Использование вирусных входных анализов и молекулярного стыковочного анализа для выявления противовирусных кандидатов против Коксакивируса A16
Summary
Цель протокола состоит в том, чтобы проиллюстрировать различные анализы, связанные с вирусной записи, которые могут быть использованы для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа.
Abstract
Противовирусные анализы, которые механически изучить вирусный вход уместно различить, на каком этапе оцененные агенты являются наиболее эффективными, и позволяют для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа. Здесь мы представляем экспериментальные подходы к идентификации малых молекул, способных блокировать инфекцию неконвертированным коксакивирусом A16 (CVA16) путем ориентации на частицы вируса или конкретные шаги в начале вирусного вступления. Анализы включают в себя время-оф-наркотик-дополнение анализа, поток цитометрии на основе вирусной связывания анализа, и вирусной инактивации анализа. Мы также представляем протокол молекулярного стыковки с использованием белков капсидов вируса для прогнозирования потенциальных остатков, на которые нацелены противовирусные соединения. Эти анализы должны помочь в выявлении кандидата противовирусных агентов, которые действуют на вирусный вход. Будущие направления могут исследовать эти возможные ингибиторы для дальнейшего развития лекарственных средств.
Introduction
Заболевания рук, ног и рта (HFMD) – это заболевание, чаще всего вызываемые коксакивирусом A16 (CVA16) и энтеровирусом 71 (EV71) у детей младшего возраста. В последнее время в Азиатско-Тихоокеанском регионе наблюдается значительный подъем в CVA16-индуцированной HFMD. Хотя симптомы могут быть мягкими, тяжелые осложнения могут возникнуть, которые влияют на мозг и сердце, с потенциальной летальностью1,2. В настоящее время для CVA16 не существует лицензированных противовирусных препаратов или прививок, и поэтому существует настоятельная необходимость в разработке противовирусных стратегий по пресечению будущих вспышек и связанных с ними осложнений.
CVA16 является неконвертированный вирус, который имеет icosahedral capsid собраны из pentamers, что каждый содержит 4 структурных белков, а именно VP1, VP2, VP3, и VP4. Окружающая каждая пятикратная ось в пентамаке является “каньон” области, которая показывает, как депрессия и известен своей ролью в рецепторе связывания3. На дне этого каньона находится гидрофобный карман в регионе VP1, который содержит натуральный жирный лиганд под названием сфингозин (SPH). Сотовые рецепторы, такие как человеческий P selectin гликопротеин лиганд 1 (PSGL-1) и мусорщик рецепторов класса B 2 (SCARB2), было предложено играть роль в вирусной связывания, вытесняя этот лиганд, который приводит к конформационным изменениям капсида и последующее выброса вирусного генома в клетку-хозяина4,5,6. Выявление возможных ингибиторов, которые блокируют последовательные события в процессе вирусного вступления может обеспечить потенциальные терапевтические стратегии против CVA16 инфекции.
Шаги в жизненном цикле вируса могут быть вскрыты с помощью экспериментальных подходов в качестве мишеней, чтобы помочь определить режим конкретных противовирусных агентов. Анализ времени добавления препарата исследует эффект лечения препарата в разное время во время вирусной инфекции, включая предварительное вступление (добавлено до вирусной инфекции), вступление (добавлено одновременно с вирусной инфекцией) и после вступления (добавлено после вирусной инфекции)7. Воздействие может быть оценено с помощью стандартного налета анализ путем количественной оценки количества вирусных бляшек, образуются в каждом из условий лечения. Поток цитометрии основе вирусной связывания асссе определяет, если препарат предотвращает вирусное вложение в клетки-хозяина. Это достигается путем изменения температуры с 37 градусов по Цельсию, при котором происходит большинство вирусных инфекций человека, до 4 градусов по Цельсию, где вирионы могут связываться с поверхностью клетки-хозяина, но не могут войти в клетки7. Частицы вируса, связанные с клеточной мембраной, затем количественно определяются с помощью иммуностоинга против вирусных антигенов и оцениваются цитометрией потока. Вирусная инактивация анализ, с другой стороны, помогает оценить потенциальные физические взаимодействия препарата со свободными частицами вируса, либо экранирование или нейтрализации virions, или вызывая агрегации или конформационные изменения, которые делают их неактивными для последующие взаимодействия с поверхностью клетки-хозяина во время инфекции8,9. В этом эксперименте, вирусный инокулум разрешается сначала инкубировать с препаратом, прежде чем разбавленной титрировать препарат до заражения монослойной клетки хозяина и выполнения стандартного зубного налета асссее8. Наконец, молекулярная стыковка является мощным инструментом для прогнозирования потенциальных мест взаимодействия наркотиков на поверхности вириона, включая вирусные гликопротеины от окутанных вирусов и вирусные капсидные белки от неконвертированных вирусов, с помощью вычислительных Алгоритмы. Это помогает механически определить цели способа действия препарата и предоставить полезную информацию, которая может быть дополнительно проверена вниз по течению анализов.
Недавно мы использовали описанные выше методы для выявления противовирусных соединений,которые эффективно блокировали инфекцию неохваченным CVA16 9. В этом вопросе описаны и обсуждены подробные протоколы, которые были использованы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом докладе мы описали протоколы, которые полезны для идентификации противовирусных кандидатов, нацеленных на вирусную запись, в частности против неконвертированных CVA16. Анализы разработаны таким образом, чтобы вскрыть ранние события во время вирусной записи, что полезно для уточн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны доктору Джошуа Бекхэму (Joshua Beckham) из Техасского университета в Остине за техническую поддержку с помощью молекулярной стыковки. Это исследование было частично поддержано за счет финансирования со стороны Министерства науки и техники Тайваня (MOST107-2320-B-037-002 до C.-J.L. и L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 и MOST107-2320-B-038-034-MY3 в Л.-Т.Л.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
