Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)
Summary
Ce protocole démontre la détection simultanée d’espèces réactives d’oxygène (ROS), de cellules vivantes et de cellules mortes dans les cultures primaires vivantes à partir de cellules de surface oculaires de souris. 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, et Hoechst coloration sont utilisés pour évaluer le ROS, les cellules mortes, et les cellules vivantes, respectivement, suivie par l’imagerie et l’analyse.
Abstract
La surface oculaire est soumise à l’usure régulière due à divers facteurs environnementaux. L’exposition aux rayons UV-C constitue un danger pour la santé au travail. Ici, nous démontrons l’exposition des cellules souches primaires de la surface oculaire de la souris au rayonnement UV-C. La formation d’espèces réactives d’oxygène (ROS) est la lecture de l’étendue du stress/dommages oxydatifs. Dans un contexte in vitro expérimental, il est également essentiel d’évaluer le pourcentage de cellules mortes générées par le stress oxydatif. Dans cet article, nous démontrerons la coloration de 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) des cellules souches oculaires primaires exposées à la souris et leur quantification basée sur les images fluorescentes de la coloration DCFDA. La coloration DCFDA correspond directement à la génération ROS. Nous démontrons également la quantification des cellules mortes et vivantes en taclant simultanément avec l’iodure de propidium (PI) et Hoechst 3332 respectivement et le pourcentage de cellules positives de DCFDA (ROS positif) et de PI.
Introduction
La surface oculaire (OS) est une unité fonctionnelle principalement composée de la couche externe et épithélia glandulaire de la cornée, glande lachrymal, glande mécidome, conjonctive, partie des marges du couvercle des yeux et innervations qui transduisent les signaux1. La couche cornéenne transparente en forme de dôme concentre la lumière sur la rétine. Ce tissu avascular est composé de composants cellulaires tels que les cellules épithéliales, les kératocytes, et les cellules endothéliales et les composants acellulaires tels que le collagène et les glycosaminoglycanes2. La région est drainée par des larmes qui fournissent également la plupart des nutriments. La position anatomique du système d’exploitation l’oblige à être en contact direct avec l’environnement extérieur, l’exposant souvent à divers composants durs tels que la lumière vive, les microbes, les particules de poussière et les produits chimiques. Ce facteur prédispose le système d’exploitation aux blessures physiques et le rend sujet à diverses maladies.
Le stress oxydatif est causé par le déséquilibre entre la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et les mécanismes de défense antioxydants endogènes3. Les ROS sont classés en molécules réactives et radicaux libres, qui sont tous deux dérivés de l’oxygène moléculaire (O2) par la phosphorylation oxydative mitochondriale4. Le premier groupe est composé d’espèces non radicales telles que le peroxyde d’hydrogène (H2O2), l’oxygène singlet (1O2) et le second comprend des espèces telles que les anions de superoxyde (O2–), et les radicaux hydroxyles(OH),entre autres. Ces molécules sont des sous-produits des processus cellulaires normaux et leurs rôles ont été impliqués dans des fonctions physiologiques importantes telles que la transduction du signal, l’expression des gènes et la défense de l’hôte5. Une production améliorée de ROS est connue pour être générée en réponse à des facteurs tels que l’invasion d’agents pathogènes, les xénobiotiques et l’exposition au rayonnement ultra-violet (UV)4. Cette surproduction de ROS entraîne un stress oxydatif qui entraîne des dommages à des molécules telles que les acides nucléiques, les protéines et les lipides6.
La lumière naturelle du soleil, la source la plus prédominante de rayonnement UV, est composée d’UV-A (400 à 320 nm), d’UV-B (320 à 290 nm) et d’UV-C (290 à 200 nm)7. Une corrélation inverse entre la longueur d’onde et les énergies spectrales a été rapportée. Bien que les rayonnements UV-C naturels soient absorbés par l’atmosphère, les sources artificielles telles que les lampes au mercure et les instruments de soudage émettent et constituent donc un danger professionnel. Les symptômes de l’exposition aux yeux comprennent la photokératite et la photokeratoconjonctivite8. La production de ROS est l’un des principaux mécanismes d’infliger des dommages cellulaires induits par les UV9. Dans la présente étude, nous démontrons la détection de ROS à l’aide de la méthode de coloration 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) dans les cellules de surface oculaires primaires de souris/cellules souches exposées aux UV-C. La fluorescence verte a été capturée à l’aide d’une microscopie fluorescente. Les cellules ont été contre-tachées avec deux colorants, Hoechst 33342 et l’iodure rouge de propidium, pour tacher les cellules vivantes et mortes, respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de coloration DCFDA décrite ici permet la visualisation de ROS dans les cellules vivantes oculaires primaires de souris traitées avec le rayonnement UV-C. Un avantage de cette méthode de coloration est qu’elle permet également aux chercheurs d’étudier les effets immédiats des UV-C (3 heures après l’exposition aux UVC) sur les cellules vivantes et leur énumération simultanée pour le pourcentage de ROS positif, ainsi que, les cellules mortes. En outre, comme la méthode de coloration est utilis?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien du Centre de recherche Yenepoya, Yenepoya (considéré comme l’Université) pour les installations d’infrastructure.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
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