Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Matthias Kn&#246;dler; Clemens R&#252;hl; Patrick Opdensteinen; Johannes  F. Buyel

doi:10.3791/59933

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/59933

Matthias Knödler^1,3, Clemens Rühl², Patrick Opdensteinen^1,3, Johannes F. Buyel^1,3

¹Institute for Molecular Biotechnology,RWTH Aachen University, ²Sanofi Deutschland GmbH, ³Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME,Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

In deze procedure, een dsred gebaseerde epitoop ligand is geïmmobiliseerd om een zeer selectieve affiniteit hars voor de inname van monoklonale antilichamen van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants produceren, als een alternatief voor eiwit a.

Abstract

De zuivering van monoklonale antilichamen (mAbs) wordt vaak bereikt door proteïne een affiniteits chromatografie, die tot 25% van de totale proceskosten kan verwerken. Alternatieve, kosteneffectieve Vang stappen zijn daarom waardevol voor productie op industriële schaal, waarbij grote hoeveelheden van één mAb worden geproduceerd. Hier presenteren we een methode voor de immobilisatie van een op dsred gebaseerde epitoop ligand aan een kruisgebonden agarose hars waardoor de selectieve inname van het HIV-neutraliserende antilichaam 2f5 uit ruwe plantenextracten zonder gebruik van proteïne a. De lineaire epitoop eldkwa werd eerst genetisch gesmolten tot het fluorescerende eiwit Dred en het fusie-eiwit werd uitgedrukt in transgene tabak (Nicotiana tabacum) planten vóór zuivering door geïmmobiliseerde metaal-ion affinity chromatografie. Verder werd een methode gebaseerd op geactiveerde kruisgebonden agarose geoptimaliseerd voor hoge ligand dichtheid, efficiënte koppeling en lage kosten. De pH en buffer samenstelling en de oplosbare ligand concentratie waren de belangrijkste parameters tijdens de koppelingsprocedure, die werd verbeterd met behulp van een ontwerp-van-experimenten aanpak. Het resulterende affiniteits hars werd getest op zijn vermogen om het doel mAb selectief te binden in een ruw plantenextract en de elutie buffer werd geoptimaliseerd voor hoge mAb-terugwinning, product activiteit en de stabiliteit van de affiniteits hars. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere antilichamen met lineaire epitopes. De nieuwe harsen maken zachtere elutie-condities mogelijk dan proteïne A en kunnen ook de kosten van een initiële opname stap voor mAb-productie verminderen.

Introduction

Biofarmaceutische producten zijn belangrijk voor de behandeling van een breed spectrum van ziekten in bijna elke tak van geneeskunde¹. Monoklonale antilichamen (mAbs) domineren de biopharmaceutische markt, waarbij de wereldwijde verkoop naar verwachting bijna €110.000.000.000 in 2020²bereikt. De favoriete expressie platform voor MABS zijn Chinese Hamster ovarium cellijnen, die typisch produceren hoge MAB Antilichaamtiters tot 10 g ∙ L^-1 in de cultuur supernatant³^,⁴. De productie van mAbs in zoogdier celculturen is echter duur vanwege de hoge kosten van het medium en de noodzaak van steriele gisting⁵. Alternatieve uitdrukkings platformen zoals planten bieden mogelijk een snellere, eenvoudigere, goedkopere en meer schaalbare aanpak voor industriële productie van⁶^,⁷.

Naast de kosten in verband met de celculturen van zoogdieren is het wijdverbreide gebruik van eiwitten een affiniteits chromatografie voor product opname een belangrijke kosten motor voor de industriële productie van mAbs. Eiwit A is van nature te vinden op het oppervlak van Staphylococcus aureus cellen en bindt zich aan het fragment kristalzable (FC) gebied van bepaalde Murine en menselijke antilichamen, waardoor fungeert als een afweermechanisme om het humorale immuunsysteem te omzeilen⁸. Proteïne A is uitgegroeid tot de industrie gouden standaard voor de inname van MABS uit de celcultuur supernatanten en wordt ook op grote schaal gebruikt door de onderzoeksgemeenschap omdat het zeer selectief, typisch bereiken MAB zuiverheid van ~ 95% in een enkele stap⁸. Niet verrassend, de verkoop van eiwitten in de afgelopen twee decennia hebben nauw gespiegeld de verkoop van mAbs⁸. Afhankelijk van de productieschaal kunnen de kosten van proteïne A overeenkomen met meer dan 25% van de totale proceskosten en daardoor de marktprijs van therapeutische MABS beïnvloeden, die tot €2.000 g^-1^5,5kan^zijn. Daarom hebben alternatieve chromatografie harsen met een vergelijkbare zuiverings prestatie het potentieel om de productiekosten aanzienlijk te verlagen, waardoor op antilichamen gebaseerde therapieën toegankelijk zijn voor een groter aantal patiënten van¹⁰^,¹¹ ^,¹². Dergelijke alternatieven kunnen ook de nadelen van eiwit een chromatografie omzeilen, met inbegrip van de strenge elutie-omstandigheden bij lage pH (typisch < 3.5) die kunnen leiden tot mAbs om conformationele veranderingen te ondergaan die aggregatie bevorderen¹³ . Belangrijk is dat proteïne A alleen selectief is voor de regio FC van bepaalde IgG-subklassen, zodat niet-functionele moleculen met afgeknotte bindings domeinen kunnen samenwerken met het intacte product⁵, terwijl MAB-derivaten, zoals enkele-keten-variabele fragmenten niet binden aan eiwitten A helemaal.

Hier beschrijven we een alternatieve affiniteits chromatografie hars voor de inname van de HIV-neutraliserende MAB 2f5 met behulp van de lineaire epitoop eldkwa (één letter aminozuur code)⁵^,¹⁴. We genetisch fuseerden de 2f5 epitoop tot het C-eindpunt van het fluorescerende eiwit dsred, dat functioneerde als drager en reporter molecuul, en produceerde de resulterende proteïne Dsred-2F5-Epitope (DFE) in transgene tabak ( Nicotiana tabacum) planten. DFE werd gezuiverd door één-stap geïmmobiliseerde metaal-ion affiniteits chromatografie (IMAC). De immobilisatie van de gezuiverde DFE-affiniteit ligand op een kruisgebonden agarose-hars werd bereikt door chemische koppeling met behulp van N-hydroxysuccinimide (NHS)-geactiveerde kruisgebonden agarose-kolommen. Statistische experimentele ontwerpen werden vervolgens gebruikt om de immobilisatie procedure te optimaliseren en de koppelings efficiëntie¹⁵. De zuiverings strategie voor mAb 2F5 werd geëvalueerd in termen van zuiverheid van het antilichaam, opbrengst en ligand stabiliteit. In tegenstelling tot eiwit A, dat de FC-regio bindt, gebonden DFE aan de complementariteit-bepalende regio van 2F5, waardoor de zuivering van moleculen met een intact paratope. Ons concept kan eenvoudig worden aangepast aan elke MAB met een lineaire epitoop of aan andere op peptide gebaseerde affiniteits liganden die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door Microarray studies¹⁶.

