Флуоресцентно маркированные бактерии в качестве трассировщика для выявления новых путей органического углеродного потока в водных экосистемах
Summary
Представлено здесь протокол для одноклеточных, эпифлюоресцентных микроскопических основе техники для количественной оценки выпаса в водных хищных эукариот с высокой точностью и таксономическим разрешением.
Abstract
Выяснение трофических взаимодействий, таких как хиртация и его последствия, является частой задачей для многих исследователей в области экологии. Изучение микробных сообществ имеет много ограничений, и определение хищника, добычи и хищнических ставок часто бывает трудно. Представленный здесь оптимизированный метод, основанный на добавлении флуоресцентно обозначенной добычи в качестве трассировщика, что позволяет надежно квадализировать показатели выпаса у водных хищных эукариот и оценку переноса питательных веществ на более высокие трофические уровни.
Introduction
Гетеротрофные прокариоты являются ключевым биологическим компонентом в водных системах и составляют значительную долю биомассы планктона1,2,3. Факторы, контролирующие их изобилие, разнообразие и активность, имеют решающее значение для понимания их роли в биогеохимическом велоспорте (т.е. судьбе органического углерода и других питательных веществ и притока энергии от прокариот до более высоких трофических уровней). Простейшие выпаса является одним из этих важных факторов. Бактериальная бактерия гетеротрофных нанофлагеллетов и цилиатов налагает сильный сверху вниз контроль над прокариотическим изобилием, функцией сообщества, структурой, разнообразием и даже клеточной морфологией и темпами роста конкретных бактериальных групп4, 5,6. В некоторых системах, протисты служат основной причиной бактериальной смертности6,7.
Стандартный подход, используемый для оценки простейшие бактерии, которая используется в течение некоторого времени, включает в себя использование флуоресцентно помеченных бактерий (FLB) в качестве аналогов добычи и эпифлюоресценции микроскопии. Cell-специфические тарифы поглощения можно обусловить путем количественной оценки числа помеченных частиц добычи в вакуолах протистановых пищевых продуктов в течение выбранного курса8. Этот подход имеет ряд преимуществ. Tracer добавляется в естественные образцы с естественными сборками хищника и добычи. Существует минимальная манипуляция образца до инкубации, минимальное изменение образца добавленным трассировщиком FLB, и время инкубации короткие, чтобы обеспечить звуковые результаты, полученные при близких к условиям initu. Кроме того, в условиях с низким числом бактериораилистов или зоопланктона (например, морских морских систем) показатели исчезновений FLB, добавленных в образцы в небольших количествах (2%-3% трассировки), могут быть обнаружены с помощью цитометрии потока в долгосрочной перспективе (12-24 ч) инкубационные эксперименты. Затем, номера FLB в начале и конечных точках (интеграция воздействия всех бактериофоров) количественно поток цитометрии (для деталей, см. предыдущую публикацию9). Однако такой параметр представляет собой только общий агрегированный уровень бактериори, который не может быть непосредственно отнесен к какой-либо конкретной протистанской и зоопланктонных групп или видов.
В целом, количественная оценка протистана видов или морфотипа конкретных бактериальных показателей смертности в водной среде точно и с экологическим значением может быть сложной задачей. Некоторые протеисты селективных grazers, и размер и форма клетки добавил FLB трассировщик может исказить естественные темпы усвоения добычи10,11. Кроме того, протистановская активность и обмен веществ являются высокочувствительными к температуре12; поэтому количество добавленного трассировщика FLB необходимо тщательно манипулировать для каждого отдельного типа выборки (не только на основе естественного изобилия, размера и морфологии бактерий и преобладающих типов бактериора, но и на температуре). Большинство исследований сосредоточено на массовой пастбищной деятельности протистана; однако, бактериам охарактериции конкретных видов протистана часто имеет гораздо более высокое информационное значение и может быть предпочтительнее. В этом случае необходимы таксономические знания протеистических видов, присутствующих в образце, и понимание их поведения. Таким образом, значительное количество времени и труда требуется для получения хороших результатов по конкретным видам ставки бактериори, связанные с конкретной группы протистана или видов.
Несмотря на эти трудности, этот подход остается наиболее подходящим инструментом, доступным в настоящее время для оценки протистана бактерии в естественных условиях. Представлено здесь всеобъемлющий, простой в последующей метод для использования FLB в качестве трассировщика в водных микробных исследований экологии. Учитываются все упомянутые проблемные аспекты подхода и описан улучшенный рабочий процесс, в качестве примеров можно привести два эксперимента из контрастных сред, а также контрастные виды цилиат.
Первое тематическое исследование было проведено в эпилимонтической среде из мезотрофического зоохранилища Чёмов в Чешской Республике, которое показывает, что пасерс и бактериальное изобилие сравнимо с большинством поверхностных пресноводных тел (ср.5,7). Второй тематический исследование было проведено в узкоспецифической среде внутри ловушек водного плотоядного растения Utricularia reflexa, в котором содержится чрезвычайно большое количество обоих выпаса миксотрофических цилиатов (Tetrahymena utriculariae) и бактериальных клеток. Показаны расчеты клеточных коэффициентов выпаса и бактериальных постоянных запасов в обоих типах образцов. Затем обсуждается ряд экологических толкований результатов, и, наконец, предлагаются примеры возможных последующих исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Расшифровка трофического взаимодействия в водных системах всегда бросает вызов28,особенно в нано-планктонных масштабах с участием протеистов и их добычи, бактерий. Когда дело доходит до усвоения питательных веществ пути и количественной оценки, применение методов, успешн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Чешским научным фондом в рамках научно-исследовательского гранта 13-00243S и 19-16554S, присуждаемого К. З. и Д.С., соответственно. Эта статья была также поддержана проектом “Биоманипуляция как инструмент для улучшения качества воды в водохранилищах плотин” (No C.02.1.01/0.0/0.0/16-025/0007417), финансируемый Европейским фондом регионального развития, в оперативных программах исследований, разработок и образования.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
