élution de 2F5 a été couronnée de succès à des valeurs de pH inférieures à 4,5 avec la plus forte reprise de 35% à 3,25 pH. Cependant, l’élution à faible pH a inactivé à la fois l’anticorps (comme confirmé par la spectrométrie SPR) et le ligand DFE (comme indiqué par la perte de couleur et le DBC inférieur, Figure 3). Ce dernier était prévu étant donné que les dénatures natifs DsRed à pH ‘lt;4.022,23. Pour éviter la dénaturation de produit et de ligand, nous avons examiné le chlorure de magnésium comme agent alternatif d’élution parce qu’il a précédemment été employé pour elute mAbs d’autres résines d’affinité24. Une concentration de chlorure de magnésium de 1,25 M était suffisante pour éliuter 2F5 de la résine d’affinité DFE avec une récupération de 105 à 11 % (SD, n-3) et une pureté de 97 à 3 % (SD, n-3). Cette performance était comparable à la protéine A résines25,26. La dissociation d’équilibre constante (KD) de l’anticorps DFE purifié 2F5 et le ligand synthétique Fuzeon était de 791 pM alors que celle d’une protéine A purifiée homologue était 763 pM5. En outre, aucune perte de couleur substantielle n’a été observée dans la résine sur un total de 25 cycles de liaison et d’elute. Le DBC de la résine d’affinité DFE à 10% 2F5 percée a diminué linéairement au cours de 25 cycles à 15% de la valeur initiale (Figure 3). Figure 3 : Tester l’isolement de 2F5 à partir d’extraits de plantes clarifiés à l’aide des résines d’affinité DFE. (A) Résines d’affinité DFE après un cycle d’élution utilisant des tampons avec différentes valeurs de pH dans la plage 4.0-3.0 et les mêmes résines après une étape de neutralisation au pH 6.0. (B) Résines d’affinité DFE après un et six cycles de purification 2F5 en utilisant 1,25 M ou 4,00 M de chlorure de magnésium comme élude. (C) Chromatogrammes d’expériences de chargement frontal (courbes de rupture) pour déterminer la capacité de liaison dynamique dépendante du cycle de la résine DFE utilisant le chlorure de magnésium comme élude. Les courbes de percée ont été mesurées pour 4,0 M et 1,25 M de tampons d’élution de chlorure de magnésium et divers nombres de cycle. (D) Capacité de liaison dynamique dépendante du cycle de DFE en utilisant 1,25 M de chlorure de magnésium comme élu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Applications de la résine d’affinité nouvelle

Nous avons montré que les résines de chromatographie d’affinité personnalisées pour la capture des mAbs peuvent être fabriquées en immobilisant un ligand contenant un épitope spécifique au mAb à l’agarose interconnectée activée par le NHS. Pour concevoir une telle résine, il était nécessaire de connaître la séquence de l’épitope et d’utiliser un épitope linéaire. Les résines résultantes sont avantageuses pour la capture des mAbs parce qu’elles pourraient potentiellement remplacer les étapes coûteuses de chromatographie d’affinité de protéine A. L’interaction entre 2F5 et DFE dans notre étude de cas a été négociée par la liaison d’épitope-paratope, ainsi notre ligand devrait être plus sélectif que la protéine A, qui se lie à la région de Fc de la plupart des IgGs murines et humains. Étant donné que des ligands individuels sont nécessaires pour chaque abor, notre méthode peut sembler d’abord adaptée principalement aux anticorps qui sont produits à très grande échelle. Cependant, en combinant notre approche avec l’expression rapide de protéine transitoire à base de plantes, de nouveaux ligands d’affinité peuvent être préparés en moins de 2 semaines²⁷ avec un effort minimal²⁸. Par conséquent, la méthode est également adaptée pour la purification à petite échelle mAb.

Production et améliorations potentielles du ligand d’affinité

Les plantes offrent une plate-forme de production rapide et sûre pour les ligands d’affinité⁵^,²⁹^,³⁰, comme la protéine de fusion DFE en vedette dans notre étude de cas. Blanchir le matériel végétal a considérablement réduit la quantité de protéines cellulaires hôtes en une seule étape et a été facilement intégré dans une routine de clarification standard. Cependant, la récupération du ligand a été faible dans la configuration actuelle, probablement en raison de sa stabilité thermique modérée et une certaine liaison non spécifique aux couches de filtre, comme indiqué pour d’autres produits³¹^,³²^,³³. L’ingénierie du transporteur pour augmenter sa stabilité thermique peut donc aider à améliorer le rendement ligand à l’avenir, comme décrit pour le vaccin antipaludique candidat CCT, l’enzyme antitumorale PpADI ou un mésophile -glucosidase³⁴^, ³⁵^,³⁶. Il en va de même pour l’étape de filtration en profondeur, où l’ingénierie des protéines peut aider à réduire la liaison non spécifique au matériau filtrant³⁷. Les coûts de production de DFE et de ligands similaires pourraient également être réduits en améliorant l’efficacité globale de la clarification à l’aide de flocculants ou d’additifs de filtre³⁸^,³⁹.

