שימוש בעלי כניסה ויראלי וניתוח עגינה מולקולרית לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים A16
Summary
מטרת הפרוטוקול היא להמחיש את הנושא השונה המתייחס לערך ויראלי שניתן להשתמש בו כדי לזהות מעכבי כניסה ויראלית של מועמד.
Abstract
אנטי וירוס מספר כי המכונה לבחון כניסה ויראלית הם רלוונטיים להבחין באיזה שלב הסוכנים העריכו הם יעילים ביותר, ולאפשר זיהוי של מועמד ויראלי כניסה מעכבי. כאן, אנו מציגים את הגישות הנסיוניות לזיהוי מולקולות קטנות המסוגל לחסום את הזיהום על ידי וירוס שאינו עטוף A16 (CVA16) דרך המיקוד חלקיקי וירוס או צעדים ספציפיים בכניסה ויראלי מוקדם. Assays כולל ניתוח זמן של תרופות בתוספת התרופה, שיטת הכריכה המבוססת על הזרמת cy, ושיטת הפעלה ויראלית. אנו גם להציג פרוטוקול עגינה מולקולרית ניצול וירוס מקפיסיד חלבונים כדי לנבא שאריות פוטנציאליים ממוקדות על ידי תרכובות אנטי ויראליות. מספר זה אמור לסייע בזיהוי של סוכני אנטי וירוס מועמדים הפועלים על כניסה ויראלית. כיוונים עתידיים יכולים לחקור את המעכבי האפשריות לפיתוח סמים נוסף.
Introduction
יד, כף הרגל, ומחלת הפה (hfmd) היא מחלה הנגרמת בדרך כלל על ידי הנגיף A16 (CVA16) ו מעיים 71 (EV71) אצל ילדים צעירים. לאחרונה מעבר לאזור אסיה-פסיפיק, הייתה הפיכה משמעותית של HFMD המושרה ב-CVA16. בעוד הסימפטומים יכולים להיות מתון, סיבוכים חמורים יכולים להתרחש המשפיעים על המוח והלב, עם הרוגים פוטנציאליים1,2. כיום, אין טיפולים אנטי ויראליים מורשה או חיסונים זמינים עבור CVA16, ולכן יש צורך דחוף לפתח אסטרטגיות אנטי ויראליות כדי לרסן התפרצויות עתידיות ואת הסיבוכים הקשורים.
CVA16 הוא וירוס שאינו עטוף אשר מורכב capsaמישור המורכב מפנטאמרס כי כל אחד מכיל 4 חלבונים מבניים כלומר VP1, VP2, VP3, ו VP4. המקיף כל ציר חמש מתקפל בפנטעאמר הוא אזור ‘ קניון ‘ המראה כדיכאון והוא מציין את תפקידה בכריכת הקולטן3. בחלק התחתון של הקניון הזה נמצא כיס הידרופובי באזור VP1 המכיל ליגוגיה שומני טבעי, ספיגוסינוס (SPH). קולטנים סלולריים, כגון האדם P בסלטין גליקופרוטאין ליגנד 1 (psgl-1) ו מחלקת הקולטן הנבלות חבר B 2 (SCARB2), הוצעו לשחק תפקיד בכריכה ויראלית על ידי העברת ליגאס זה והתוצאות שינויים בקונפורמה לקפיסידה וה הוצאה בעקבות הגנום הנגיפי לתוך התא המארח4,5,6. זיהוי מעכבי אפשריים החוסמים את האירועים הרצופים בתהליך הכניסה הנגיפי יכול לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות נגד זיהום CVA16.
ניתן לגזור את השלבים במחזור החיים של הווירוס באמצעות גישות נסיוניות כמטרות כדי לסייע בזיהוי סוכני אנטי-וירוס ספציפיים למצב. ניתוח של זמן של סמים בנוסף בוחן את האפקט של טיפול בסמים בתקופות שונות במהלך הזיהום הנגיפי, כולל טרום כניסה (הוסיף לפני זיהום וירוס), כניסה (הוסיף במקביל לזיהום וירוס), ולאחר הזנה (נוסף בעקבות זיהום וירוס)7. ההשפעה יכולה להיות מוערך באמצעות בדיקת רובד סטנדרטי על ידי כימות הפלאק ויראלי שנוצרו בכל תנאי הטיפול. הזרימה של שיטת הכריכה הנגיפית המבוססת על cy, קובעת אם הסם מונע החזקה ויראלית לתאים מארחים. זה מושגת על ידי העברת הטמפרטורה מ 37 ° c, שבו רוב של זיהומים הנגיף האנושי להתרחש, עד 4 ° c, שם הריטונים מסוגלים לאגד את משטח התא מארח אך אינם יכולים להיכנס לתאים7. התא חלקיקי קרום וירוס מאוגד הם לאחר מכן כימות באמצעות מכתים חיסוני נגד אנטיגנים ויראלי המוערך על ידי cy, לנסות הזרימה. הבדיקה הנגיפית של ההפעלה מצד שני מסייעת להעריך את האינטראקציות הפיזיות הפוטנציאליות של התרופה עם חלקיקי וירוס בחינם, להגן או לנטרל את הריטונים, או לגרום לצבירות או ליצירת שינויים שיגרמו להם להפוך לבלתי פעילים עבור אינטראקציות עוקבות עם משטח התא של המחשב המארח במהלך ההדבקה8,9. בניסוי זה, מותר הנגיף הנגיפי הראשון לדגירה עם התרופה לפני היותו מדולל כדי נכייל את התרופה לפני הדבקה של התא המארח מונרוייר וביצוע שיטת הפלאק סטנדרטי8. לבסוף, עגינה מולקולרית הוא כלי רב עוצמה כדי לנבא את האתרים הפוטנציאליים אינטראקציה הסמים על פני השטח והריאון, כולל גליקורופנים נגיפי מפני וירוסים עטופים והחלבונים capsid ויראלי מווירוסים שאינם עטופים, באמצעות חישובים אלגוריתמים. זה עוזר לספק מטרות באופן מדויק של מצב התרופה של הפעולה ומספקים מידע שימושי שיכול להיות מאומת נוסף על ידי במורד הזרם.
לאחרונה העסקנו את השיטות המתוארות לעיל כדי לזהות תרכובות אנטי ויראליות שחסמו ביעילות את הזיהום על ידי CVA169שאינם עטופים. להלן, הפרוטוקולים המפורטים ששימשו לשימוש מתוארים ודנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדוח זה, תיארנו את הפרוטוקולים השימושיים לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים המכוונות לכניסה ויראלית, במיוחד נגד הCVA16 הבלתי-עטופים. האסמאומר מתוכננים בדרכים לנתח את האירועים המוקדמים במהלך הזנה ויראלית, המועילה להבהיר את המנגנון (של) הפעולה והיעד הפוטנציאלי של הפעילות האנטי-נגיפית של סוכני הני?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה ד ר יהושע בקהאם באוניברסיטת טקסס באוסטין לתמיכה טכנית עם עגינה מולקולרית. מחקר זה היה נתמך באופן חלקי על ידי מימון משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (MOST107-2320-B-037-002 ל-C.-J.L. ו-L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 ו MOST107-2320-B-038-034-MY3 ל L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
