Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб
Summary
Этот протокол демонстрирует одновременное обнаружение реактивных видов кислорода (ROS), живых клеток и мертвых клеток в живых первичных культурах из клеток поверхности мыши. 2′,7′-Dichlorofluorescececetate, пропидий йодида, и Hoechst окрашивания используются для оценки ROS, мертвых клеток, и живых клеток, соответственно, а затем изображения и анализа.
Abstract
Глазная поверхность подвергается регулярному износу из-за различных факторов окружающей среды. Воздействие УФ-С представляет опасность для здоровья работников. Здесь мы демонстрируем воздействие первичных стволовых клеток с поверхности мышки глазной поверхности на ультрафиолетовое излучение. Формирование реактивных видов кислорода (ROS) является считывателем степени окислительного стресса/повреждения. В экспериментальной обстановке in vitro также важно оценить процент мертвых клеток, генерируемых из-за окислительного стресса. В этой статье мы продемонстрируем 2′,7′-Dichlorofluorescececetate (DCFDA) окрашивание УФ-C подвергаются мыши первичных глазных стволовых клеток и их количественной оценки на основе флуоресцентных изображений DCFDA окрашивания. ОКрашивание DCFDA напрямую соответствует поколению ROS. Мы также демонстрируем количественную оценку мертвых и живых клеток путем одновременного окрашивания с пропидий йодид (PI) и Hoechst 3332 соответственно и процент DCFDA (ROS положительные) и PI положительные клетки.
Introduction
Глазная поверхность (ОС) является функциональным устройством, состоящим в основном из внешнего слоя и железистой эпителии роговицы, лахримальной железы, мейбомианской железы, конъюнктивы, части поля крышки глаза и иннервации, которые преобразовывают сигналы1. Прозрачный слой роговицы в форме купола фокусирует свет на сетчатке. Эта васкулярная ткань состоит из клеточных компонентов, таких как эпителиальные клетки, кератоциты, эндотелиальные клетки и ацеллические компоненты, такие как коллаген и гликозаминогликан2. Область осушена слезами, которые также поставляют большую часть питательных веществ. Анатомическое положение ОС заставляет ее находиться в непосредственном контакте с внешней средой, часто подвергая ее различным суровым компонентам, таким как яркий свет, микробы, частицы пыли и химические вещества. Этот фактор предрасполагает ОС к физическим травмам и делает ее подверженной различным заболеваниям.
Оксидативный стресс вызван из-за дисбаланса между производством реактивных видов кислорода (ROS) и эндогенных антиоксидантных защитных механизмов3. ROS классифицируются на реактивные молекулы и свободные радикалы, оба из которых получены из молекулярного кислорода (O2) через митохондриальную окислительную фосфорилатацию4. Первая группа состоит из нерадикальных видов, таких как перекись водорода (H2O2), синглетный кислород (1O2) и последний включает в себя такие виды, как супероксидные анионы (O2–), и гидроксиловые радикалы (З.OH), среди других. Эти молекулы являются побочными продуктами нормальных клеточных процессов и их роли были вовлечены в важные физиологические функции, такие как трансдукция сигнала, экспрессия генов, и принимающей защиты5. Увеличенное производство ROS, как известно, генерируется в ответ на такие факторы, как патогенвторжения, ксенобиотики, и воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения4. Это перепроизводство ROS приводит к окислительному стрессу, что приводит к повреждению молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки и липиды6.
Природный солнечный свет, наиболее преобладающий источник УФ-излучения, состоит из УФ-А (400-320 нм), УФ-В (320-290 нм) и УФ-С (290-200 нм)7. Сообщалось об обратной корреляции между длиной волны и спектральными энергиями. Хотя естественные ультрафиолетовые излучения поглощаются атмосферой, искусственные источники, такие как ртутные лампы и сварочные приборы, испускают и, следовательно, представляют собой профессиональную опасность. Симптомы воздействия на глаза включают фотокератит и фотокератоконъюнктивит8. Производство ROS является одним из основных механизмов нанесения УФ индуцированного клеточного повреждения9. В текущем исследовании, мы демонстрируем обнаружение ROS с помощью 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein диацетат акцентратат (DCFDA) окрашивающий метод в мыши первичных глазных поверхностных клеток / стволовых клеток, подверженных УФ-C. Зеленая флуоресценция была захвачена с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки были противозапятнаны двумя красителем, Hoechst 33342 и красным йодидом propidium, чтобы испачкать живые и мертвые клетки, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод окрашивания DCFDA позволяет визуализировать ROS в первичных глазных живых клетках мыши, обработанных ультрафиолетовым излучением. Преимущество этого метода окрашивания является то, что он также позволяет исследователям изучить непосредственное воздействие УФ-С (3 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержку инфраструктурных объектов исследовательского центра «Енепоя» (Университет).
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
