Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

A doença da mão, do pé, e da boca (hfmd) é uma doença causada o mais geralmente pelo coxsackievirus A16 (CVA16) e pelo enterovírus 71 (EV71) em crianças novas. Recentemente, em toda a região da Ásia-Pacífico, houve um aumento significativo na HFMD induzida por CVA16. Embora os sintomas possam ser leves, podem ocorrer complicações graves que afetam o cérebro e o coração, com potencial fatalidade^1,2. Atualmente, não há terapias antivirais licenciadas ou vacinações disponíveis para CVA16, e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias antivirais para conter surtos futuros e as complicações associadas.

CVA16 é um vírus não-envelopado que tenha um capsídeo icosahedral montado dos pentâmeros que cada um contem 4 proteínas estruturais a saber VP1, VP2, VP3, e VP4. Circundando cada eixo cinco vezes no pentâmero é uma região ‘ Canyon ‘ que mostra como uma depressão e é notável por seu papel na ligação do receptor³. Na parte inferior deste Canyon encontra-se um bolso hidrofóbico na região VP1 que contém um ligante gordo natural chamado esfingosina (SPH). Receptores celulares, como a glicoproteína de P selectina humana ligante 1 (PSGL-1) e o membro da classe B do receptor de scavenger 2 (SCARB2), têm sido sugeridos para desempenhar um papel na ligação viral, deslocando este ligante que resulta em alterações conformacionais para o capsídeo e o subsequente ejeção do genoma viral na célula hospedeira^4,5,6. A identificação de possíveis inibidores que bloqueiam os eventos sucessivos no processo de entrada viral pode fornecer estratégias terapêuticas potenciais contra a infecção por CVA16.

As etapas do ciclo de vida do vírus podem ser dissecadas por meio de abordagens experimentais como alvos para ajudar a identificar agentes antivirais específicos do modo. Uma análise da tempo–droga-adição examina o efeito do tratamento da droga em épocas diferentes durante a infecção viral, incluindo o pre-entry (adicionado antes da infecção do vírus), entrada (adicionado simultâneo à infecção do vírus), e borne-entrada (adicionado depois do Infeção pelo vírus)⁷. O impacto pode ser avaliado usando um ensaio de placa padrão, quantitando o número de chapas virais formadas em cada uma das condições de tratamento. O ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo determina se a droga impede o apego viral às células hospedeiras. Isto é conseguido deslocando a temperatura de 37 ° c, em que a maioria de infecções humanas do vírus ocorre, a 4 ° c, onde os virions podem se ligar à superfície da pilha do anfitrião mas são incapazes de incorporar as pilhas⁷. As partículas de vírus ligadas à membrana celular são então quantificadas por imunocoloração contra antígenos virais e avaliadas por citometria de fluxo. O ensaio de inativação viral, por outro lado, ajuda a avaliar potenciais interações físicas da droga com partículas de vírus livres, protegendo ou neutralizando os virions, ou causando agregações ou alterações conformacionais que os tornam inativos para interações subsequentes com a superfície celular do hospedeiro durante a infecção^8,9. Neste experimento, o inuso viral é permitido incubar primeiro com a droga antes de ser diluído para titular para fora a droga antes de infectar a monocamada da pilha de anfitrião e de executar um ensaio padrão da chapa⁸. Finalmente, o encaixe molecular é uma ferramenta poderosa para prever locais potenciais da interação da droga na superfície do virion, incluindo as glicoproteínas virais dos vírus Envelopado e das proteínas virais do capsídeo dos vírus não-envelopado, usando o computacional Algoritmos. Isso ajuda a identificar os alvos mecanisticamente do modo de ação da droga e fornecer informações úteis que podem ser mais validadas por ensaios a jusante.

Recentemente, empregou-se os métodos descritos acima para identificar compostos antivirais que bloquearam eficientemente a infecção pelos não-envoltos CVA16⁹. Nisto, os protocolos detalhados que foram usados são descritos e discutidos.