Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques
Summary
Présenté ici est un protocole pour une seule cellule, l’épifluorescence technique basée sur la microscopie pour quantifier les taux de pâturage chez les eucaryotes prédateurs aquatiques avec une haute précision et une résolution taxonomique.
Abstract
L’élucidation des interactions trophiques, telles que la prédation et ses effets, est une tâche fréquente pour de nombreux chercheurs en écologie. L’étude des communautés microbiennes a de nombreuses limites, et il est souvent difficile de déterminer les taux de prédateurs, de proies et de prédateurs. Présenté ici est une méthode optimisée basée sur l’ajout de proies fluorescentes étiquetées comme un traceur, ce qui permet une quantitation fiable des taux de pâturage dans les eucaryotes prédateurs aquatiques et l’estimation du transfert de nutriments à des niveaux trophiques plus élevés.
Introduction
Les procaryotes hétérotrophes sont un composant biologique clé dans les systèmes aquatiques et représentent une fraction importante de la biomasse du plancton1,2,3. Les facteurs qui contrôlent leur abondance, leur diversité et leur activité sont essentiels pour comprendre leur rôle dans le cycle biogéochimique (c.-à-d. le sort du carbone organique et d’autres nutriments et le flux d’énergie des procaryotes à des niveaux trophiques plus élevés). Le pâturage protozoaires est l’un de ces facteurs importants. Bacterivory des nanoflagellates et des cils hétérotrophes impose un contrôle descendant fort sur l’abondance procaryotique, la fonction de la communauté, la structure, la diversité, et même la morphologie cellulaire et le taux de croissance de groupes bactériens particuliers4, 5,6. Dans certains systèmes, les protistes sont la principale cause de mortalité bactérienne6,7.
L’approche standard utilisée pour évaluer le bactérioris protozoaire, qui est utilisé depuis un certain temps déjà, implique l’utilisation de bactéries étiquetées fluorescentes (FLB) comme analogues de proie et microscopie épifluorescence. Les taux d’apaisement spécifiques aux cellules peuvent être déterminés en quantifiant le nombre de particules de proies étiquetées dans les vacuoles alimentaires du protistan sur un parcours temporel sélectionné8. Cette approche présente plusieurs avantages. Tracer est ajouté à des échantillons naturels avec des assemblages naturels de prédateurs et de proies. Il y a une manipulation minimale de l’échantillon avant l’incubation, une altération minimale de l’échantillon par le traceur FLB ajouté, et les temps d’incubation sont courts pour s’assurer que les résultats sont solides obtenus dans des conditions proches de l’in situ. Alternativement, dans les environnements où le nombre de protistes bactérioraires ou de zooplancton (p. ex., les systèmes marins extracôtiers), les taux de disparition des FLB ajoutés aux échantillons en faibles quantités (2 % à 3 % de traceur) peuvent être détectés par cytométrie de débit à long terme (12-24 h). expériences d’incubation. Ensuite, les nombres de FLB aux points de départ et d’extrémité (intégrant l’impact de tous les bactérioris) sont quantifiés par cytométrie de flux (pour plus de détails, voir la publication précédente9). Cependant, un tel paramètre ne représente que les taux totaux de bactérioris agrégés qui ne peuvent être directement attribués à des groupes ou espèces de brouteurs de protistan et de zooplancton en particulier.
Dans l’ensemble, il peut être difficile de quantifier avec précision et avec un sens écologique les taux de mortalité bactérienne spécifiques aux espèces protistan ou au morphotype dans l’environnement aquatique. Certains protistes sont des brouteurs sélectifs, et la taille et la forme cellulaire du traceur FLB ajouté peuvent fausser les taux naturels d’ingestion deproies 10,11. En outre, l’activité et le métabolisme du protistan sont très sensibles à la température12; par conséquent, la quantité de traceur FLB ajouté doit être soigneusement manipulée pour chaque type d’échantillon individuel (non seulement en fonction de l’abondance naturelle, la taille et la morphologie des bactéries et des types dominants de bactériivores, mais aussi sur la température). La plupart des études portent sur l’activité de pâturage en vrac du protistan; cependant, le bactériérique d’espèces spécifiques de protistan a souvent une valeur d’information beaucoup plus élevée et peut être préférable. Dans ce cas, la connaissance taxonomique des espèces protistes présentes dans un échantillon et la compréhension de leur comportement sont nécessaires. Par conséquent, des quantités considérables de temps et de travail sont nécessaires pour obtenir des résultats solides sur les taux spécifiques d’espèce de bactériorisattribuable attribuable à un groupe ou une espèce protistan particulier.
Malgré ces difficultés, cette approche demeure l’outil le plus approprié actuellement disponible pour évaluer le bactériivory protistan dans les milieux naturels. Présenté ici est une méthode complète, facile à suivre pour utiliser FLB comme un traceur dans les études d’écologie microbienne aquatique. Tous les aspects problématiques mentionnés de l’approche sont pris en compte et un flux de travail amélioré est décrit, avec deux expériences à partir d’environnements contrastés ainsi que des espèces de ciliate contrastées à titre d’exemples.
La première étude de cas a été menée dans un environnement épilimnétique à partir du réservoir d’eau mésotrophique d’Omov en République tchèque, qui montre des abondances de broussailles et de bactéries comparables à la plupart des plans d’eau douce de surface (cf.5,7). La deuxième étude de cas a été menée dans l’environnement très spécifique à l’intérieur des pièges de la plante carnivore aquatique Utricularia reflexa, qui accueille un nombre extrêmement élevé de deux ciliates mixotrophiques de pâturage (Tetrahymena utriculariae) cellules bactériennes. Les calculs des taux de pâturage spécifiques aux cellules et des stocks permanents bactériens dans les deux types d’échantillons sont présentés. Une série d’interprétations écologiques des résultats est ensuite discutée, et des exemples d’études de suivi possibles sont finalement suggérés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Déchiffrer l’interaction trophique dans les systèmes aquatiques est toujours difficile28, en particulier à l’échelle nano-plancton impliquant les protistes et leurs proies, les bactéries. Quand il s’agit de voies d’absorption des nutriments et de quantification, l’application de méthodes utilisées avec succès à des niveaux trophiques plus élevés est moins possible, en raison de la grande complexité des interactions biotiques. Il s’agit, par exemple, d’approches stables d’étiquetage de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la Fondation tchèque des sciences dans le cadre de la subvention de recherche 13-00243S et 19-16554S accordée set à K. et D. S., respectivement. Cet article a également été soutenu par le projet “Biomanipulation comme outil pour améliorer la qualité de l’eau des réservoirs de barrages” (No CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-025/0007417), financé par le Fonds européen de développement régional, dans le domaine de la recherche, du développement et du développement des programmes opérationnels et l’éducation.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