Figuur 1: processtroom schema voor de bereiding van epitoop affiniteit harsen die kunnen worden gebruikt voor de inname van MABS van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants. A) de affiniteit LIGAND DFE werd uitgedrukt in transgene tabaksplanten. Een hitte precipitatie stap (B) werd opgenomen voordat geoogst blad werden gehomogeniseerd (C). D) het ruwe plantaardige extract werd verduidelijkt door filtratie van de zak, diepte filtratie en 0,2 μm steriele filtratie. (E) DFE werd vervolgens gezuiverd door iMac. (F, G) De gezuiverde DFE-affiniteit ligand werd geïmmobiliseerd op EDC/NHS-geactiveerde kruisgebonden agarose-kolommen. H) bacteriële culturen met T-DNA-codering antilichaam 2F5 werden gebruikt voor voorbijgaande expressie in N. benthamiana -planten (I) gekweekt in een phytotron. J) N. benthamiana -bladeren werden geoogst en verwerkt zoals beschreven in D. (K) MAB 2f5 werd gezuiverd uit het opgehelderd extract met behulp van de DFE-affiniteits kolommen (L). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol

1. de transgene tabaksplanten cultiveren Opmerking: Het ontwerp van de DFE Fusion-eiwitten en de generatie van transgene planten worden elders beschreven5,17. De transgene tabaks zaailingen in de bodem ontkiemen. Irrigeren de planten met een 1,0 g · L-1 meststof oplossing. Breng de planten over naar één, 100 mm x 100 mm x 60 mm (lengte, breedte, hoogte) potten wanneer ze groeien tot een diameter van ~ 0,04 m. Cultiveer de transgene tabaksplanten in een kas met een 16-h fotoperiode (25/22 °c licht/donker temperatuur regime), met 70% relatieve vochtigheid en geautomatiseerde bevruchting met een 1,0 g · L-1 meststof oplossing voor 15 min elk uur. Na 7 weken, oogst alle bladeren behalve de vier zaadlob bladeren aan de basis van de plant stam. De geoogste bladeren onmiddellijk verwerken zoals hieronder beschreven. 2. hitte precipitatie van host-Celeiwitten Stel een waterbad met een werkvolume van 20 liter in een RVS verwarmd vat (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). Plaats in het begin een magnetische pomp in het waterbad om de vloeistof permanent te agiteren met een debiet van 5 L min-1. Monteer een regelbare thermostaat op het waterbad voor temperatuurregeling (stappen 2,4 en 2,8).Let op: Alle volgende stappen tot 2,10 omvatten de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch geïsoleerde handschoenen en een bril. Voeg 15 L gedeïoniseerd water toe aan het waterbad en verwarm de vloeistof tot 70 °C. Plaats een emmer van 10 liter gevuld met 5 L gedeïoniseerd water op een magneetroerder. Voeg natriumfosfaat toe aan een eindconcentratie van 120 mM. Breng de pH op 8,14 met zoutzuur van 10 M. Wanneer alle componenten zijn opgelost, voeg de resulterende geconcentreerde blancheren buffer (5 L) toe aan het waterbad vanaf stap 2,2. Roer het waterbad tot de temperatuur 70 °C bereikt. Gebruik indien nodig 10 M zoutzuur om de pH op 8,14 aan te passen. Blijf gedurende ten minste 15 minuten na de vereiste temperatuur en pH worden geagiterend om ervoor te zorgen dat de gehele assemblage in thermisch evenwicht is. Maak een emmer van 20 L (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) gevuld met gedeïoniseerd water bij een temperatuur van ~ 17 °C (vereist voor stap 2,9). Bereid 400 g aliquots van de geoogste tabaksbladeren uit stap 1,3. Plaats een aliquot in een geperforeerde korf (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; porie breedte ten minste 0,02 m x 0,02 m). Vermijd het overvullen van de korf met plant materiaal of het verpakken van de bladeren te strak om beschadiging van het weefsel te voorkomen. Dompel de korf volledig onder in de hete blancheren buffer van stap 2,4 en zorg ervoor dat alle bladeren onder het vloeistofoppervlak blijven. Gebruik een thermostabiele siliconen lepel om de bladeren onder het oppervlak te houden indien nodig. Inbroed de tabaksbladeren voor 1,5 min in de blancheren vloeistof terwijl de pomp is nog steeds roeren de vloeistof. Controleer de vloeistoftemperatuur gedurende de gehele incubatieperiode. Vermijd het blokkeren van de inlaat van de pomp met tabaksbladeren. Verwijder de korf van de tabaksbladeren uit de blancheren buffer en laat de residuele buffer uit de bladeren voor 30 sec. Breng de mand over naar de emmer gevuld met koud water (vanaf stap 2,5) en dompel de blaadjes gedurende 30 sec. Verwijder de korf en giet het restwater uit de gedurende 30 sec. voor homogenisatie (stap 3). Herhaal de stappen 2,6 tot en met 2,9 met verse aliquots van 2,6 tot de volledige geoogste biomassa wordt verwerkt. Constant de pH en de temperatuur van de blanchbuffer in het waterbad bewaken en aanpassen.Opmerking: Geblancheerde plant materiaal kan tot 30 minuten op ijs worden opgeslagen wanneer verschillende blancheren cycli nodig zijn om de gehele biomassa te verwerken. Geblancheerde bladeren kunnen ook gedurende ten minste 3 weken in vacuüm verzegelde zakken bij – 80 °C worden bewaard. Echter, onmiddellijke verwerking wordt aanbevolen omdat langdurige opslag de DFE-opbrengst kan verminderen. 3. EiwitExtractie en-verduidelijking Let op: De volgende stappen betreffen een blender met roterende messen. Werk niet in het blendervat wanneer het wordt gevoed of gemonteerd op het motorblok. Plaats 150 g (natte massa) van geblancheerde tabaksbladeren (stap 2,9) in het blendervat en voeg 450 mL extractiebuffer (50 mM natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride, 10 mM natrium disulfite, pH 7,5). Sluit de blender stevig om het morsen van plant materiaal of buffer te voorkomen. Homogeniseren de bladeren voor 3x voor 30 s, met 30 s pauzes tussen elke puls. Zorg ervoor dat alle bladeren worden gehomogeniseerd en dat er geen stok aan de bovenkant van het blendervat is. Indien nodig, open de blender tijdens de pauzes en duw naar beneden bladeren die vasthouden aan het bovenste deel van het vat, met behulp van een schone siliconen lepel. Neem na homogenisatie een monster van 1,0 mL van het homogenaat voor volgende analyse (stap 7). Verzamel het homogenaat in een vat van voldoende grootte (bijv. als het werkt met een totale biomassa van 1,0 kg, gebruik dan een vat met een capaciteit van ten minste 5 L). Herhaal de stappen 3,1 tot en met 3,3 totdat alle geblancheerde biomassa is gehomogeniseerd. Monteer een zakfilter in een filterhouder en plaats een ander voldoende groot vat (zie 3,4) onder de montage. Breng het homogenaat aan op de zak filter met een snelheid van ~ 0,15 L min-1. Neem monsters van de zak filtraat na elke liter voor volgende analyse (stap 7) en meet de troebelheid van de zak filtraat pool als een 1:10 verdunning in extractiebuffer met behulp van een Turbidimeter of soortgelijk apparaat. Verder verduidelijken de zak filtraat zwembad met behulp van 0,02 m2 van een K700 (boven) en KS50 (bodem) diepte filter laag combinatie per liter zak filtraat zwembad. Breng een debiet van 3,0 L min-1· m-2 tot een maximale druk van 0,2 MPa. Verwijder vervolgens rest deeltjes door het geklaarde filtraat door te geven via een steriel 0,2 μm-filter zoals hierboven beschreven5. 