Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici
Summary
Presentato qui è un protocollo per una tecnica a singola cellula, basata sulla microscopia a epifluorescenza per quantificare i tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici con alta precisione e risoluzione tassonomica.
Abstract
Chiarire le interazioni trofiche, come la predazione e i suoi effetti, è un compito frequente per molti ricercatori in ecologia. Lo studio delle comunità microbiche ha molte limitazioni, e determinare un predatore, preda, e tassi predatori è spesso difficile. Presentato qui è un metodo ottimizzato basato sull’aggiunta di prede fluorescenti etichettate come tracciante, che consente una quantificazione affidabile dei tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici e la stima del trasferimento di nutrienti a livelli trofici più elevati.
Introduction
I prokaryote eterotrofici sono una componente biologica chiave nei sistemi acquatici e rappresentano una frazione significativa di plancton biomassa1,2,3. I fattori che controllano la loro abbondanza, diversità e attività sono cruciali per comprendere il loro ruolo nel ciclismo biogeochimico (cioè il destino del carbonio organico e di altri nutrienti e il flusso di energia dai procarioti ai livelli più alti del trofico). Il pascolo protozoo è uno di questi fattori importanti. Bacterivoryo di nanoflagellati e ciliati eterotrofici impone un forte controllo dall’alto verso il basso sull’abbondanza procaritmica, funzione della comunità, struttura, diversità, e anche morfologia cellulare e tasso di crescita di particolari gruppi batterici4, 5,6. In alcuni sistemi, i protisti servono come la principale causa di mortalità batterica6,7.
L’approccio standard utilizzato per valutare il batterio protozoo, che è stato utilizzato da qualche tempo, prevede l’uso di batteri etichettati fluorescentmente (FLB) come analoghi prede e microscopia epifluorescenza. I tassi di assorbimento specifici delle cellule possono essere determinati quantificando il numero di particelle di prede etichettate nei vacuoli alimentari del Prozistan in un corso temporale selezionato8. Questo approccio presenta diversi vantaggi. Tracer viene aggiunto a campioni naturali con assemblaggi di predatori naturali e prede. C’è una manipolazione minima del campione prima dell’incubazione, un’alterazione minima del campione da parte del tracciante FLB aggiunto e i tempi di incubazione sono brevi per garantire risultati sonori ottenuti in condizioni vicine alle condizioni in situ. In alternativa, in ambienti con un basso numero di protisti batteriosi o zooplancton (ad esempio, sistemi marini offshore), i tassi di scomparsa di FLB aggiunti a campioni in quantità basse (2%-3% tracciante) possono essere rilevati tramite citometria di flusso a lungo termine (12-24 h) esperimenti di incubazione. Quindi, i numeri di FLB all’inizio e all’estremità (integrando l’impatto di tutti i batteri) sono quantificati dalla citometria di flusso (per i dettagli, vedi la precedente pubblicazione9). Tuttavia, tale parametro rappresenta solo i tassi totali di bacterivory aggregati che non possono essere direttamente attribuiti a particolari gruppi di pascoli o specie di protistan e zooplancton.
Nel complesso, quantificare con precisione e con significato ecologico i tassi di mortalità batterica specifici delle specie di prozie o del morfotipo nell’ambiente acquatico può essere difficile. Alcuni protisti sono pascoli selettivi, e la dimensione e la forma cellulare del tracciante FLB aggiunto può distorcere i tassi naturali di ingestione delle prede10,11. Inoltre, l’attività e il metabolismo del prozistan sono altamente sensibili alla temperatura12; pertanto, la quantità di tracciante FLB aggiunto deve essere attentamente manipolata per ogni singolo tipo di campione (non solo in base all’abbondanza naturale, alle dimensioni e alla morfologia dei batteri e ai tipi prevalenti di batteri, ma anche sulla temperatura). La maggior parte degli studi si concentrano sull’attività di pascolo del protistan di massa; tuttavia, il batterio di specifiche specie protivazie spesso ha un valore informativo molto più elevato e può essere preferibile. In questo caso, è necessaria la conoscenza tassonomica delle specie protistiche presenti in un campione e la comprensione del loro comportamento. Di conseguenza, sono necessarie notevoli quantità di tempo e manodopera per ottenere risultati sonori su tassi specifici di batterio attribuibili a un particolare gruppo o specie di protistan.
Nonostante queste difficoltà, questo approccio rimane lo strumento più adatto attualmente disponibile per valutare il protivo in ambienti naturali. Presentato qui è un metodo completo e facile da seguire per l’utilizzo di FLB come tracciante negli studi di ecologia microbica acquatica. Tutti gli aspetti problematici menzionati dell’approccio sono presi in considerazione e viene descritto un flusso di lavoro migliorato, con due esperimenti da ambienti contrastanti e specie di ciliato a contrasto come esempi.
Il primo caso di studio è stato condotto in un ambiente epiliminico dal serbatoio di acqua mesotrofica di zmov nella Repubblica Ceca, che mostra abbondanze di pascolo e batteri comparabili alla maggior parte dei corpi d’acqua dolce di superficie (cfr5,7). Il secondo caso di studio è stato condotto nell’ambiente altamente specifico all’interno di trappole della pianta carnivora acquatica Utricularia reflexa, che ospita un numero estremamente elevato di entrambi i ciliati mixotrofici al pascolo (Tetrahymena utriculariae) cellule batteriche. Vengono mostrati i calcoli dei tassi di pascolo specifici delle cellule e delle scorte permanenti batteriche in entrambi i tipi di campione. Viene quindi discussa una serie di interpretazioni ecologiche dei risultati e vengono infine suggeriti esempi di possibili studi di follow-up.
Protocol
Representative Results
Discussion
Decifrare l’interazione trofica nei sistemi acquatici è sempre impegnativo28, soprattutto nelle scale nano-plancton che coinvolgono protisti e le loro prede, batteri. Quando si tratta di percorsi di assorbimento dei nutrienti e quantificazione, l’applicazione di metodi utilizzati con successo a livelli trofici più elevati è meno possibile, a causa dell’elevata complessità delle interazioni biotiche. Questi includono, ad esempio, approcci stabili di etichettatura degli isotopi. Questo protocoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione scientifica ceca nell’ambito della sovvenzione di ricerca 13-00243S e 19-16554S assegnata rispettivamente a K. e D. S. Questo articolo è stato sostenuto anche dal progetto “Biomanipulation as a tool to improving water quality of dim reservoirs” (No C.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale, nel programma operativo Ricerca, Sviluppo e l’istruzione.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
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