Lorsque DsRed est utilisé comme transporteur, il forme un complexe tétratérique. Ceci est avantageux parce qu’il augmente le nombre d’épitopes par ligand, mais il peut également rendre le ligand plus susceptible de démontage ou de dénaturation pendant la chromatographie d’affinité. Une protéine porteuse monomérique telle que mCherry peut donc être préférable, parce qu’elle est stable à faible pH⁴⁰, et l’inclusion de répétitions en tandem de l’épitopie augmenterait l’avidité du ligand et augmenterait ainsi la capacité de résine⁵^, ²⁶ Annonces ^, ⁴¹. Pour les protéines simples de porteur-épitope (c.-à-d., celles sans liaisons de disulfure ou modifications post-traductionnelles), les systèmes de production microbiennepeuvent peuvent réduire les coûts de fabrication et rendre les ligands plus compétitifs par rapport aux protéines A. Par exemple, la protéine fluorescente verte a été exprimée dans les cellules bactériennes avec un rendement de 1 gkg^-1 biomasse, ce qui réduirait considérablement les coûts de production de ligand42 .

Indépendamment de l’hôte d’expression, un ligand purifié d’affinité a été exigé pendant l’accouplement pour réduire au minimum l’immobilisation des protéines de cellules d’hôte ou des composants de médias qui peuvent autrement réduire la sélectivité et la capacité de résine. L’inclusion d’une étiquette de poly-histidine pour la purification IMAC a augmenté la pureté à 90% en une seule étape, facilitant la production rapide et peu coûteuse de ligand⁵^,⁴³^,⁴⁴. Cependant, la position de l’étiquette de fusion est importante parce qu’elle a le potentiel d’entraver stérilement la liaison d’épitope ou d’induire le clivage de l’étiquette ou de l’épitope du porteur⁴⁵^,⁴⁶.

Immobilisation du ligand d’affinité sur les colonnes de chromatographie activées par le NHS

L’immobilisation a été effectuée manuellement ou à l’aide d’un système de chromatographie. Les petits volumes tampons par colonne semblaient favoriser la manipulation manuelle (par exemple, en raison des volumes de déchets minimes). Toutefois, si des colonnes multiples/plus grandes sont nécessaires, le système de chromatographie facilite le couplage des conditions de couplage (p. ex., les débits réglementés) et est donc plus susceptible d’obtenir des résultats reproductibles en termes de DBC. Nos données suggèrent que le tampon de couplage et le pH ont un effet important sur l’efficacité du couplage et les coûts globaux de la colonne. Les facteurs de dépistage qui influencent la réaction d’accouplement et leur ajustement pour chaque protéine porteuse (ou même pour chaque fusion transporteur-ligand) pourraient donc améliorer l’efficacité du couplage et la performance de la résine, et nous recommandons cette approche.

Test de l’isolement 2F5 à l’aide de la résine d’affinité DFE

Le rendement et la pureté du produit sont des aspects importants de la performance de la résine, et dans le cas de DFE, nous avons obtenu un rendement de 105 à 11 % (SD, n-3) et une pureté de 97 à 3 % (SD, n-3), ce qui est comparable à la performance des résines de référence de protéines A^25. ^,²⁶. Un autre indicateur de performance clé pour les résines en général (et en particulier pour celles basées sur les ligands d’affinité) est le DBC à 10% percée du produit, parce que ce paramètre affecte la quantité de résine nécessaire pour un processus spécifique et donc les coûts. Pour le ligand DFE, le DBC initial était de 4 g La résine L^-1, qui est de 13 % de la valeur correspondante de la protéine A dans des conditions similaires (seulement 2 min de temps de contact)²⁵^,^47, mais environ 15 fois plus élevée par rapport à d’autres résines d’affinité personnalisées telles que le ligand anti-FSH-immunoaffinity utilisant le même temps de résidence de 2 min⁴⁸. Le DBC de DFE a diminué à 15% de la valeur de départ après 25 cycles de liaison et d’elute, tandis que plus de 50 cycles sont nécessaires pour la même perte de DBC dans les résines commerciales de protéine A⁴⁹. Cependant, il est important de noter que notre transporteur n’a pas encore été optimisé dans la même mesure que la protéine A, qui a fait l’objet d’une enquête approfondie et a été améliorée au cours des quatre dernières décennies⁸.