4. zuivering van de DFE-affiniteit ligand Bereid een snel eiwit vloeistofchromatografie systeem voor door te spoelen met elutie buffer (10 mM natriumfosfaat, 300 mM imidazol, pH 7,4), wasbuffer (10 mM natriumfosfaat, pH 7,4) en evenwichts buffer (20 mM natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride, pH 7,4). Monteer een kolom met ~ 50 mL chelaat kruisgebonden agarose hars per kilogram blad biomassa (~ 2,5 L diepte filtraat). Laad de kolom met nikkel ionen op door 5 kolom volumes (CV) van 200 mM nikkel sulfaat oplossing toe te passen en te wassen met 5 CV elutie buffer. Gebruik een debiet van 50 cm h-1 en bewaak de UV-signalen bij 260, 280 en 558 nm voor alle volgende chromatografie stappen. De kolom wordt geëerd met een equilibratie buffer van 10 CV. Laad vervolgens 50 CV van het opgehelderd plantenextract (van stap 3,6) naar de kolom geconditioneerd. Was de kolom met 10 CV wasbuffer. Elueer het DFE-fusie-eiwit met 5 CV elzen buffer en verzamel het producthoudende breuk zodra de UV-signalen bij 280 nm en 558 nm zijn toegenomen tot meer dan 5 mAU boven de baseline. Neem een monster van 0,2 mL uit de elutie Fractie om de totale concentratie oplosbare eiwitten (TL) (stap 7,1), DFE-concentratie (stappen 7,2 en 7,3) en DFE-zuiverheid te meten (stap 7,4). Monteer een kolom met ~ 50 mL kruisgebonden dextran-hars op een chromatografie systeem. Een evenwichts kolom met 5 CV koppelings buffer (200 mM HEPES, 500 mM natriumchloride, pH 8,5). Injecteer 10 mL van de DFE-elutie fractie (stap 4,4) voor buffer wisseling en bewaak de UV-absorptie bij 280 en 558 nm. Verzamel de DFE-bevattende fractie zodra de UV-signalen bij 280 nm en 558 nm zijn toegenomen tot meer dan 5 mAU boven de baseline. Neem een monster van 0,2 mL en bepaal de TL-concentratie, DFE-concentratie en DFE-zuiverheid (stap 7). Concentreer het gezuiverde DFE-monster (van stap 4,7) tot 15 g L-1 met behulp van een centrifugale concentratorbuis bij 3.000 x g bij 4 °c gedurende 30 minuten in een centrifuge. Ga verder met de koppelingsreactie (stap 5).Opmerking: Bewaar de DFE-oplossing bij 4 °C als de concentratie-of koppelings stappen niet onmiddellijk kunnen worden uitgevoerd. 5. Koppel DFE aan de geactiveerde kruisgebonden agarose-hars Opmerking: Vervang het isopropanol dat wordt gebruikt voor de opslag van door de NHS geactiveerde kolommen niet totdat alle apparatuur en oplossingen voor de koppeling gereed zijn. Laat de kolommen nooit drooglopen. Stel een ontwerp van experimenten (DoE) model in om de koppeling van DFE aan het geactiveerde hars te optimaliseren, met pH, buffer samenstelling en DFE-concentratie als factoren. De details van de DoE-methode worden elders beschreven15. Bereid de affiniteit ligand Solution (uit stap 4,8) in een concentratiebereik van 0,5 – 15 g · L-1 of zoals gedefinieerd in de doe en bewaar het op ijs totdat de koppelingsreactie klaar is (stap 5,5). Vul ten minste tien 2 mL spuiten met de DFE-oplossing en bereid een adapter voor om de spuiten te monteren op NHS-geactiveerde kruisgebonden agarose-kolommen met een bedvolume van 1,0 mL. Voor elke 10 kolommen die worden gebruikt voor koppeling, bereid 30 mL deactiverings oplossing (0,5 M ethanolamine, 0,5 M natriumchloride, pH 8,3), 30 mL lage-pH oplossing (0,1 M Natriumacetaat, 0,5 M natriumchloride, pH 4,0) en 10 mL opslagoplossing (0,05 M Dinatriumfosfaat , 0,1% (m/v) natriumazide, pH 7,0). Bereid 20 mL 1 mM zoutzuur in een buis en inbroed het op ijs gedurende ten minste 20 min. bereid een precisie schaal voor om de doorstroom fracties voor alle stappen tijdens de koppelingsreactie te bewaken (stap 5,7). Open een verzegelde, door NHS geactiveerde, kruisgebonden agarose-kolom en monteer de spuitadapter bij de kolom inlaat. Voorkom dat er lucht in de kolom komt door een druppel buffer op de inlaat van de adapter toe te passen voordat u deze op de spuit aansluit. Was de kolom met 6 mL ijskoud 1 mM zoutzuur (vanaf stap 5,4) bij een debiet van < 1 mL min-1 en ga onmiddellijk verder naar stap 5,7. Injecteer 1,5 mL DFE-oplossing (stap 5,2) met behulp van een 2 mL spuit met een debiet van < 1 mL min-1 en verzamel de doorstroom fractie op een precisie schaal (stap 5,4) voor volgende analyse (stap 7). Verzegel de kolom aan beide uiteinden en incuberen 15 – 45 minuten bij 22 °C, afhankelijk van de DoE-Setup. Injecteer 6 mL deactiveringsoplossing, gevolgd door 6 mL low-pH oplossing met een debiet van < 1 mL min-1 om niet-covalent gebonden liganden uit de hars te verwijderen. Injecteer vervolgens 6 mL deactiveringsoplossing en inincuberen de kolom gedurende 15 minuten. Injecteer 6 mL lage-pH oplossing in de kolom, gevolgd door 6 mL deactiveringsoplossing. Injecteer vervolgens nog eens 6 mL low-pH oplossing in de kolom. Injecteer 2 mL opslagoplossing in de kolom en bewaar deze bij 4 °C. 6. testen van de zuivering van mAbs uit geklaarde plantenextracten Bereid 100 mL van het geklaarde plantenextract met 2F55 of het supernatant uit het voorkeurs-cel-gebaseerde expressie systeem, dat ook 2f5 bevat. Maak een equilibratie buffer (20 mM natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride, pH 7,4), een lage pH-elutie buffer (0,05 M citraat, 0,05 M natriumchloride, pH 4,0 – 3,25) en een elutie buffer met een hoog Ionic gehalte (1,0 – 4,0 M magnesium chloride, 0,1 M HEPES, pH 8,0) Spoel het chromatografie systeem met de buffers. Koppel een DFE-affiniteits kolom (uit stap 5,10) op het chromatografie systeem en equilibreren met 5 CV van een evenwichts buffer met een debiet van 1,0 mL min-1. Bewaak de UV-extinctie bij 280 nm.Opmerking: Het laden van plantenextract of celkweek supernatant op de kolom kan leiden tot een toename van de tegen druk. Stel een hoge druk alert in op 0,2 MPa om beschadiging van het chromatografie systeem of de DFE-kolom te voorkomen. Laad 80 mL van het opgehelderd plantenextract of supernatant (stap 6,1) op de kolom met een debiet van 0,5 mL min-1 om een contacttijd van 2 min te garanderen. Verzamel de doorstroom monsters in 2 ml fracties voor een doorbraak curve reconstructie (stap 7,3). Bewaar de doorstroom monsters bij 4 °C als een onmiddellijke monsteranalyse niet mogelijk is. Was de kolom met een equilibratie buffer van 6 CV. Verzamel een monster van de wassing aan het begin, Midden