Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias
Summary
Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.
Abstract
Las investigaciones de factores que influyen en la división celular y la forma celular en las bacterias se realizan comúnmente junto con la microscopía de fluorescencia de alta resolución, ya que las observaciones realizadas a nivel de población pueden no reflejar realmente lo que ocurre a un nivel de célula única. La microscopía timelapse de células vivas permite a los investigadores monitorear los cambios en la división celular o la morfología celular que proporcionan información valiosa sobre la localización subcelular de proteínas y el momento de la expresión génica, como sucede, para ayudar potencialmente a responder preguntas biológicas importantes. Aquí, describimos nuestro protocolo para monitorear los cambios fenotípicos en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus usando un microscopio de desconvolución de alta resolución. El objetivo de este informe es proporcionar un protocolo simple y claro que pueda ser adoptado por otros investigadores interesados en llevar a cabo experimentos de microscopía de fluorescencia para estudiar diferentes procesos biológicos en bacterias y otros organismos.
Introduction
El campo de la biología celular bacteriana se ha visto significativamente mejorado por los recientes avances en las técnicas de microscopía1,2. Entre otros instrumentos, los microscopios que son capaces de realizar experimentos de microscopía de fluorescencia timelapse siguen siendo una herramienta valiosa. Los investigadores pueden monitorear varios eventos fisiológicos en tiempo real utilizando proteínas fluorescentes tales como, fusión de reporteros transcripcionales y traslacionales basados en proteínas fluorescentes verdes (GFP), fluorescentes D-aminoácidos (FDAA)3,o usar otras manchas para etiquetar la pared celular, la membrana y el ADN. Por lo tanto, no es de extrañar que la microscopía de fluorescencia siga siendo popular entre los biólogos de células microbianas. Además de simplemente mostrar los fenotipos finales, proporcionar información sobre cómo surgen los fenotipos observados mediante la microscopía timelapse podría agregar un valor significativo a los hallazgos y potencialmente ofrecer pistas sobre qué procesos celulares están siendo blanco de posibles candidatosa medicamentos 4.
En este artículo se proporcionan los protocolos para realizar imágenes de alta resolución utilizando un microscopio de fluorescencia de campo ancho totalmente motorizado, invertido (véase la Tabla de Materiales). Estos protocolos podrían adaptarse a las necesidades de otros microscopios de fluorescencia que son capaces de realizar microscopía timelapse. Aunque el software discutido aquí corresponde al software específico suministrado por el fabricante como se indica en la Tabla de Materiales,el software comúnmente suministrado por otros fabricantes de microscopios o el ImageJ5de libre disposición, tienen herramientas equivalentes para analizar datos de microscopía. Para condiciones en las que el timelapse no es propicio, se podrían llevar a cabo experimentos de curso de tiempo como se describe en este artículo. Los protocolos descritos aquí proporcionan una guía detallada para estudiar los cambios fenotípicos en dos especies bacterianas diferentes: B. subtilis y S. aureus. Consulte la Tabla 1 para las cepas utilizadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopía ha seguido siendo un pilar en los estudios relacionados con organismos microbianos. Dado su tamaño de célula a escala de micrones, los estudios a nivel de una sola célula se han basado tradicionalmente en la microscopía electrónica (EM). Aunque EM se ha convertido en una técnica bastante poderosa en los últimos años, tiene sus propias limitaciones intrínsecas además del acceso limitado de los usuarios16. Las mejoras en las técnicas de microscopía de fluorescencia y el d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros miembros del laboratorio por sus comentarios sobre este artículo. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de la Universidad del Sur de Florida (PE).
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