Jusqu’à présent, nous avons amélioré la stabilité de la résine et la récupération du produit en passant d’un tampon d’élution à faible pH à une forte concentration de chlorure de magnésium (Figure 3), comme recommandé dans les études antérieures¹³. La couleur rouge caractéristique du ligand d’affinité ne s’est pas fondue sensiblement pendant les 25 cycles de liaison-et-elute, ainsi nous spéculons que les protéases endogènes de plante dans les extraits clarifiés de plante³¹ ont pu tronqué et ainsi inactivé l’épitope de le ligand. Par conséquent, la conception de liaisons résistantes à la protéase pour connecter le transporteur et l’épitographe peut aider à maintenir le DBC initial sur un nombre prolongé de cycles. Compte tenu de l’expression rapide et simple et la purification de la ligand DFE, son couplage simple à des résines de chromatographie commerciale, et son excellent rendement du produit et la pureté, nous croyons que notre méthode offre une alternative appropriée à la protéine A pour le la purification des mAbs et des dérivés d’anticorps qui ne se lient pas à la protéine A, particulièrement si des améliorations au porteur et au lien peuvent améliorer la stabilité de DBC et de ligand. Cette hypothèse a été soutenue par la petite différence dans la constante de dissociation de DFE-purifié et protéine A-purifié 2F5 anticorps⁵, indiquant que notre nouvelle ligand d’affinité permet la récupération des mAbs de haute qualité.

Avantages et limites actuelles de la méthode

La production du ligand d’affinité comme fusion génétique avec une protéine porteuse augmente la solubilité dans les tampons aqueux et donc la compatibilité avec les conditions typiques de couplage ligand. En revanche, les peptides vides dérivés de la synthèse de peptide de phase solide peuvent avoir la solubilité limitée dans ces conditions dues à leur séquence⁵⁰, qui ne peut pas être changée parce qu’elle est dictée par la séquence d’acide aminé de l’épitope identifiée par le mAb à être purifiés. D’autres ont donc utilisé une synthèse sur la résine des ligands peptides⁵¹. La capacité de liaison statique de la résine résultante était élevée (80 g L^-1), mais le processus de préparation de la résine est long, une capacité de liaison dynamique n’a pas été signalée et la pureté et la récupération obtenues étaient inférieures à celles de notre approche. Un autre avantage d’un ligand de protéine de fusion à l’échelle de laboratoire est que le ligand et les variantes de celui-ci peuvent être rapidement produits, purifiés et éprouvés avec l’effort minimal dans un système d’expression à haute durée facile à utiliser^52.

Les deux limites actuelles de la méthode présentée ici sont la faible capacité de liaison dynamique de 3 g L^-1 et sa réduction de 90% au cours de 25 cycles de liaison et d’elute⁵. Ces limitations peuvent être corrigées à l’avenir en appliquant des conditions de chargement moins strictes et en remplaçant le transporteur DsRed actuel par une variante modifiée et plus stable respectivement. Par exemple, doubler le temps de contact actuel de 2 à 4 minutes a le potentiel de doubler la capacité de liaison dynamique comme cela a été montré pour certaines résines de protéine A²⁶.

dépannage

Le tableau suivant met en évidence les problèmes potentiels qui peuvent être rencontrés au cours de ce protocole et fournit des conseils sur la façon de les résoudre (tableau 1).