en einde van deze stap. Elute mAb 2F5 met 5 CV lage-pH elutie buffer of hoogionic-sterkte elutie buffer (0,1 M HEPES, 1,25 M magnesium chloride, pH 8,0). Verzamel de DFE-fractie wanneer het UV 280 nm-signaal is toegenomen tot 5 mAU boven de baseline. Optimaliseer de elutie buffer voor elk epitope-antilichaam paar. Voor 2F5, 1,25 M magnesium chloride bereikte een optimale balans tussenproduct terugwinning en ligand stabiliteit.Opmerking: De magnesiumchlorideoplossing is vatbaar voor neerslag. Los daarom het magnesium chloride op in ~ 700 mL water. Los de HEPES afzonderlijk op in 100 mL water en stel de pH in op 8,0. Voeg de opgeloste magnesiumchlorideoplossing toe aan de HEPES oplossing en voeg water toe aan een eindvolume van 1,0 L. Pas de pH niet aan na het oplossen van het magnesium chloride, omdat dit neerslag zal veroorzaken. Analyseer alle monsters genomen tijdens de stappen 6.4 – 6.6 met behulp van de methode Bradford, lithium dodecylsulfaat Polyacrylamide gel elektroforese (LDS-PAGE) en Surface Plasmon Resonance (SPR) spectroscopie (stap 7). 7. monsteranalyse Meet de TL-concentratie met behulp van de Bradford-methode18,19. Pipetteer in drievlaat 2,5 μL van elk monster in een enkele put van een 96-well plaat. Gebruik acht boviene serumalbumine (BSA)-normen in drievat die het bereik van 0 – 2000 mg · L-1. Voeg aan elke put 200 μL Bradford-reagens toe en meng door zachtjes op en neer te pipetteren. Houd het pipet niveau om te voorkomen dat de vorming van bubbels die de daaropvolgende uitlezen verstoren. Inbroed de plaat gedurende 10 minuten bij 22 °C en meet de extinctie bij 595 nm in een spectrofotometer. Bereken de TL-concentratie in de monsters op basis van een standaard curve via de BSA-referentiepunten. DFE kwantificeren door fluorimetrie Pipetteer in drievlaat 50 μL van elk monster in enkele putjes van een zwarte 96-goed half-gebied plaat. Omvatten zes DsRed-normen voor het bereik van 0 – 225 mg · L-1. Meet tweemaal de fluorescentie met een 530 ± 30 nm excitatie filter en een 590 ± 35 nm emissie filter in een spectrofotometer. Bereken de DFE-concentratie in de monsters op basis van een standaard curve via de DsRed-referentiepunten. Meet de 2F5-concentratie door de SPR-spectroscopie20. Bereid de lopende buffer van de HBS-EP (10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur (HEPES), 3 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 150 mM natriumchloride, 0,005% v/v tween-20, pH 7,4) en filter steriliseren door het door te geven via een 0,2 μm vacuüm fles-top filter. Degas de buffer gedurende 15 min. Sluit de HBS-EP-buffer aan op het SPR-instrument voordat u een carboxymethylated dextran-oppervlakte chip aan het docken en het systeem met behulp van de Prime-functie equilibreren. Start een handmatige uitvoering met een debiet van 30 μL min-1 en conditioner het spaan oppervlak door afwisselend 30 mm zoutzuur en 25 mm natriumhydroxide (twee injecties per stuk) over de stroomcellen 1 en 2 te injecteren met een debiet van 30 μL min-1 gedurende 1 minuut. Bereid 300 μL van een 500 mg · L-1 proteïne een oplossing in 10 mm Natriumacetaat (pH 4,0). Ontdooien injectieflacons met 0,4 M 1-ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide hydrochloride (EDC) en 0,1 M NHS en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 1 minuut voor het mengen van 70 μL EDC en 70 μl NHS. Breng het EDC/NHS-mengsel en het eiwit een oplossing naar 7 mm plastic monster flesjes en plaats in het monster rek. Activeer het carboxymethylated dextran-spaan oppervlak door het EDC/NHS-mengsel over de stroomcellen 1 en 2 te injecteren met een debiet van 10 μL min-1 gedurende 10 min. Koppel proteïne A aan het geactiveerde carboxymethylated dextran-oppervlak door het eiwit een oplossing te injecteren over flowcell 2 met een debiet van 15 μL min-1 gedurende 15 min. Tijdens het koppelen van het eiwit A, ontdooien een Injectieflacon van 1,0 M ethanolamine hydrochloride (pH 8,5) en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 1 minuut. Breng 150 μL over in een plastic Injectieflacon van 7 mm en plaats het in het apparaat. Wanneer stap 7.3.5 is voltooid, deactiveert u het spaan oppervlak door de ethanolamine-oplossing te injecteren via flowcellen 1 en 2 met een debiet van 10 μL min-1 gedurende 7 minuten. Conditioner het spaan oppervlak door afwisselend 30 mM zoutzuur en 25 mM natriumhydroxide (twee injecties per stuk) over de stroomcellen 1 en 2 te injecteren met een debiet van 30 μL min-1 voor 0,5 min. Standaarden van antilichamen 2F5 voorbereiden in HBS-EP lopende buffer bij een concentratie van 500 μg · L-1 en Verdun monsters met 2F5 in HBS-EP tot een eindconcentratie in het bereik van 20 – 1000 μg · L-1. Injecteer monsters en normen over de stroomcellen 1 en 2 met een debiet van 30 μL min-1 gedurende 3 min. Injecteer een 2F5-standaard na elke 15 monsters. Trek het relatieve eenheden (RU) signaal van flowcell 1 (referenticel) af van het signaal van flowcell 2 (meetcel) voor elk monster en bereken de antilichaam concentratie op basis van het RU-signaal van 2F5-standaard injecties. Na elke monster of standaard injectie regenereert u het spaan oppervlak door 30 mM zoutzuur te injecteren met een debiet van 30 μL min-1 voor 0,5 min over de stroomcellen 1 en 2. Plot de 2F5-concentratie voor elk doorstroom monster uit stap 6,4 tegen de doorstroming door het volume om de 2F5-doorbraak curve te verkrijgen. Bereken de hoeveelheid geïnjecteerd 2F5 wanneer 10% van de inlading 2F5 concentratie werd bereikt om de 10% dynamische binding capaciteit (DBC) te verkrijgen. Analyseer eiwit monsters door LDS-PAGE. Open een kant-en-klare 4 – 12% BisTris LDS Polyacrylamide gel en plaats deze in een elektroforese module. Breng 800 mL loop buffer (50 mM MES, 50 mM tris-basis, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) in de module en Voeg 0,5 mL antioxidant oplossing toe. Meng in een reactie buisje van 1,5 mL 10 μL laad buffer met 4 μL reduceermiddel en 26 μL van het eiwit monster. Inbroed de buis in een warmte blok gedurende 10 minuten bij 80 °C. Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 30 sec. Laad de LDS polyacrylamidegel (10 μL monster per baan) en laad 5 μL voorgebeitst eiwit standaard (10 – 180 kDa) in een aparte rijstrook. Sluit de elektroforese kamer en sluit de voeding aan. De elektroforese moet worden uitgevoerd voor 40 min en bij constante 200 V. Verwijder de gel uit de elektroforese kamer. Open de gel mantel en was de gel 15 min in water op een shaker bij 19 rpm. Vlek de gel voor 1 uur in kleurings oplossing op een shaker bij 19 rpm. Destain de gel voor 1 uur in water op een shaker bij 19 rpm. Scan de gel met een filmscanner.

