Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16

Hand-, voet-en mond ziekte (HFMD) is een ziekte die meestal wordt veroorzaakt door Coxsackievirus A16 (CVA16) en enterovirus 71 (EV71) bij jonge kinderen. Onlangs in de regio Azië-Pacific, is er een belangrijke uptick in CVA16-geïnduceerde HFMD. Terwijl de symptomen kunnen mild zijn, ernstige complicaties kunnen optreden die invloed hebben op de hersenen en het hart, met potentiële fataliteit^1,2. Op dit moment zijn er geen gelicentieerde antivirale therapieën of vaccinaties beschikbaar voor CVA16, en daarom is er een dringende behoefte om antivirale strategieën te ontwikkelen om toekomstige uitbraken en de bijbehorende complicaties te beteugelen.

CVA16 is een niet-omhuld virus dat een icosahedrale capside heeft samengesteld van pentamers die elk 4 structurele eiwitten bevatten, namelijk VP1, VP2, VP3 en VP4. Het omcirkelen van elke vijf-voudige as in de pentamer is een ‘ kloof ‘ regio die toont als een depressie en staat bekend om zijn rol in receptor binding³. Aan de onderkant van deze kloof ligt een hydrofoob zak in de VP1 regio die een natuurlijke vette ligand met de naam sfingosine (SPH) bevat. Cellulaire receptoren, zoals Human P selectin glycoproteïne ligand 1 (PSGL-1) en Scavenger receptor klasse B lid 2 (SCARB2), zijn gesuggereerd om een rol te spelen in virale binding door het verplaatsen van deze ligand die resulteert in conformationele veranderingen aan de capside en de daaropvolgende uitwerpen van virale genoom in de ontvangende cel^4,5,6. Identificeren van mogelijke remmers die de opeenvolgende gebeurtenissen in de virale entry proces blokkeren zou kunnen bieden potentiële therapeutische strategieën tegen CVA16 infectie.

De stappen in de levenscyclus van het virus kunnen worden ontleed door middel van experimentele benaderingen als doelen om te helpen identificeren van de modus-specifieke antivirale middelen. Een analyse van de tijd van de drug-aanvulling onderzoekt het effect van de drug behandeling op verschillende tijdstippen tijdens de virale infectie, met inbegrip van pre-entry (toegevoegd voorafgaand aan de virus infectie), binnenkomst (toegevoegd gelijktijdig aan de virus infectie), en post-entry (toegevoegd na de virus infectie)⁷. De impact kan worden beoordeeld aan de hand van een standaard plaque test door het aantal virale plaques dat in elk van de behandelings condities wordt gevormd te kwantificen. De flow cytometrie gebaseerde virale bindings test bepaalt of het medicijn virale gehechtheid aan cellen voorkomt. Dit wordt bereikt door de temperatuur te verschuiven van 37 °C, waarbij de meerderheid van de menselijke virus infecties optreedt, tot 4 °C, waar de virionen kunnen binden aan het hostceloppervlak, maar niet in staat zijn om de cellen⁷in te voeren. De celmembraan-gebonden virusdeeltjes worden vervolgens gekwantificeerd door middel van immunokleuring tegen virale antigenen en beoordeeld door flow cytometrie. De virale inactivatie test aan de andere kant helpt bij het beoordelen van mogelijke fysieke interacties van het medicijn met vrije virusdeeltjes, het afschermen of neutraliseren van de virionen, of het veroorzaken van aggregaties of conformationele veranderingen die hen inactief maken voor daaropvolgende interacties met het oppervlak van de host-cel tijdens de infectie^8,9. In dit experiment mag het virale entmateriaal eerst met het medicijn worden geïnpost voordat het wordt verdund om het geneesmiddel te titreren voorafgaand aan het infecteren van de monolaag van de host-cel en het uitvoeren van een standaard plaque assay⁸. Tot slot is moleculair docking een krachtig hulpmiddel om mogelijke geneesmiddelinteractie sites op het virion-oppervlak te voorspellen, waaronder de virale glycoproteïnen van omhulde virussen en de virale capside-eiwitten van niet-omhulde virussen, door gebruik te maken van computationele Algoritmen. Dit helpt bij het mechanistisch lokaliseren van de doelstellingen van de werkingsmodus van de drug en bieden nuttige informatie die verder kan worden gevalideerd door downstream assays.

We hebben onlangs de hierboven beschreven methoden gebruikt om antivirale verbindingen te identificeren die een efficiënte geblokkeerde infectie door de niet-omhulde CVA16⁹. Hierin worden de gebruikte gedetailleerde protocollen beschreven en besproken.