Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)
Summary
Este protocolo demonstra a detecção simultânea de espécies de oxigênio reativa (ROS), células vivas e células mortas em culturas primárias vivas de células superficiais do rato. 2′,7′-Diclorofluoresceindiacetato, iodeto de propídio e coloração hoechst são usados para avaliar o ROS, células mortas e células vivas, respectivamente, seguidas de imagem e análise.
Abstract
A superfície ocular é submetida a desgaste regular devido a vários fatores ambientais. A exposição à radiação UV-C constitui um risco para a saúde ocupacional. Aqui, demonstramos a exposição de células-tronco primárias da superfície ocular do rato à radiação UV-C. A formação de espécies de oxigênio reativo (ROS) é a leitura da extensão do estresse/dano oxidativo. Em um ambiente in vitro experimental, também é essencial avaliar o percentual de células mortas geradas devido ao estresse oxidativo. Neste artigo, demonstraremos a coloração de 2′,7′-Diclorofluoresceindiacetato (DCFDA) de células-tronco primárias de superfície ocular exposta do rato UV-C e sua quantificação com base nas imagens fluorescentes da coloração DCFDA. A coloração DCFDA corresponde diretamente à geração ROS. Demonstramos também a quantificação de células mortas e vivas por coloração simultânea com iodeto de propídio (PI) e Hoechst 3332, respectivamente, e o percentual de células Positivas DCFDA (ROS positivo) e PI.
Introduction
A superfície ocular (OS) é uma unidade funcional composta principalmente pela camada externa e epíterlia glandular de córnea, glândula lacrimosa, glândula meibomiana, conjuntiva, parte das margens da tampa ocular e invações que transducam sinais1. A camada córnea em forma de cúpula transparente foca luz na retina. Este tecido avascular é composto por componentes celulares, como células epiteliais, ceratocitos e células endoteliais e componentes acelulares, como colágeno e glicosaminoglicanos2. A área é drenada por lágrimas que também fornecem a maioria dos nutrientes. A posição anatômica do SO obriga-o a estar em contato direto com o ambiente externo, muitas vezes expondo-o a vários componentes ásperos, como luz brilhante, micróbios, partículas de poeira e produtos químicos. Esse fator predispõe o SO a lesões físicas e o torna propenso a várias doenças.
O estresse oxidativo é causado devido ao desequilíbrio entre a produção de espécies de oxigênio reativa (ROS) e os mecanismos endógenos de defesa antioxidante3. Ros são classificados em moléculas reativas e radicais livres, ambos derivados de oxigênio molecular (O2) através da fosforilação oxidativa mitocondrial4. O antigo grupo é composto por espécies não radicais como peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlet (1O2) e este último inclui espécies como anões de superóxido (O2–) e radicais hidroxilos(• OH),entre outras. Essas moléculas são subprodutos de processos celulares normais e seus papéis foram implicados em importantes funções fisiológicas, como transdução de sinal, expressão genética e defesa hospedeira5. Sabe-se que uma produção aprimorada de ROS é gerada em resposta a fatores como invasão de patógenos, xenobióticos e exposição à radiação ultra violeta (UV)4. Essa superprodução de ROS resulta em estresse oxidativo que leva ao dano de moléculas como ácidos nucleicos, proteínas e lipídios6.
A luz solar natural, a fonte mais predominante de radiação UV, é composta por UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) e UV-C (290-200 nm)7. Uma correlação inversa entre o comprimento de onda e as energias espectrais foi relatada. Embora as radiações NATURAIS UV-C sejam absorvidas pela atmosfera, fontes artificiais como lâmpadas de mercúrio e instrumentos de soldagem emitem e, portanto, constituem um risco ocupacional. Os sintomas de exposição aos olhos incluem fotoqueratite e fotoqueratoconjuntivite8. A produção de ROS é um dos principais mecanismos de infligir danos celulares induzidos por UV9. No presente estudo, demonstramos a detecção de ROS utilizando o método de colorcetato diacetato de 2′,7′-Diclororodihidrofluorescena (DCFDA) em células de superfície ocular primárias do camundongo/células-tronco expostas ao UV-C. A fluorescência verde foi capturada usando microscopia fluorescente. As células foram contra-manchadas com dois corantes, Hoechst 33342 e iodeto de propídio vermelho, para manchar as células vivas e mortas, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de coloração DCFDA descrito aqui permite a visualização de ROS em células vivas oculares primárias do camundongo tratadas com radiação UV-C. Uma vantagem desse método de coloração é que ele também permite que os pesquisadores estudem os efeitos imediatos da UV-C (3 horas após a exposição ao UVC) nas células vivas e sua enumeração simultânea para a porcentagem de ros positivo, bem como, células mortas. Além disso, como o método de coloração é usado nas células vivas, as células podem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio do Centro de Pesquisa Yenepoya, Yenepoya (Considerado Universidade) para as instalações de infraestrutura.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
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