Representative Results

Expressie en zuivering van de affiniteit ligand Het fusie-eiwit DFE werd uitgedrukt in transgene tabaksplanten geteeld in een kas. De opbrengst was ~ 120 mg · kg-1 blad massa met een gemiddelde biomassa van ~ 130 g per plant. De zuiverheid van DFE was 97% van de host-celeiwitten. De blancheren stap was eenvoudig te integreren in de oogst-en extractie routine (Figuur 1) en duurde minder dan 2 uur extra tijd, inclusief het instellen van het waterbad. Het totale herstel van DFE was 23,5 mg kg1 met een zuiverheid van > 90%. De stappen die verantwoordelijk zijn voor productverlies waren Blanching, diepte filtratie en IMAC, met specifieke verliezen van respectievelijk 40%, 27% en 45%. De diepte-filtercapaciteit was gemiddeld 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) en dus in het bovenste bereik van waarden gerapporteerd in de literatuur21. De DFE-opbrengst steeg met de plant leeftijd (Figuur 2). Immobilisatie van de affiniteit ligand op de NHS-geactiveerde chromatografie kolommen Tijdens de eerste koppelings tests constateerden we dat HEPES-buffer (pH 8,3) de koppelings efficiëntie verhoogde tot 89 ± 6% (± SD, n = 3) vergeleken met 78 ± 9% (± SD, n = 3) voor de bicarbonaat buffer die door de fabrikant wordt aanbevolen. Daarom werd HEPES gebruikt voor alle daaropvolgende koppelings experimenten. Er werd gekozen voor een DoE-aanpak om de koppelings efficiëntie van DFE te optimaliseren voor door NHS geactiveerde gecrosskoppelde agarose-hars. De absolute hoeveelheid DFE geïmmobiliseerd op de hars steeg met de massa van DFE geïnjecteerd in de kolom en plateaued op ~ 15 g · L-1 terwijl de koppelings opbrengst continu daalde naarmate er meer DFE werd geïnjecteerd (Figuur 2). De koppelings opbrengst was ook > 50% lager in een zure buffer, wat aangeeft dat voor elke ligand per geval moet worden voorzien in geschikte koppelings condities. Ideale omstandigheden in termen van koppelings rendement, absolute hoeveelheid geïmmobiliseerde DFE-en kolom kosten werden geïdentificeerd met behulp van de numerieke optimalisatie tool van de DoE-software. De meest wenselijke omstandigheden (pH 9,0 en 7,0 mg DFE per 1 mL kruisgebonden agarose hars) bevonden zich op een groot plateau en waren daarom robuust. De DFE-moleculen behouden hun rode fluorescentie, zelfs na de koppeling, en de kleurintensiteit kwam overeen met de totale hoeveelheid geïmmobiliseerde DFE (Figuur 2). Daarom kan kolom kleur worden gebruikt als een eenvoudige parameter voor kwaliteitscontrole om de koppelings efficiëntie en kolom kwaliteit te schatten. De fluorescentie bevestigde ook dat DFE fusie eiwit geassembleerd in de tetramerische staat van inheemse DsRed. Figuur 2: optimalisering van DFE-immobilisatie naar door NHS geactiveerde gecrosskoppelde agarose-hars. A) LDS-paa gel met een Western Blot-overlay van homogenaat-en elutie monsters van onblancheerde en geblancheerde TRANSGENE DFE-plantenextracten. Oogst van planten werd uitgevoerd 38, 45 of 52 dagen na seeding. Westerse blots werden uitgevoerd met behulp van een anti-his6-antilichamen5. B) het totale bedrag aan gekoppelde DFE-affiniteit ligand in afhankelijkheid van de pH-koppeling en de totale massa van GEZUIVERDE DFE GEÏNJECTEERD op NHS-geactiveerde kruislings gekoppelde agarose-kolommen. Rode stippen geven de werkelijke experimenten aan die zijn uitgevoerd om het antwoord oppervlak model te bouwen. (C) DFE-affiniteits kolommen na de koppelingsprocedure. De getallen corresponderen met de koppelings condities die zijn gemarkeerd in paneel B. DPS = Days post seeding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Testen van 2F5-isolatie met behulp van de DFE-affiniteits hars Het recombinant 2f5 antilichaam werd transitief geproduceerd in Nicotiana benthamiana planten geteeld in een Fytotron5. De inname van 2F5 uit het ruwe plantaardige extract werd getest met behulp van affiniteits kolommen in combinatie met ~ 7,0 mg gezuiverde DFE (stap 6). Elutie van proteïne A Resins gaat meestal gepaard met een zure buffer (pH ~ 3,3)13. Daarom evalueerden we in eerste instantie verschillende laagph-elutie buffers (pH 6.0 – 3,25) voor de DFE-kolommen. De elutie van 2F5 was succesvol bij pH-waarden onder 4,5 met het hoogste herstel van ~ 35% bij pH 3,25. Echter, lage-pH elutie geïnactiveerd zowel het antilichaam (zoals bevestigd door de SPR-spectrometrie) en de DFE ligand (zoals aangegeven door het verlies van de kleur en de onderste DBC, Figuur 3). De laatste werd verwacht gezien het feit dat inheemse dsred denatureert bij pH < 4.022,23. Om product-en ligand denaturatie te voorkomen, testten we magnesium chloride als alternatief elutie-middel omdat het eerder is gebruikt om MABS te Elueer van andere affiniteits harsen24. Een magnesium chloride-concentratie van 1,25 M was voldoende om 2F5 uit de DFE-affiniteits hars te eldelen met een terugwinning van 105 ± 11% (± SD, n = 3) en een zuiverheid van 97 ± 3% (± SD, n = 3). Deze voorstelling was vergelijkbaar met proteïne A Resins25,26. De constante van de evenwichts dissociatie (KD) van het DFE-gezuiverde 2F5-antilichaam en de synthetische ligand Fuzeon was 791 pM, terwijl die van een proteïne a-gezuiverde tegenhanger 763 pm5was. Bovendien werd geen substantieel kleurverlies waargenomen in de hars over een totaal van 25 BIND-en-elute cycli. De DBC van de DFE-affiniteits hars bij 10% 2F5 doorbraak daalde lineair in de loop van 25 cycli tot ~ 15% van de initiële waarde (Figuur 3). Figuur 3: testen van de isolatie van 2F5 uit geklaarde plantenextracten met behulp van de DFE-affiniteits harsen. A) DFE-affiniteits harsen na één elutie cyclus met buffers met verschillende pH-waarden in het bereik 4,0 – 3,0 en dezelfde harsen na een neutralisatie stap bij pH 6,0. B) DFE-affiniteits harsen na één en zes cycli van 2F5-zuivering met 1,25 m of 4,00 m magnesium chloride als eluent. C) chromatogrammen van frontale belastingsexperimenten (Doorbreek curven) om de cyclus afhankelijke dynamische bindingscapaciteit van DFE-hars met magnesium chloride als eluent te bepalen. De Doorbreek curven werden gemeten voor 4,0 M en 1,25 M magnesium chloride elutie buffers en verschillende cyclus nummers. D) cyclus afhankelijke dynamische bindingscapaciteit van DFE met 1,25 M magnesium chloride als eluent. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Toepassingen van de roman Affinity hars

We hebben aangetoond dat aangepaste affiniteits chromatografie harsen voor de inname van MABS kunnen worden vervaardigd door het immobiliseren van een ligand met een MAB-specifieke epitoop aan NHS-geactiveerde cross-linked agarose. Om zo’n hars te ontwerpen, was het noodzakelijk om de epitoop sequentie te kennen en een lineaire epitoop te gebruiken. De resulterende harsen zijn voordelig voor de inname van mAbs omdat ze mogelijk dure eiwitten een affiniteits chromatografie stappen zouden kunnen vervangen. De interactie tussen 2F5 en DFE in onze casestudy werd gemedieerd door epitope-paratope binding, dus onze ligand moet selectiever zijn dan proteïne A, die bindt aan de FC-regio van de meeste Murine en menselijke IgGs. Omdat individuele liganden nodig zijn voor elke mAb, kan onze methode in eerste instantie lijken vooral geschikt voor antilichamen die op zeer grote schaal worden geproduceerd. Door onze aanpak te combineren met een snelle, op planten gebaseerde, voorbijgaande eiwit expressie kunnen nieuwe affiniteits liganden echter in minder dan 2 weken²⁷ worden bereid met minimale inspanning²⁸. Daarom is de methode ook geschikt voor kleinschalige mAb-zuivering.

