מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים
Summary
מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.
Abstract
חקירות של גורמים המשפיעים על חלוקת תאים וצורת תא בחיידקים מבוצעים בדרך כלל בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה כמו תצפיות שנעשו ברמת האוכלוסייה לא באמת לשקף את מה שמתרחש ברמת תא בודד. המיקרוסקופיה מאפשרת לחוקרים לפקח על השינויים במחלקת התאים או במבנה התא המספקים תובנות יקרות לגבי לוקליזציה תת-תאית של חלבונים ותזמון של ביטוי גנטי, כפי שקורה, כדי לסייע במענה לשאלות ביולוגיות חשובות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לפקח על שינויים פנוטיאריים בתוך מקרתגו subtilis ו סטיילוקוקוס האורלנו באמצעות מיקרוסקופ לפירוק ברזולוציה גבוהה. מטרת דו ח זה היא לספק פרוטוקול פשוט וברור שניתן לאמץ על ידי חוקרים אחרים המעוניינים לבצע ניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית ללמוד תהליכים ביולוגיים שונים בחיידקים, כמו גם אורגניזמים אחרים.
Introduction
התחום של ביולוגיה של התא בקטריאלי הופרה באופן משמעותי על ידי הפיתוחים האחרונים של טכניקות מיקרוסקופ1,2. בין השאר, מיקרוסקופים המסוגלים לבצע ניסויים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית נותרים הם כלי רב ערך. החוקרים יכולים לפקח על אירועים פיזיולוגיים שונים בזמן אמת באמצעות חלבונים פלורסנט כגון, חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מבוסס הכתב fusions העיתונאי, פלורסנט D-אמינו חומצות (FDAA)3, או להשתמש כתמים אחרים עבור תיוג קיר התא, קרום DNA. לכן אין שום הפתעה כי מיקרוסקופ הזריחה נשאר פופולרי בקרב ביולוגים תאים מיקרוביאלית. בנוסף פשוט מציג את הפנוטיפים הסוף, מתן מידע לגבי איך פנוטיפים נצפו להתעורר באמצעות מיקרוסקופ tim, יכול להוסיף ערך משמעותי לממצאים ולהציע רמזים לגבי מה התהליכים הסלולריים מיועדים על ידי מועמדים לסמים פוטנציאליים4.
הפרוטוקולים לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ במלואו, הפוך, הפוכה השדה הרחב (לראות את הטבלה של חומרים) מסופקים במאמר זה. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים כדי להתאים את הצרכים של מיקרוסקופים פלואורסצנטית אחרים אשר מסוגלים לנהל מיקרוסקופ שחלוף. למרות שהתוכנה שנדונה כאן מתאימה לתוכנה הספציפית שסופקה על-ידי היצרן כפי שמצוין בטבלת החומרים, תוכנה המסופקת בדרך כלל על-ידי יצרני מיקרוסקופ אחרים או imagej5הזמינים באופן חופשי, יש כלים שווי-ערך לניתוח נתוני מיקרוסקופ. לתנאים שבהם המשך הזמן אינו תורם, ניתן לערוך ניסויים במהלך הקורס כמתואר במאמר זה. הפרוטוקולים המתוארים כאן מספקים מדריך מפורט כדי ללמוד את השינויים הפנוטיניים בשני זנים חיידקיים שונים: B. subtilis ו -S.. שנינו ראה שולחן 1 עבור זנים המשמשים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המיקרוסקופיה הייתה בעלת התווך במחקרים הנוגעים לאורגניזמים מיקרוביאלית. בהתחשב בגודל התאים שלהם בקנה מידה מיקרון, מחקרים ברמת תא יחיד הסתמאו באופן מסורתי על מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרות EM הפך להיות טכניקה רבת עוצמה בשנים האחרונות, יש לו מגבלות פנימיות משלו בנוסף למשתמש מוגבל גישה<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הערותיהם במאמר זה. עבודה זו ממומנת על ידי מענק סטארט-up מאוניברסיטת דרום פלורידה (PE).
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
