Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)
Summary
Este protocolo demuestra la detección simultánea de especies reactivas de oxígeno (ROS), células vivas y células muertas en cultivos primarios vivos a partir de células de superficie ocular de ratón. 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodida, y Hoechst tinción se utilizan para evaluar el ROS, las células muertas y las células vivas, respectivamente, seguido de imágenes y análisis.
Abstract
La superficie ocular se somete a un desgaste regular debido a diversos factores ambientales. La exposición a la radiación UV-C constituye un riesgo para la salud en el trabajo. Aquí, demostramos la exposición de las células madre primarias desde la superficie ocular del ratón a la radiación UV-C. La formación reactiva de especies de oxígeno (ROS) es la lectura de la extensión del estrés oxidativo/daño. En un entorno experimental in vitro, también es esencial evaluar el porcentaje de células muertas generadas debido al estrés oxidativo. En este artículo, demostraremos la tinción de 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) de las células madre madre de la superficie ocular primaria del ratón expuestas a UV-C y su cuantificación basada en las imágenes fluorescentes de la tinción DCFDA. La tinción DCFDA corresponde directamente a la generación ROS. También demostramos la cuantificación de células muertas y vivas mediante la tinción simultánea con yoduro de propidium (PI) y Hoechst 3332 respectivamente y el porcentaje de células DCFDA (ROS positivas) e PI positivas.
Introduction
La superficie ocular (OS) es una unidad funcional compuesta principalmente por la capa externa y la epitelia glandular de la córnea, la glándula lacrima, glándula meibomiana, conjuntiva, parte de los márgenes del párpado e inervaciones que transducen las señales1. La capa corneal transparente en forma de cúpula enfoca la luz en la retina. Este tejido avascular se compone de componentes celulares como células epiteliales, queratocitos, y células endoteliales y componentes acelulares como colágeno y glicosaminoglicanos2. El área es drenada por lágrimas que también suministran la mayoría de los nutrientes. La posición anatómica del sistema operativo lo obliga a estar en contacto directo con el entorno externo, a menudo exponiéndolo a varios componentes agresivos como luz brillante, microbios, partículas de polvo y productos químicos. Este factor predispone el sistema operativo a lesiones físicas y lo hace propenso a diversas enfermedades.
El estrés oxidativo se debe al desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos endógenos de defensas antioxidantes3. ROS se clasifican en moléculas reactivas y radicales libres, ambos derivados del oxígeno molecular (O2) a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial4. El primer grupo está compuesto por especies no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2),el oxígeno singlete (1O2) y el segundo incluye especies como aniones de superóxido (O2–), y radicales hidroxilo (•OH), entre otras. Estas moléculas son subproductos de los procesos celulares normales y sus funciones se han implicado en funciones fisiológicas importantes como la transducción de señales, la expresión génica y la defensa del huésped5. Se sabe que se genera una mayor producción de ROS en respuesta a factores como la invasión de patógenos, los xenobióticos y la exposición a la radiación ultravioleta (UV)4. Esta sobreproducción de ROS da como resultado estrés oxidativo que conduce al daño de moléculas como ácidos nucleicos, proteínas y lípidos6.
La luz solar natural, la fuente más predominante de radiación UV, se compone de UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) y UV-C (290–200 nm)7. Se ha notificado una correlación inversa entre la longitud de onda y las energías espectrales. Aunque las radiaciones UV-C naturales son absorbidas por la atmósfera, las fuentes artificiales como las lámparas de mercurio y los instrumentos de soldadura emiten y, por lo tanto, constituyen un riesgo ocupacional. Los síntomas de la exposición a los ojos incluyen fotoqueratitis y fotoqueratoconjuntivitis8. La producción de ROS es uno de los principales mecanismos para infligir daño celular inducido por rayos UV9. En el estudio actual, demostramos la detección de ROS utilizando el método de tinción de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) de 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein a través de la enfermedad en células de superficie ocular primarias de ratón/células madre expuestas a UV-C. La fluorescencia verde fue capturada mediante microscopía fluorescente. Las células estaban manchadas con dos colorantes, Hoechst 33342 y yoduro de propidium rojo, para manchar las células vivas y muertas, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de tinción DCFDA descrito aquí permite la visualización de ROS en células vivas oculares primarias de ratón tratadas con radiación UV-C. Una ventaja de este método de tinción es que también permite a los investigadores estudiar los efectos inmediatos de UV-C (3 horas después de la exposición UVC) en las células vivas y su enumeración simultánea para el porcentaje de ROS positivo, así como, las células muertas. Además, a medida que el método de tinción se utiliza en las células vivas, las c?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo del Centro de Investigación Yenepoya, Yenepoya (considerada universidad) a las infraestructuras.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
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