Productie en mogelijke verbeteringen van de affiniteit ligand

Planten bieden een snel en veilig productieplatform voor affiniteit liganden⁵^,²⁹^,³⁰, zoals de DFE Fusion Protein uit onze casestudy. Door het plantenmateriaal te blancheren werd de hoeveelheid celeiwitten in één stap sterk gereduceerd en werd het eenvoudig geïntegreerd in een standaard klarings routine. Echter, het herstel van de ligand was laag in de huidige setup, waarschijnlijk te wijten aan de gematigde thermische stabiliteit en sommige niet-specifieke binding aan de filter lagen, zoals gerapporteerd voor andere producten³¹^,³²^,³³. Engineering van de vervoerder om de thermische stabiliteit te verhogen kan daarom helpen om de ligand opbrengst in de toekomst te verbeteren, zoals beschreven voor de malaria vaccin kandidaat CCT, de antitumorale enzym PpADI of een mesophilische β-glucosidase³⁴^, ³⁵^,³⁶. Hetzelfde geldt voor de diepte filtratie stap, waar de eiwit techniek kan helpen om niet-specifieke binding aan het filtermateriaal³⁷te verminderen. De productiekosten voor DFE en soortgelijke liganden kunnen ook worden verlaagd door de algemene efficiëntie van verduidelijking met behulp van flocculanten of filter additieven³⁸^,³⁹te verbeteren.

Wanneer dsred wordt gebruikt als een vervoerder, vormt het een tetramere complex. Dit is voordelig omdat het verhoogt het aantal epitopen per ligand, maar het kan ook de ligand meer vatbaar voor demontage of denaturatie tijdens de affiniteits chromatografie. Een monomerische dragerproteïne zoals mcherry kan daarom de voorkeur hebben, omdat het stabiel is bij lage pH⁴⁰, en de opname van tandem herhalingen van de epitoop de avidity van de ligand zou verhogen en zo de hars capaciteit⁵zou verhogen^, ²⁶ ^, ⁴¹. voor eenvoudige drager-epitope eiwitten (d.w.z. mensen zonder bisulfide obligaties of post-translationele modificaties) kunnen microbiële productiesystemen de productiekosten verlagen en de liganden concurrerender maken met proteïne A. Zo is groen fluorescerend eiwit uitgedrukt in bacteriële cellen met een rendement van ~ 1 g · kg^-1 biomassa, wat de ligand productiekosten aanzienlijk zou verminderen⁴².

Ongeacht de expressie-host, een gezuiverde affiniteit ligand was vereist tijdens de koppeling om te minimaliseren van de immobilisatie van host-cel eiwitten of media-onderdelen die anderszins hars selectiviteit en capaciteit kunnen verminderen. De opname van een poly-histidine-tag voor de iMac-zuivering verhoogde de zuiverheid tot ~ 90% in één stap, waardoor snelle en goedkope ligand productie⁵^,⁴³^,⁴⁴werd vergemakkelijkt. De positie van de Fusion-tag is echter belangrijk omdat het de potentie heeft om de epitoop binding te hinderen of om het decolleté van de tag of de epitoop van de drager⁴⁵^,⁴⁶te induceren.

Immobilisatie van de affiniteit ligand op de NHS-geactiveerde chromatografie kolommen

Immobilisatie werd handmatig uitgevoerd of met behulp van een chromatografie systeem. De kleine buffer volumes per kolom leken de handmatige behandeling te bevoordelen (bijvoorbeeld vanwege de minimale afvalvolumes). Als echter meerdere/grotere kolommen nodig zijn, maakt het chromatografie systeem de koppelings condities gemakkelijker te controleren (bijv. gereguleerde stromingssnelheden) en is het daarom waarschijnlijker dat er reproduceerbare resultaten worden bereikt in termen van DBC. Onze gegevens suggereren dat de koppelings buffer en pH een belangrijk effect hebben op de koppelings efficiëntie en de totale kolom kosten. Screening factoren die de koppelingsreactie beïnvloeden en deze aanpassen voor elk dragereiwit (of zelfs voor elke drager-ligand fusie) kunnen daarom de koppelings efficiëntie en de hars prestaties verbeteren, en we bevelen deze aanpak aan.

Testen van 2F5-isolatie met behulp van de DFE-affiniteits hars

Product opbrengst en zuiverheid zijn belangrijke aspecten van de hars prestaties, en in het geval van DFE bereikten we een rendement van 105 ± 11% (± SD, n = 3) en een zuiverheid van 97 ± 3% (± SD, n = 3), wat vergelijkbaar is met de prestaties van benchmark-eiwit A Resins²⁵ ^,²⁶. Een andere belangrijke prestatie-indicator voor harsen in het algemeen (en in het bijzonder voor mensen op basis van affiniteits liganden) is de DBC met een product doorbraak van 10%, omdat deze parameter de hoeveelheid hars beïnvloedt die nodig is voor een specifiek proces en dus de kosten. Voor de DFE ligand was de eerste DBC ~ 4 g · L^-1 hars, dat is ~ 13% van de overeenkomstige waarde voor proteïne A onder vergelijkbare omstandigheden (slechts 2 min contacttijd)²⁵^,⁴⁷ maar ongeveer 15-voudige hoger in vergelijking met andere aangepaste affiniteit harsen zoals de anti-FSH-immunoaffinity ligand met dezelfde verblijfstijd van 2 min⁴⁸. De DBC van DFE daalde tot 15% van de startwaarde na 25 BIND-en-elute cycli, terwijl meer dan 50 cycli nodig zijn voor hetzelfde verlies van DBC in commerciële eiwitten A Resins⁴⁹. Echter, het is belangrijk op te merken dat onze vervoerder is nog niet geoptimaliseerd in dezelfde mate als proteïne A, die uitvoerig is onderzocht en verbeterd in de afgelopen vier decennia⁸.

Tot nu toe hebben we de hars stabiliteit en productterugwinning verbeterd door over te schakelen van een laagph-elutie buffer naar een hoge concentratie magnesium chloride (Figuur 3), zoals aanbevolen in eerdere studies¹³. De karakteristieke rode kleur van de affiniteit ligand niet aanzienlijk vervagen tijdens de 25 BIND-en-elute cycli, dus we speculeren dat endogene plant proteasen in de geklaarde plantenextracten³¹ mei zijn afgekapt en dus geïnactiveerd de epitoop van de ligand. Daarom kan het ontwerpen van protease bestendige linkers om de drager en epitoop aan te sluiten, helpen om de initiële DBC over een uitgebreid aantal cycli te handhaven. Gezien de snelle en eenvoudige expressie en zuivering van de DFE ligand, haar eenvoudige koppeling aan commerciële chromatografie harsen, en haar uitstekende Productopbrengst en zuiverheid, zijn wij van mening dat onze methode een geschikt alternatief biedt voor proteïne A voor de zuivering van mAbs en antilichaam derivaten die niet binden aan eiwitten A, vooral als verbeteringen aan de drager en linker de DBC en ligand stabiliteit kunnen verbeteren. Deze aanname werd ondersteund door het kleine verschil in de dissociatieconstante van DFE-gezuiverde en proteïne A-gezuiverde 2F5 antilichaam⁵, wat aangeeft dat onze nieuwe affiniteit ligand het herstel van kwalitatief hoogwaardige MABS mogelijk maakt.