Tableau 1 : Problèmes potentiels qui peuvent être rencontrés et solutions possibles.
Étape du protocole	problème	Couse	réparer
1	Les plantes ne poussent pas	Conditions de croissance compromises	Vérifier le pH et la conductivité de l’engrais
			Vérifier la température et les conditions de lumière
2 et 3	De grandes quantités de protéines cellulaires hôtes sont présentes après extraction	Précipitations incomplètes	Vérifier la température pendant le blanchiment
			Vérifier l’agitation dans le bain blanchissant
2 et 3	Aucun produit trouvé dans l’extrait de plante	Température de blanchiment trop élevée	Vérifier la température et le pH pendant le blanchiment
		pH dans le tampon de blanchiment trop bas
3	De grandes parties de tige ou de feuille restent après extraction	Mélange incomplet dans le mélangeur	Assurez-vous que le matériel végétal ne forme pas de prise dans le mélangeur
3	Augmentation rapide de la pression pendant la filtration de profondeur	Sélection et/ou orientation incorrectes du filtre	Vérifier le type de filtre et l’orientation
4	Petite protéine de fusion pendant l’élution / beaucoup de protéine de fusion dans le flux à travers	La résine IMAC n’a pas été accusée d’ions métalliques	Vérifiez si la résine IMAC a été correctement chargée d’ions
		La protéine de fusion a perdu l’étiquette d’affinité	Évitez la lumière du soleil intense et les températures élevées pendant la culture des plantes
4	Protéine de fusion perdue pendant la concentration	Protéine de fusion liée à la membrane	Vérifier le type de membrane
			Assurez-vous que le facteur de concentration n’était pas trop élevé
5	Faible rendement d’accouplement	Séquence incorrecte de l’ajout de réactif d’accouplement	Vérifier les étiquettes des réactifs et la séquence d’ajout
		Préparation incorrecte des colonnes avant le couplage	Vérifier les conditions de la colonne preparaiton
5 et 6	Faible rendement mAb	Faible expression de mAb dans la biomasse végétale	Expression de mAb d’essai dans la biomasse
		Faible densité de ligands	Vérifier la pureté de la préparation des protéines de fusion
7	Concentrations de protéines très faibles/élevées dans l’état d’œil de Bradford	Formation de bulle pendant le tuyauterie	Vérifiez les bulles dans le 96-well palte
7	Faible concentration de mAb pendant la mesure SPR	Protéines compromises Une puce	Comparer avec les résultats du mAb standard avec concentration connue
		Dilution incorrecte de l’échantillon	Vérifier le taux de dilution et le tampon

Tableau 1 : Dépannage.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Ibrahim Al Amedi pour avoir cultivé les plants de tabac transgéniques et le Dr Thomas Rademacher d’avoir fourni le vecteur d’expression du tabac. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Richard M. Twyman pour son aide éditoriale et Markus Sack pour les discussions fructueuses sur la structure de ligand d’affinité DFE. Ces travaux ont été financés en partie par les programmes internes Fraunhofer-Gesellschaft dans le cadre de la subvention no. Attirer 125-600164 et l’état de Rhénanie-du-Nord-Westphalie en vertu de la subvention Leistungszentrum no 423 “Production en réseau et adaptative”. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de la subvention 331065168 du Research Training Group “Tumor-targeted Drug Delivery”. GE Healthcare a soutenu la publication en libre accès de cet article.

Materials

10L/20L Bucket	n/a	n/a	Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
ÄKTApure	GE Helthcare	29018226	Chromatography system
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Centrifuge
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Antibody 2G12	Fraunhofer IME	n/a	Standard for SPR quantification
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Bag filter
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chelating Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	Chromatography resin
Cond 3320	WTW	EKA 3338	Conductometer
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Multichannel pipette
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Diverse bottles	Schott Duran	n/a	Glas bottles
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Heat block
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Buffer component
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plate reader
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Thermometer
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraction collector
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200	Hettich	2400	Centrifuge
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatography columns
Hydrochloric acid	Carl Roth GmbH	4625.1	Buffer component
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	Buffer component
K700	Pall	5302305	Depth filter layer
KM02 basic	IKA	n/a	Magnetic stirrer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Immersion circulator
Magnesium chloride	Carl Roth GmbH	KK36.2	Buffer component
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm	Sartorius	16534K	Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate	Carl Roth GmbH	T111.1	Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer	Invitrogen	NP0002	Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant	Invitrogen	NP0005	Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Perforated bucked	n/a	n/a	Blanching
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatography resin
Silicone spoon	n/a	n/a	Spoon
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Gel staining solution
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	6773.1	Buffer component
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	X891.1	Media component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-100G	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Buffer component
Sodium citrate	Carl Roth GmbH	HN13.2	Buffer component
Sodium bisulfite	Carl Roth GmbH	243973-100G	Media component
Sodium phosophate	Carl Roth GmbH	T877.2	Media component
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR device
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L	Clatronic	n/a	Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL	B. Braun	4606027V	Syringes
Syringe adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Syringe adapter
TE6101	Sartorius	TE6101	Precision scale
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Buffer component
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Chromatography software
Vacuum bags	Ikea	203.392.84	Plant storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
XK-26/20 column housing	GE Helthcare	28-9889-48	Chromtography column

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Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins – Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

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