Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16

La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal^1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicaciones asociadas.

CVA16 es un virus no envuelto que tiene una cápside icosahedral ensamblado a partir de pentámeros que contienen 4 proteínas estructurales, a saber, VP1, VP2, VP3 y VP4. Rodear cada eje de cinco veces en el pentamer es una región ‘canyon’ que se muestra como una depresión y se destaca por su papel en la unión de receptores³. En la parte inferior de este cañón se encuentra un bolsillo hidrófobo en la región de VP1 que contiene un ligando graso natural llamado esfingosina (SPH). Se ha sugerido que los receptores celulares, como el ligando de glicoproteína p -1 (PSGL-1) y el receptor carroñero de la clase B miembro 2 (SCARB2), desempeñen un papel en la unión viral desplazando este ligando que resulta en cambios conformacionales en la posterior expulsión del genoma viral en la célula huésped^4,5,6. La identificación de posibles inhibidores que bloquean los sucesivos eventos en el proceso de entrada viral podría proporcionar posibles estrategias terapéuticas contra la infección por CVA16.

Los pasos en el ciclo de vida del virus se pueden diseccionar a través de enfoques experimentales como objetivos para ayudar a identificar agentes antivirales específicos del modo. Un análisis de tiempo de adición de fármacos examina el efecto del tratamiento farmacológico en diferentes momentos durante la infección viral, incluyendo la preentrada (agregada antes de la infección por el virus), la entrada (agregada simultánea a la infección por el virus) y la infección por virus)⁷. El impacto se puede evaluar utilizando un ensayo de placa estándar cuantificando el número de placas virales formadas en cada una de las condiciones del tratamiento. El ensayo de unión viral basado en citometría de flujo determina si el medicamento evita la unión viral a las células huésped. Esto se logra cambiando la temperatura de 37 oC, a la que se producen la mayoría de las infecciones por virus humanos, a 4 oC, donde los viriones son capaces de unirse a la superficie de la célula huésped pero no pueden entrar en las células⁷. Las partículas del virus unido a la membrana celular se cuantifican a través de la inmunomancha contra los antígenos virales y se evalúan mediante citometría de flujo. El ensayo de inactivación viral, por otro lado, ayuda a evaluar posibles interacciones físicas del fármaco con partículas de virus libres, ya sea protegiendo o neutralizando los viriones, o causando agregaciones o cambios de conformación que los hacen inactivos para interacciones posteriores con la superficie de la célula huésped durante la infección^8,9. En este experimento, el inóculo viral se permite incubar primero con el fármaco antes de ser diluido para valorar la droga antes de infectar a la monocapa de la célula huésped y realizar un ensayo de placa estándar⁸. Por último, el acoplamiento molecular es una poderosa herramienta para predecir posibles sitios de interacción farmacológica en la superficie del virión, incluidas las glicoproteínas virales de los virus envueltos y las proteínas cápside virales de virus no envueltos, mediante el uso de virus computacionales Algoritmos. Esto ayuda a identificar mecanísticamente los objetivos del modo de acción de la droga y proporcionar información útil que puede ser validada aún más por ensayos posteriores.

Recientemente empleamos los métodos descritos anteriormente para identificar compuestos antivirales que bloquearon eficientemente la infección por el CVA16⁹no envuelto. En este documento, se describen y discuten los protocolos detallados que se utilizaron.