Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien
Summary
Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.
Abstract
Untersuchungen von Faktoren, die die Zellteilung und die Zellform von Bakterien beeinflussen, werden häufig in Verbindung mit einer hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, da Beobachtungen auf Populationsebene möglicherweise nicht wirklich widerspiegeln, was auf einer einzelnen Zellebene geschieht. Die Zeitraffermikroskopie mit Live-Zellen ermöglicht es den Forschern, die Veränderungen in der Zellteilung oder Zellmorphologie zu überwachen, die wertvolle Erkenntnisse über die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen und den Zeitpunkt der Genexpression liefern, um möglicherweise bei der Beantwortung wichtiger biologischer Fragen zu helfen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Überwachung phänotypischer Veränderungen bei Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus mit einem hochauflösenden Dekonvolutionmikroskop. Ziel dieses Berichts ist es, ein einfaches und klares Protokoll zu erstellen, das von anderen Forschern angenommen werden kann, die an der Durchführung von Fluoreszenzmikroskopieexperimenten interessiert sind, um verschiedene biologische Prozesse bei Bakterien und anderen Organismen zu untersuchen.
Introduction
Der Bereich der bakteriellen Zellbiologie wurde durch die jüngsten Fortschritte in den Mikroskopietechniken1,2deutlich verbessert. Unter anderem sind Mikroskope, die in der Lage sind, Zeitrafferfluoreszenzmikroskopieexperimente durchzuführen, ein wertvolles Werkzeug. Die Forscher können verschiedene physiologische Ereignisse in Echtzeit mit fluoreszierenden Proteinen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) basierende Transkriptions- und Translationalreporterfusionen, fluoreszierende D-Aminosäuren (FDAA)3überwachen oder andere Flecken zur Kennzeichnung der Zellwand, Membran und DNA verwenden. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Fluoreszenzmikroskopie bei mikrobiellen Zellbiologen nach wie vor beliebt ist. Neben der einfachen Darstellung der Endphänotypen könnte die Bereitstellung von Informationen darüber, wie die beobachteten Phänotypen mittels Zeitraffermikroskopie entstehen, den Befunden einen signifikanten Mehrwert verleihen und potenziell Hinweise darauf liefern, welche zellulären Prozesse von potenziellen Wirkstoffkandidaten ins Visier genommen werden4.
Die Protokolle zur Durchführung hochauflösender Bildgebung mit einem vollmotorisierten, invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle)finden Sie in diesem Artikel. Diese Protokolle könnten an die Anforderungen anderer Fluoreszenzmikroskope angepasst werden, die in der Lage sind, Zeitraffermikroskopie durchzuführen. Obwohl die hier diskutierte Software der spezifischen vom Hersteller gelieferten Software entspricht, wie in der Tabelle der Materialienangegeben, verfügen Software, die üblicherweise von anderen Mikroskopherstellern geliefert wird, oder das frei verfügbare ImageJ5über gleichwertige Werkzeuge zur Analyse von Mikroskopiedaten. Für Bedingungen, bei denen Zeitraffer nicht förderlich ist, könnten Zeit-Kurs-Experimente durchgeführt werden, wie in diesem Artikel beschrieben. Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen detaillierten Leitfaden zur Untersuchung der phänotypischen Veränderungen bei zwei verschiedenen Bakterienarten: B. subtilis und S. aureus. Siehe Tabelle 1 für verwendete Stämme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Mikroskopie ist nach wie vor eine tragende Säule in Studien über mikrobielle Organismen. Angesichts ihrer Mikron-Zellgröße stützten sich Einzelzell-Level-Studien traditionell auf Elektronenmikroskopie (EM). Obwohl EM in den letzten Jahren zu einer recht leistungsfähigen Technik geworden ist, hat es neben dem eingeschränkten Benutzerzugriff16seine eigenen intrinsischen Einschränkungen. Verbesserungen in fluoreszenzmikroskopischen Techniken und die Entwicklung verschiedener Fluoreszenzso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Labormitgliedern für ihre Kommentare zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde durch ein Start-up-Stipendium der University of South Florida (PE) finanziert.
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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