הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק
Summary
פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי הסימולטני של מינים חמצן תגובתי (ROS), תאים חיים, ותאים מתים בתרבויות הראשיות חי מפני העכבר משטח העינית תאים. 2 ‘, 7 ‘-diלורופלוט אצטט, propidium יודיד, וכתמים הופסט משמשים כדי להעריך את רוס, תאים מתים, ותאים חיים, בהתאמה, ואחריו הדמיה וניתוח.
Abstract
משטח העינית נתון לבלאי רגיל ולקריעה בשל גורמים סביבתיים שונים. חשיפה לקרינת UV-C מהווה סיכון בריאותי תעסוקתי. כאן, אנו להדגים את החשיפה של תאי גזע ראשוני מן העכבר העינית משטח לקרינת UV-C. מינים חמצן תגובתי (ROS) היווצרות היא הבדיקה של היקף לחץ חמצוני/נזק. ב ניסיוני בקביעת חוץ גופית, זה חיוני גם כדי להעריך את אחוז התאים המתים שנוצרו עקב לחץ חמצוני. במאמר זה, אנו נדגים את 2 ‘, 7 ‘-Diלורוofluorescl (DCFDA) כתמים של UV-C חשוף העכבר הראשי משטח העינים הפנים בתאי גזע ואת הקוונפיקציה שלהם מבוסס על תמונות פלורסנט של DCFDA כתמים. DCFDA מכתים ישירות מתאים לדור ROS. אנו גם להדגים את הקוונפיקציה של תאים מתים וחיים על ידי מכתים בו זמנית עם propidium יודיד (PI) ו Hoechst 3332 בהתאמה ואת אחוז DCFDA (ROS חיוביים) ו PI חיובי תאים.
Introduction
המשטח העינית (OS) היא יחידה תפקודית המורכבת בעיקר של השכבה החיצונית epithelia של קרנית, בלוטת la, בלוטת מייבואן, לחמית, חלק משולי מכסה העין ו innervations שינוי אותות1. שכבת הקרנית בצורת הכיפה השקופה מתמקדת באור על הרשתית. זו רקמה נמק העצם מורכב מרכיבים סלולריים כגון תאים אפיתל, keratocytes, ותאי האנדותל ורכיבים acellular כגון קולגן ו גליקוזנוגליקנים2. האזור מנוקז על ידי דמעות כי גם לספק את רוב החומרים המזינים. המיקום האנטומי של מערכת ההפעלה מאלץ אותו להיות במגע ישיר עם הסביבה החיצונית, לעתים קרובות חושף אותו לרכיבים קשים שונים כגון אור בוהק, חיידקים, חלקיקי אבק וכימיקלים. גורם זה מקדם את מערכת ההפעלה לפציעות פיזיות והופך אותו לנוטה למחלות שונות.
מתח חמצוני נגרמת בשל הdisequilibrium בין הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואת נוגדי חמצון מנגנוני ההגנה האנדודוגני3. ROS מסווגים מולקולות תגובתי ורדיקלים חופשיים, שניהם נגזרים מחמצן מולקולרי (O2) באמצעות זרחון חמצוני מיטוכונדרילציה4. הקבוצה הקודמת מורכבת ממינים לא רדיקלים כגון מי חמצן (H2o2), סינגתן חמצן (1o2) והשני כולל מינים כגון סופראוקסיד אניונים (O2–), ו רדיקלים הידרוקסיל (•או), בין היתר. מולקולות אלה הן על ידי-מוצרים של תהליכים סלולריים נורמליים התפקידים שלהם היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיות חשוב כגון התמרה אותות, ביטוי גנים, והגנה מארחים5. ייצור משופר של ROS ידוע להיווצר בתגובה לגורמים כגון הפלישה הפתוגן, xenobiotics, וחשיפה אולטרה סגול (UV) קרינה4. זה ייצור יתר של ROS תוצאות לחץ חמצוני שמוביל לנזק של מולקולות כגון חומצות גרעין, חלבונים, ושומנים6.
אור השמש הטבעי, המקור השולט ביותר של קרינת UV, מורכב UV-A (400 – 320 nm), UV-B (320 – 290 nm), ו-UV-C (290 – 200 ננומטר)7. דווח על קורלציה הפיכה בין אורך הגל לבין האנרגיות הספקטרליות. למרות קרינה UV-C טבעי נספג על ידי האטמוספירה, מקורות מלאכותיים כגון מנורות כספית ומכשירי ריתוך פולטים, ולכן, מהווים סיכון מקצועי. תסמינים של חשיפה לעיניים כוללים פוטוקרטיטיס ו פוטוקראטודלקת הלחמית8. הפקה של ROS הוא אחד המנגנונים העיקריים של גרימת נזק לתאי UV המושרה9. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את הזיהוי של ROS באמצעות 2 ‘, 7 ‘-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFDA) הצביעת שיטה העכבר הראשי משטח עינית העין/תאי גזע חשופים UV-C. הזריחה הירוקה נתפסה. בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט תאים היו מוכתם נגד שני צבעים, Hoechst 33342 ו אדום propidium יודיד, כדי להכתים את התאים חי ומת, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
The DCFDA הצביעת השיטה המתוארת כאן מאפשר ויזואליזציה של ROS בתוך העכבר הראשי העינית לחיות תאים מטופלים עם קרינת UV-C. היתרון של שיטה זו מכתים הוא גם מאפשר לחוקרים ללמוד את ההשפעות המיידיות של UV-C (3 שעות לאחר חשיפה UVC) על התאים החיים ואת הספירה הסימולטני שלהם עבור אחוז של ROS חיובי, כמו גם, תאים מתים. ית…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בתמיכה ממרכז המחקר יאנפויה, יאנפוייה (באוניברסיטה) עבור מתקני התשתית הקונסטרוקטיבית.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
