Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries
Summary
Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l’aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.
Abstract
Les études des facteurs influençant la division cellulaire et la forme cellulaire chez les bactéries sont couramment effectuées en conjonction avec la microscopie à haute résolution de fluorescence, car les observations faites au niveau de la population peuvent ne pas vraiment refléter ce qui se produit à un seul niveau cellulaire. La microscopie en accéléré en cellule vive permet aux chercheurs de surveiller les changements dans la division cellulaire ou la morphologie cellulaire qui fournissent des informations précieuses sur la localisation subcellulaire des protéines et le moment de l’expression des gènes, comme il arrive, pour potentiellement aider à répondre à d’importantes questions biologiques. Ici, nous décrivons notre protocole pour surveiller les changements phénotypiques dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus utilisant un microscope de deconvolution à haute résolution. L’objectif de ce rapport est de fournir un protocole simple et clair qui peut être adopté par d’autres chercheurs intéressés à mener des expériences de microscopie à fluorescence pour étudier différents processus biologiques chez les bactéries ainsi que d’autres organismes.
Introduction
Le domaine de la biologie cellulaire bactérienne a été considérablement amélioré par les progrès récents dans les techniques de microscopie1,2. Entre autres instruments, les microscopes capables de mener des expériences de microscopie à fluorescence en timelapse demeurent un outil précieux. Les chercheurs peuvent surveiller divers événements physiologiques en temps réel à l’aide de protéines fluorescentes telles que les fusions transcriptionnelle et translationnelle de la protéine fluorescente verte (GFP), les acides fluorescents D-amino (FDAA)3, ou utiliser d’autres taches pour étiqueter la paroi cellulaire, la membrane et l’ADN. Il n’est donc pas surprenant que la microscopie par fluorescence demeure populaire chez les biologistes des cellules microbiennes. En plus de simplement montrer les phénotypes finaux, fournir des informations sur la façon dont les phénotypes observés surgissent à l’aide de la microscopie timelapse pourrait ajouter une valeur significative aux résultats et potentiellement offrir des indices quant à ce que les processus cellulaires sont ciblés par les candidats médicaments potentiels4.
Les protocoles d’imagerie à haute résolution à l’aide d’un microscope à fluorescence entièrement motorisé, inversé et à large champ (voir le Tableau des matériaux)sont fournis dans cet article. Ces protocoles pourraient être adaptés aux besoins d’autres microscopes à fluorescence capables de procéder à une microscopie en timelapse. Bien que le logiciel discuté ici corresponde au logiciel fourni par le fabricant spécifique comme indiqué dans le tableau des matériaux, logiciel couramment fourni par d’autres fabricants de microscope ou le libre disponible ImageJ5, ont des outils équivalents pour analyser les données de microscopie. Pour les conditions où le timelapse n’est pas propice, des expériences de cours dans le temps pourraient être menées comme décrit dans cet article. Les protocoles décrits ici fournissent un guide détaillé pour étudier les changements phénotypiques chez deux espèces bactériennes différentes : B. subtilis et S. aureus. Voir tableau 1 pour les souches utilisées.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie est restée un pilier dans les études relatives aux organismes microbiens. Compte tenu de la taille des cellules à l’échelle du micron, les études sur le niveau d’une seule cellule ont traditionnellement été utilisées sur la microscopie électronique (EM). Bien que l’EM soit devenue une technique assez puissante ces dernières années, elle a ses propres limites intrinsèques en plus de l’accès limité des utilisateurs16. Les améliorations apportées aux techniques de micro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs commentaires sur cet article. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage de l’Université de Floride du Sud (PE).
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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