利用病毒进入检测和分子对接分析鉴定抗病毒候选药物,对抗Coxsackie病毒A16
Summary
该协议的目的是说明与病毒进入相关的不同检测,可用于识别候选病毒进入抑制剂。
Abstract
抗病毒测定,机械检查病毒进入是相关的,以辨别哪个步骤评估的剂是最有效的,并允许识别候选病毒进入抑制剂。在这里,我们介绍通过靶向病毒颗粒或早期病毒进入中的具体步骤来识别能够阻止非包络的coxsackie病毒A16(CVA16)感染的小分子的实验方法。分析包括药物添加时间分析、基于流细胞学的病毒结合测定和病毒失活测定。我们还提出了一种分子对接协议,利用病毒帽蛋白来预测抗病毒化合物靶向的潜在残留物。这些检测应有助于识别对病毒进入作用的候选抗病毒药物。未来的方向可以探索这些可能的抑制剂,以进一步的药物开发。
Introduction
手足口病 (HFMD) 是一种最常见的疾病,由病毒病毒 A16 (CVA16) 和肠道病毒 71 (EV71) 在幼儿中引起。最近,在整个亚太地区,CVA16引起的手足口病显著上升。虽然症状可能是轻微的,严重的并发症可能发生,影响大脑和心脏,与潜在的死亡1,2。目前,CVA16没有获得许可的抗病毒疗法或疫苗接种,因此迫切需要制定抗病毒战略,以遏制未来的疫情和相关并发症。
CVA16 是一种非包络病毒,其病毒由五角星组装而成,每个病毒都含有 4 种结构蛋白,即 VP1、VP2、VP3 和 VP4。五角星中每个五折轴的包围是一个”Canyon”区域,它表现出抑郁症,并以其在受体结合3中的作用而闻名。在这个峡谷的底部是一个疏水口袋在VP1区域,其中包含一个天然脂肪配体名为狮身人面像(SPH)。细胞受体,如人P选择糖蛋白配体1(PSGL-1)和清除受体B类成员2(SCARB2),已被建议在病毒结合中发挥作用,取代这种配体,导致与帽状的变化随后将病毒基因组喷射到宿主细胞4,5,6。识别阻止病毒进入过程中连续事件的可能抑制剂可以提供针对CVA16感染的潜在治疗策略。
病毒生命周期中的步骤可以通过实验方法作为帮助识别特定模式的抗病毒药物的目标进行剖析。药物添加时间分析检查病毒感染期间不同时间的药物治疗效果,包括进入前(在病毒感染之前添加)、进入(与病毒感染并发添加)和进入后(在病毒感染)7.可以通过定量在每个治疗条件下形成的病毒斑块数量,使用标准斑块测定来评估其影响。基于流细胞学的病毒结合测定确定药物是否阻止病毒附着细胞的附着。这是通过将温度从37°C(大多数人类病毒感染发生的地方)转移到4°C来实现的,其中病毒能够结合到宿主细胞表面,但不能进入细胞7。然后,通过免疫染色对病毒抗原进行定量,并通过流动细胞学进行评估,从而对细胞膜结合的病毒颗粒进行量化。另一方面,病毒失活检测有助于评估药物与游离病毒颗粒的潜在物理相互作用,屏蔽或中和病毒,或导致聚集或构象变化,使它们失去活性在感染8,9期间与宿主细胞表面的后续相互作用。在这个实验中,病毒接种允许先用药物孵育,然后再被稀释,在感染宿主细胞单层并进行标准斑块测定之前,将药物分三子。最后,分子对接是一个强大的工具,用于预测病毒表面潜在的药物相互作用位点,包括来自包络病毒的病毒糖蛋白和非包络病毒的病毒帽蛋白,通过使用计算算法。这有助于机械地确定药物作用模式的目标,并提供有用的信息,可以通过下游检测进一步验证。
我们最近使用上述方法识别抗病毒化合物,有效阻止非包络的CVA169感染。本文将介绍并讨论所使用的详细协议。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本报告中,我们描述了有助于识别针对病毒进入的抗病毒候选项,特别是针对非包络的CVA16的抗病毒候选方案。检测方法旨在剖析病毒进入过程中的早期事件,有助于阐明检测剂抗病毒活性的作用机制和潜在靶点。”药物添加时间测定”允许广泛确定测试化合物的潜在目标,例如未感染的宿主细胞(预处理分析)、病毒颗粒或其与宿主细胞表面的相互作用(共增分析)),或病毒复制阶段(感染后分析)中受病毒感…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢德克萨斯大学奥斯汀分校的约书亚·贝克汉姆博士为分子对接提供技术支持。这项研究部分得到台湾科技部(MOST107-2320-B-037-002至C.-J.L.和L.T.L.)的资助;MOST106-2320-B-038-021 和 MOST107-2320-B-038-034-MY3 到 L.T.L.)。
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
