Floresan Etiketli Bakteriler Sucul Ekosistemlerde Organik Karbon Akışının Yeni Yollarını Ortaya Çıkaracak Bir İzleyici Olarak
Summary
Burada sunulan yüksek hassasiyet ve taksonomik çözünürlük ile sucul yırtıcı ökaryotlar otlatma oranları ölçmek için tek hücreli, epifloresan mikroskobik tabanlı teknik için bir protokoldür.
Abstract
Predasyon ve etkileri gibi trofik etkileşimlerin aydınlatılması ekoloji alanında birçok araştırmacının sık rastlanan bir görevidir. Mikrobiyal toplulukların incelenmesi birçok sınırlamaları vardır ve bir yırtıcı, av ve yırtıcı oranları belirlemek genellikle zordur. Burada sunulan bir tracer olarak floresan etiketli av eklenmesine dayalı optimize edilmiş bir yöntemdir, hangi suda yırtıcı ökaryotlar da otlatma oranları güvenilir quantitation ve daha yüksek trofik seviyelere besin transferi tahmini sağlar.
Introduction
Heterotrofik prokaryotlar su sistemlerinde önemli bir biyolojik bileşendir ve planktonbiyokütlesininönemli bir kısmını 1,2,3. Onların bolluk, çeşitlilik ve aktivite kontrol faktörler biyojeokimyasal bisiklet rollerini anlamak için çok önemlidir (yani, organik karbon ve diğer besin ve prokaryotlardan daha yüksek trofik seviyelere enerji akışı kaderi). Protozoon otlatma bu önemli faktörlerden biridir. Heterotrofik nanoflagellates ve silyates Bacterivory prokaryotik bolluk üzerinde güçlü bir yukarıdan aşağıya kontrol empoze, toplum fonksiyonu, yapısı, çeşitlilik, ve hatta hücresel morfoloji ve belirli bakteri gruplarının büyüme hızı4, 5,6. Bazı sistemlerde, protistler bakteriyel mortalitenin başlıca nedeni olarak hizmet6,7.
Bir süredir kullanılan protozoan bakteritomutaminin değerlendirilmesinde kullanılan standart yaklaşım, floresan olarak etiketlenmiş bakterilerin (FLB) av analogları ve epifloresan mikroskopisi olarak kullanılmasını içerir. Hücreye özgü alım oranları, protistan gıda vakuollerinde etiketlenmiş av partiküllerinin sayısının seçili bir zaman rotası8üzerinden ölçülmesi ile belirlenebilir. Bu yaklaşımın çeşitli avantajları vardır. Tracer doğal yırtıcı ve av toplulukları ile doğal örneklere eklenir. Kuluçkadan önce minimum numune manipülasyonu, ilave FLB izleyicisi tarafından minimum numune değişimi vardır ve inkübasyon süreleri, yerinde koşullara yakın koşullarda elde edilen sağlam sonuçları sağlamak için kısadır. Alternatif olarak, düşük sayıda bakteriyvorous protistveya zooplankton (örneğin, offshore deniz sistemleri) olan ortamlarda, flb’nin kaybolma oranları düşük miktarlarda ki numunelere eklenebilir (%2-3 izleyici) uzun vadede akış sitometrisi ile tespit edilebilir (12-24 saat) kuluçka deneyleri. Daha sonra, başlangıç ve bitiş noktalarındaki FLB sayıları (tüm bakterivorların etkisini entegre etmek) akış sitometrisi ile ölçülür (ayrıntılar için, önceki yayına bakın9). Ancak, böyle bir parametre sadece doğrudan herhangi bir protistan ve zooplankton otlatma grupları veya türlerine atfedilemez toplam toplam bakteriyon oranları temsil eder.
Genel olarak, protistan türlerinin veya morfotipe özgü bakteriyel mortalite oranlarının doğru ve ekolojik anlamla ölçülmesi zor olabilir. Bazı protistler seçici otlatıcılar, ve boyutu ve eklenen FLB tracer hücre şekli av alım Doğal oranları bozabilir10,11. Ayrıca, protistan aktivitesi ve metabolizması yüksek ısıya duyarlı12; bu nedenle, eklenen FLB izleyici miktarı dikkatle her bir örnek türü için manipüle edilmesi gerekir (sadece doğal bolluk dayalı, boyut, ve bakteriroriorların morfolojisi ve bakterivores hakim türleri, ama aynı zamanda sıcaklık). Çoğu çalışma toplu protistan otlatma aktivitesi üzerinde duruluyor; ancak, belirli protistan türlerinin bakteriyonu genellikle çok daha yüksek bir bilgi değerine sahiptir ve tercih edilebilir. Bu durumda protist türlerin taksonomik bilgisine bir örnekte mevcut ve davranışlarının anlaşılması gerekmektedir. Bu nedenle, belirli bir protistan grubu veya türüne atfedilen türe özgü bakteriton oranları hakkında sağlam sonuçlar elde etmek için önemli miktarda zaman ve emek gereklidir.
Tüm bu zorluklara rağmen, bu yaklaşım doğal ortamlarda protistan bakteritoru değerlendirmek için mevcut en uygun araç olmaya devam etmektedir. Burada sunulan sumikrobiyal ekoloji çalışmalarında bir izleyici olarak FLB kullanmak için kapsamlı, kolay takip yöntemidir. Yaklaşımın bahsedilen tüm sorunlu yönleri hesaba katılır ve daha iyi bir iş akışı açıklanır, zıt ortamlardan iki deney ve karşıt silikat türleri örnek olarak tanımlanır.
İlk vaka çalışması, Çek Cumhuriyeti’ndeki mezotrofik Římov su rezervuarından epilimnetik bir ortamda yapılmıştır ve bu da çoğu yüzey tatlı su cismiyle karşılaştırılabilir otlatıcı ve bakteriyel bolluklar gösterir (cf.5,7). İkinci vaka çalışması sucul etobur bitki Utricularia reflexatuzakları içinde son derece özel bir ortamda yapılmıştır , her iki otlatma mikofrofik siliates son derece yüksek sayıda barındıran (Tetrahymena utriculariae) ve bakteri hücreleri. Her iki numune türünde hücreye özgü otlatma oranları ve bakteriyel duran stokların hesaplamaları gösterilmiştir. Sonuçların bir dizi ekolojik yorumu tartışılır ve olası takip çalışmalarının örnekleri nihayet önerilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sucul sistemlerde trofik etkileşimi çözmek her zaman zordur28, özellikle protistler ve av, bakterileriçeren nano-plankton ölçeklerde. Besin alımı yolları ve niceleme söz konusu olduğunda, biyotik etkileşimlerin yüksek karmaşıklığı nedeniyle, daha yüksek trofik seviyelerde başarıyla kullanılan yöntemlerin uygulanması daha az mümkündür. Bunlar, örneğin, kararlı izotop etiketleme yaklaşımları içerir. Bu protokol, karbon akışını izlemek ve yarı ölçmek/tahmin e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çek Bilim Vakfı tarafından sırasıyla K. Š. ve D. S.’ye verilen 13-00243S ve 19-16554S araştırma hibesi kapsamında desteklenmiştir. Bu makale aynı zamanda Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından finanse edilen “Baraj rezervuarlarının su kalitesini artırmak için bir araç olarak biyomanipülasyon” (No CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417) projesi tarafından desteklenmiştir. ve Eğitim.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
