בקטריה מתויג חיידקים כנותב כדי לחשוף מסלולים הרומן של זרימת פחמן אורגנית במסגרת אקולוגית מימיים
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול של תא בודד, מיקרוסקופ מבוססי הטכניקה המבוססת לכמת שיעורי המרעה באיקריוטיס טורף מימיים עם דיוק גבוהה ורזולוציה מטקמי.
Abstract
להבהיר אינטראקציות הזנה, כגון מקדם והשפעותיו, היא משימה תכופה לחוקרים רבים באקולוגיה. למחקר של קהילות מיקרוביאלית יש מגבלות רבות, וקביעת שיעורי טורף, טרף, ושיעור טורף הוא לעתים קרובות קשה. מוצג כאן היא שיטה ממוטבת המבוססת על תוספת של טרף מתויג באמצעות פלואורוסקופים כמו מכשיר מעקב, אשר מאפשר כימות אמין של שיעורי המרעה בבית eukaryotes טורף מימיים והערכה של העברה מזינים לרמות הזנה גבוהות יותר.
Introduction
Heterotrophic prokaryotes הם רכיב ביולוגי מפתח במערכות מימיות וחשבון עבור חלק משמעותי של פלנקטון ביומסה1,2,3. גורמים השולטים השפע שלהם, גיוון, ופעילות הם חיוניים להבנת התפקיד שלהם ברכיבה על אופניים ביוגיאוכימיים (כלומר, גורלם של פחמן אורגני וחומרים מזינים אחרים וזרימת האנרגיה prokaryotes לרמות הזנה גבוהה). פרוטוזוזה מרעה הוא אחד מהגורמים החשובים הללו. בקטונאייבורי של heterotrophic nanoflagellates ו סיליטים מטילה שליטה חזקה מלמעלה למטה על שפע prokaryotic, הקהילה פונקציה, מבנה, גיוון, ואפילו מורפולוגיה סלולרית ושיעור הצמיחה של קבוצות בקטריאלי מסוים4, 5,6. במערכות מסוימות, הפרולנים משמשים כגורם העיקרי לתמותת חיידקים6,7.
הגישה הסטנדרטית המשמשת להערכת פרוטוזומין בקטריה שנהב, אשר כבר בשימוש כבר זמן מה עכשיו, כרוך בשימוש של חיידקים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים (FLB) כמו המיקרוסקופ טרף ו אפיפלואורסצנטית. שיעורי ספיגה ספציפיים לתא ניתן לקבוע על ידי כימות מספר חלקיקי טרף שכותרתו בתוך ומזון מאכלים protistan על פני מסלול זמן נבחר8. לגישה זו יש מספר יתרונות. המעקב מתווסף לדגימות טבעיות. של טורף וטרף טבעי יש מניפולציה לדוגמה מינימלית לפני דגירה, מינימום שינוי לדוגמה על ידי מעקב FLB הוסיף, וזמני דגירה קצרים כדי להבטיח תוצאות הקול שהתקבלו תחת התנאים באתרו. לחילופין, בסביבות עם מספרים נמוכים של bacterivorous protists או זואופלנקטון (למשל, מערכות ימיות ימיות), שיעורי היעלמות של FLB שנוספו דגימות בכמויות נמוכות (2%-3% מעקב) ניתן לזהות באמצעות cy, הזרמת לטווח ארוך (12-24 h) . ניסויים בדגירה לאחר מכן, מספרים של FLB בנקודות ההתחלה והסיום (שילוב ההשפעה של כל הbacterivores) הם כימות על ידי הזרמת cy, (לפרטים, ראה פרסום קודם9). עם זאת, פרמטר כזה מייצג רק שיעורי בקטרק שנהב צבורים שאינם ניתנים לייחס ישירות לקבוצות או מינים מסוימים של protistan ו-זואופלנקטון גרזר.
בסך הכל, לכמת את המינים protistan-או מורפולטיפ-שיעורי תמותה חיידקיים ספציפיים בסביבה הימית במדויק עם משמעות אקולוגית יכול להיות מאתגר. חלק מהפרולנים הם גררנים סלקטיבית, והגודל והצורה של התא של מעקב FLB הוסיף עשוי לעוות שיעורי טבעי של טרף בליעה10,11. יתר על כן, פעילות protistan ומטבוליזם הם מאוד רגישים לטמפרטורה12; לכן, את כמות המעקב הוסיף FLB צריך להיות מניפולציות בקפידה עבור כל סוג לדוגמה בודדים (לא רק מבוסס על השפע הטבעי, גודל, מורפולוגיה של חיידקים וסוגים השוררים של bacterivores, אבל גם על הטמפרטורה). רוב המחקרים מתמקדים בפעילות מרעה בתפזורת; עם זאת, בקטיואייבורי של מינים מסוימים protistan לעתים קרובות מחזיקה ערך מידע גבוה הרבה יותר ויכול להיות עדיף. במקרה זה, יש צורך בידע מטקמי של המין הפרוטיסטים המצויים במדגם והבנה של התנהגותם. מכאן, כמויות משמעותיות של זמן ועבודה נדרשים לקבל תוצאות קול על שיעורי מינים ספציפיים של בקטיית שנהב המיוחס לקבוצה מסוימת protistan או מינים.
למרות הקשיים הללו, גישה זו נותרה הכלי המתאים ביותר הזמין כיום להערכת בקטאסטן בקטטיאייבורי בהגדרות טבעיות. המוצג כאן הוא שיטה מקיפה וקלה לביצוע לשימוש ב-FLB כמעקב במחקרים אקולוגים מימיים. כל ההיבטים הבעייתיים של הגישה מוזכרים ומתוארת זרימת עבודה משופרת, עם שני ניסויים מסביבות מנוגדות, כמו גם מינים מנוגדים כדוגמאות.
מקרה המחקר הראשון נערך בסביבה epilimnetic ממאגר המים mesotrophic, ברפובליקה הצ, אשר מראה גרזר ו בקטריאלי מדומה לגופים מים מתוקים ביותר של פני השטח (cf.5,7). מקרה המחקר השני נערך בסביבה ספציפית מאוד בתוך מלכודות של צמח טורף מימיים Reflexa Cularia, אשר מארחת מספרים גבוהים מאוד של שניהם מרעה mixotrophic סיליטים (טטרהימנה קורט) ותאי חיידקים. חישובי שיעורי המרעה הספציפיים לתא ומניות עמידה חיידקית בשני סוגי המדגם מוצגים. לאחר מכן נדון במגוון פירושים אקולוגיים לתוצאות, ודוגמאות למחקרים אפשריים להמשך הטיפול מוצעות בסופו של דבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פענוח הזנה אינטרקציה במערכות מימיות הוא תמיד מאתגר28, במיוחד בסולמות ננו-פלנקטון המעורבים protists והטרף שלהם, חיידקים. כשמדובר מסלולים ספיגה תזונתיים ו כימות, היישום של שיטות בהצלחה בשימוש ברמות הזנה גבוהה יותר הוא פחות אפשרי, בשל המורכבות הגבוהה של אינטראקציות ביוגרפיות. אלה כו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי קרן המדע הצ תחת מלגת מחקר 13-00243S ו 19-16554S הוענק K. מיס ו-D. S., בהתאמה. מאמר זה נתמך גם על ידי הפרויקט “ביוניפולציה ככלי לשיפור איכות המים של מאגרי סכר” (לא CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), במימון קרן הפיתוח האזורית האירופית, במחקר התוכנית המבצעית, פיתוח והשכלה.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