Voordelen en huidige beperkingen van de methode

Het produceren van de affiniteit ligand als een genetische fusie met een dragereiwit verhoogt de oplosbaarheid in waterige buffers en dus compatibiliteit met typische ligand koppelings condities. In tegenstelling, lege peptiden afgeleid van Solid phase peptide synthese kan hebben beperkte oplosbaarheid onder deze omstandigheden als gevolg van hun sequentie⁵⁰, die niet kan worden gewijzigd omdat het wordt bepaald door de aminozuursequentie van epitoop erkend door de MAB aan worden gezuiverd. Anderen hebben daarom een on-Resin synthese van peptide liganden⁵¹gebruikt. De statische binding capaciteit van de resulterende hars was hoog (~ 80 g · L^-1), maar het proces van de voorbereiding van de hars is lang, een dynamische binding capaciteit werd niet gerapporteerd en de verkregen zuiverheid en herstel waren lager dan in onze aanpak. Een bijkomend voordeel van een fusie-eiwit ligand op laboratoriumschaal is dat de ligand en varianten daarvan snel kunnen worden geproduceerd, gezuiverd en getest met minimale inspanning in een eenvoudig te gebruiken High-through expressie systeem⁵².

De twee huidige beperkingen van de hier gepresenteerde methode zijn de lage dynamische binding capaciteit van 3 g · L^-1 en zijn 90% reductie in de loop van 25 BIND-en-elute cycli⁵. Deze beperkingen kunnen in de toekomst worden aangepakt door minder strenge belastingsvoorwaarden toe te passen en de huidige DsRed Carrier te vervangen door een engineered, stabielere variant. Bijvoorbeeld, verdubbeling van de huidige contacttijd van 2 naar 4 minuten heeft de potentie om de dynamische binding capaciteit te verdubbelen zoals werd aangetoond voor sommige eiwitten A Resins²⁶.

Probleemoplossing

In de volgende tabel worden mogelijke problemen belicht die tijdens dit protocol kunnen optreden en worden hints gegeven over het oplossen ervan (tabel 1).

Tabel 1: mogelijke problemen die kunnen worden aangetroffen en mogelijke correcties.
Protocol stap	Probleem	Couse	Fix
1	Planten groeien niet	Gecompromitteerde groei voorwaarden	Controleer de pH en geleiding van de meststof
			Controleer de temperatuur en lichtomstandigheden
2 en 3	Grote hoeveelheden host-celeiwitten zijn aanwezig na extractie	Onvolledige neerslag	Controleer de temperatuur tijdens het blancheren
			Controleer de opwinding in het blancheren bad
2 en 3	Geen product gevonden in het plantenextract	Blanching temperatuur te hoog	Controleer de temperatuur en pH tijdens het blancheren
		pH in blancheren buffer te laag
3	Grote stuurpen-of blad delen blijven na extractie	Onvolledige menging in Blender	Zorg ervoor dat het plant materiaal geen stekker in de blender vormt
3	Snelle drukverhoging tijdens diepte filtratie	Onjuiste filter selectie en/of oriëntatie	Het filtertype en de afdrukstand controleren
4	Weinig fusie-eiwit tijdens elutie/veel fusie-eiwit in doorstroom	IMAC Resin werd niet opgeladen met metaalionen	Controleer of de IMAC Resin correct is opgeladen met ionen
		Fusie-eiwit verloor de affiniteits tag	Vermijd intens zonlicht en hoge temperaturen tijdens de plantenteelt
4	Fusie-eiwit verloren tijdens de concentratie	Fusie-eiwit gebonden aan het membraan	Controleer het membraan type
			Zorg ervoor dat de concentratiefactor niet te hoog is
5	Lage koppelings opbrengst	Onjuiste volgorde van toevoeging van koppelings reagens	Controleer de reagentia labels en de volgorde van de toevoeging
		Onjuiste voorbereiding van de kolommen vóór koppeling	Controleer de voorwaarden van kolom preparaiton
5 en 6	Lage mAb-opbrengst	Lage mAb-expressie in de planten biomassa	Test mAb-expressie in biomassa
		Lage ligand dichtheid	Controleer de zuiverheid van de fusie-eiwit voorbereiding
7	Zeer lage/hoge eiwit concentraties in de Bradford-test	Bellenvorming tijdens pipetteren	Controleren op bubbels in de 96-well Blaha
7	Lage mAb-concentratie tijdens de SPR-meting	Gecompromitteerde eiwitten een chip	Vergelijk met de resultaten van standaard mAb met bekende concentratie
		Onjuiste monster verdunning	Controleer de verdunningsgraad en de buffer

Tabel 1: probleemoplossing.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Ibrahim al Amedi graag erkennen voor het cultiveren van de transgene tabaksplanten en Dr. Thomas Rademacher voor het leveren van de tabaks uitdrukking vector. De schrijvers willen Dr. Richard M. Twyman bedanken voor redactioneel hulp en Markus Sack voor vruchtbare discussies over de ligand-structuur van de DFE-affiniteit. Dit werk werd deels gefinancierd door de interne Programma’s van de Fraunhofer-Gesellschaft onder Grant No. Attract 125-600164 en de staat Noord-Rijnland-Westfalen onder het Leistungszentrum Grant No. 423 “netwerk, adaptieve productie”. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de onderzoeksgroep “tumor-gerichte medicijn bezorging” Grant 331065168. GE Healthcare ondersteunde de Open-Access publicatie van dit artikel.

Materials

10L/20L Bucket	n/a	n/a	Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
ÄKTApure	GE Helthcare	29018226	Chromatography system
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	Centrifuge
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Antibody 2G12	Fraunhofer IME	n/a	Standard for SPR quantification
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Fuhr	2632410001	Bag filter
CanoScan 5600F	Canon	2925B009	Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chelating Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	Chromatography resin
Cond 3320	WTW	EKA 3338	Conductometer
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n/a	DoE software
Discovery Compfort	Gilson	F81029	Multichannel pipette
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Diverse bottles	Schott Duran	n/a	Glas bottles
Dri Block DB8	Techne	Z381373	Heat block
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	Buffer component
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	Plate reader
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	Thermometer
F9-C	GE Helthcare	29027743	Fraction collector
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200	Hettich	2400	Centrifuge
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	17-0716-01	Chromatography columns
Hydrochloric acid	Carl Roth GmbH	4625.1	Buffer component
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	Buffer component
K700	Pall	5302305	Depth filter layer
KM02 basic	IKA	n/a	Magnetic stirrer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Immersion circulator
Magnesium chloride	Carl Roth GmbH	KK36.2	Buffer component
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm	Sartorius	16534K	Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter	Thermo Fischer Scientific	595-4520	Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate	Carl Roth GmbH	T111.1	Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer	Invitrogen	NP0002	Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant	Invitrogen	NP0005	Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa)	Invitrogen	26616	Protein standart
Perforated bucked	n/a	n/a	Blanching
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatography resin
Silicone spoon	n/a	n/a	Spoon
Simply Blue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Gel staining solution
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	6773.1	Buffer component
Sodium acetate	Carl Roth GmbH	X891.1	Media component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-100G	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Buffer component
Sodium citrate	Carl Roth GmbH	HN13.2	Buffer component
Sodium bisulfite	Carl Roth GmbH	243973-100G	Media component
Sodium phosophate	Carl Roth GmbH	T877.2	Media component
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer	Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics	n/a	SPR device
SSM3	Stuart	10034264	Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L	Clatronic	n/a	Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL	B. Braun	4606027V	Syringes
Syringe adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	Syringe adapter
TE6101	Sartorius	TE6101	Precision scale
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	Buffer component
Unicorn 6.4	GE Helthcare	29056102	Chromatography software
Vacuum bags	Ikea	203.392.84	Plant storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
XK-26/20 column housing	GE Helthcare	28-9889-48	Chromtography column

References

Kesik-Brodacka, M. Progress in biopharmaceutical development. Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (3), 306-322 (2018).
Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
Jayapal, K., Wlaschin, K. F., Hu, W. S., Yap, M. G. S. Recombinant Protein Therapeutics from CHO Cells – 20 Years and Counting. Chemical Engineering Progress. 103, 40-47 (2007).
Kunert, R., Reinhart, D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (8), 3451-3461 (2016).
Rühl, C., Knödler, M., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. A linear epitope coupled to DsRed provides an affinity ligand for the capture of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1571, 55-64 (2018).
Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R., Sack, M. Antibodies from plants for bionanomaterials. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1462 (2017).
Buyel, J. F., Fischer, R. Very-large-scale production of antibodies in plants: The biologization of manufacturing. Biotechnology Advances. 35 (4), 458-465 (2017).
Bolton, G. R., Mehta, K. K. The role of more than 40 years of improvement in protein A chromatography in the growth of the therapeutic antibody industry. Biotechnology Progress. 32 (5), 1193-1202 (2016).
Kelley, B. Industrialization of mAb production technology: the bioprocessing industry at a crossroads. MAbs. 1 (5), 443-452 (2009).
Brochier, V., Ravault, V. High throughput development of a non protein A monoclonal antibody purification process using mini-columns and bio-layer interferometry. Engineering in Life Sciences. 16 (2), 152-159 (2016).
Arakawa, T., Futatsumori-Sugai, M., Tsumoto, K., Kita, Y., Sato, H., Ejima, D. MEP HyperCel chromatography II: binding, washing and elution. Protein Expression and Purification. 71 (2), 168-173 (2010).
Barroso, T. B., Aguiar-Ricardo, R. J., Roque, A. C. Structural evaluation of an alternative Protein A biomimetic ligand for antibody purification. Journal of Computer-aided Molecular Design. 28 (1), 25-34 (2014).
Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O’Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography A. 1415, 83-90 (2015).
Sack, M., et al. Functional analysis of the broadly neutralizing human anti-HIV-1 antibody 2F5 produced in transgenic BY-2 suspension cultures. FASEB Journal. 21 (8), 1655-1664 (2007).
Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study. Journal of Visualized Experiments. (83), 51216 (2014).
Trasatti, J. P., Woo, J., Ladiwala, A., Cramer, S., Karande, P. Rational design of peptide affinity ligands for the purification of therapeutic enzymes. Biotechnology Progress. 34 (4), 987-998 (2018).
Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochemical Engineering Journal. 88, 162-170 (2014).
Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Current Protocols in Molecular Biology. 76 (Chapter 10), (2006).
Buyel, F. J., Kaever, T., Buyel, J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotchnology and Bioengeneering. 110 (2), 471-483 (2013).
Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods in Molecular Biology. 503, 65-88 (2009).
Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnology Journal. 9 (3), 415-425 (2014).
Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (22), 11984-11989 (2000).
Vrzheshch, P. V., Akovbian, N. A., Varfolomeyev, S. D., Verkhusha, V. V. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Letters. 487 (2), 203-208 (2000).
Firer, M. A. Efficient elution of functional proteins in affinity chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 433-442 (2001).
Pabst, T. M., et al. Engineering of novel Staphylococcal Protein A ligands to enable milder elution pH and high dynamic binding capacity. Journal of Chromatography A. 1362, 180-185 (2014).
Müller, E., Vajda, J. Routes to improve binding capacities of affinity resins demonstrated for Protein A chromatography. Journal of Chromatography B. 1021, 159-168 (2016).
Shamloul, M., Trusa, J., Vadim, M., Vidadi, Y. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. Journal of Visualized Experiments. (86), 51204 (2014).
Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
Saxena, L., Iyer, B. K., Ananthanarayan, L. Purification of a bifunctional amylase/protease inhibitor from ragi (Eleusine coracana) by chromatography and its use as an affinity ligand. Journal of Chromatography. B. 878 (19), 1549-1554 (2010).
Kurppa, K., Reuter, L. J., Ritala, A., Linder, M. B., Joensuu, J. J. In-solution antibody harvesting with a plant-produced hydrophobin-Protein A fusion. Plant Biotechnology Journal. 16 (2), 404-414 (2018).
Menzel, S., et al. Optimized Blanching Reduces the Host Cell Protein Content and Substantially Enhances the Recovery and Stability of Two Plant-Derived Malaria Vaccine Candidates. Frontiers in Plant Science. 7 (159), 1-7 (2016).
Yigzaw, Y., Piper, R., Tran, M., Shukla, A. A. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification. Biotechnology Progress. 22 (1), 288-296 (2006).
Menzel, S., et al. Downstream processing of a plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate. Protein Expression and Purification. 152, 122-130 (2018).
Vöpel, N., Boes, A., Edgü, G., Beiss, V. Malaria vaccine candidate antigen targeting the pre-erythrocytic stage of Plasmodium falciparum produced at high level in plants. Biotechnology Journal. 9 (11), 1435-1445 (2014).
Lee, C. W., Wang, H. J., Hwang, J. K., Tseng, C. P. Protein thermal stability enhancement by designing salt bridges: a combined computational and experimental study. PLoS ONE. 9 (11), e112751 (2014).
Zhu, L., Cheng, F., Piatkowski, V., Schwaneberg, U. Protein engineering of the antitumor enzyme PpADI for improved thermal resistance. Chembiochem. 15 (2), 276-283 (2014).
Khanal, O., et al. Contributions of depth filter components to protein adsorption in bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1938-1948 (2018).
Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5 (2), 138-142 (2014).
Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. Journal of Visualized Experiments. (110), e53940 (2016).
Fink, D., et al. Ubiquitous expression of the monomeric red fluorescent protein mCherry in transgenic mice. Genesis. 48 (12), 723-729 (2010).
Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. Journal of Chromatography A. 1221, 57-70 (2012).
Figueira, M., Laramée, L., Murrell, J. C., Groleau, D., Míguez, C. Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 195-200 (2001).
Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in enzymology. 326, 245-254 (2000).
Sainsbury, F., Jutras, P. V., Vorster, J., Goulet, M., Michaud, D. A. Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science. 7, 141-141 (2016).
Krupka, M., et al. The Position of His-Tag in Recombinant OspC and Application of Various Adjuvants Affects the Intensity and Quality of Specific Antibody Response after Immunization of Experimental Mice. PLoS ONE. 11 (2), e0148497 (2016).
Goel, A., et al. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct. Biochimica et Biophysica Acta. 1523 (1), 13-20 (2000).
Tustian, A. D., et al. Development of a novel affinity chromatography resin for platform purification of bispecific antibodies with modified protein a binding avidity. Biotechnology Progress. , (2018).
Zandian, M., Jungbauer, A. An immunoaffinity column with a monoclonal antibody as ligand for human follicle stimulating hormone. Journal of Separation Science. 32 (10), 1585-1591 (2009).
Kelley, B. Very large scale monoclonal antibody purification: the case for conventional unit operations. Biotechnology Progress. 23 (5), 995-1008 (2007).
Petrou, C., Sarigiannis, Y., S, K. o. u. t. s. o. p. o. u. l. o. s. Ch. 1. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering. , 1-21 (2018).
Menegatti, S., et al. Design of protease-resistant peptide ligands for the purification of antibodies from human plasma. Journal of Chromatography A. 1445, 93-104 (2016).
Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , 1-7 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins – Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

Automatically Generated