Hier is een protocol voor een eencellige, epifluorescentie microscopie gebaseerde techniek om Graas percentages te kwantificeren in aquatische roofzuchtige eukaryoten met een hoge precisie en taxonomische resolutie.
Elucidating trofische interacties, zoals predatie en de effecten ervan, is een frequente taak voor veel onderzoekers in de ecologie. De studie van microbiële gemeenschappen heeft vele beperkingen, en het bepalen van een roofdier, prooi, en roofzuchtige tarieven is vaak moeilijk. Hier is een geoptimaliseerde methode gebaseerd op de toevoeging van fluorescently gelabelde prooi als een Tracer, die een betrouwbare kwantificatie van de Graas percentages in aquatische roofzuchtige eukaryoten mogelijk maakt en een schatting van de overdracht van voedingsstoffen naar hogere trofische niveaus.
Heterotrofische prokaryoten zijn een belangrijke biologische component in aquatische systemen en vormen een belangrijke fractie van de biomassa van het plankton1,2,3. Factoren die hun overvloed, diversiteit en activiteit beheersen, zijn cruciaal voor het begrijpen van hun rol in biogeochemische Cycling (d.w.z. het lot van organische koolstof en andere voedingsstoffen en stroom van energie van prokaryoten naar hogere trofische niveaus). Protozoan begrazing is een van deze belangrijke factoren. Bacterivory van heterotrofische nanoflagellates en ciliaten legt een sterke top-down controle over prokaryotische overvloed, Gemeenschap functie, structuur, diversiteit, en zelfs cellulaire morfologie en groeisnelheid van bepaalde bacteriële groepen4, 5,6. In sommige systemen dienen protisten als de belangrijkste oorzaak van bacteriële sterfte op6,7.
De standaardbenadering gebruikt om protozoeen bacterivory te beoordelen, die nu al enige tijd wordt gebruikt, omvat het gebruik van fluorescently gelabelde bacteriën (FLB) als prooi analogen en epifluorescentie microscopie. Celspecifieke opnamesnelheden kunnen worden bepaald door het aantal gelabelde prooi deeltjes in protistan voedsel vacuolen te kwantificeren over een geselecteerde tijd cursus8. Deze aanpak heeft een aantal voordelen. Tracer wordt toegevoegd aan natuurlijke monsters met natuurlijke roofdieren en prooi assemblages. Er is een minimale monster manipulatie voorafgaand aan incubatie, minimale monster wijziging door de toegevoegde FLB Tracer, en incubatie tijden zijn kort om goede resultaten te garanderen die onder de omstandigheden in situ zijn verkregen. Als alternatief kan in omgevingen met lage aantallen bacteriële protisten of zoöplankton (bv. offshore mariene systemen) de verdwijningen van FLB toegevoegd aan monsters in lage hoeveelheden (2%-3% Tracer) worden gedetecteerd via Flowcytometrie in lange termijn (12-24 h) incubatie experimenten. Vervolgens worden de nummers van de FLB aan het begin-en eindpunt (integratie van de impact van alle bacterieomen) gekwantificeerd door flowcytomeltry (zie vorige publicatie9voor meer informatie). Een dergelijke parameter vertegenwoordigt echter alleen de totale geaggregeerde bacterivory percentages die niet direct kunnen worden toegeschreven aan bepaalde protistan-en zoöplankton Grazer groepen of soorten.
Over het algemeen kan het een uitdaging zijn om de protistan soorten-of morphotype-specifieke bacteriële sterftecijfers in het aquatische milieu nauwkeurig en met ecologische betekenis te kwantificeren. Sommige protisten zijn selectieve grazers, en de grootte en de celvorm van de toegevoegde FLB Tracer kunnen de natuurlijke tarieven van prooi inname10,11verstoren. Bovendien zijn protistan activiteit en metabolisme zeer temperatuurgevoelig12; Daarom moet de hoeveelheid toegevoegde FLB Tracer zorgvuldig worden gemanipuleerd voor elk afzonderlijk monster type (niet alleen op basis van de natuurlijke overvloed, grootte, en morfologie van bacteriën en de heersende soorten bactervores, maar ook op temperatuur). De meeste studies richten zich op bulk protistan grazende activiteit; de bacterivory van specifieke protistan soorten heeft echter vaak een veel hogere informatiewaarde en kan de voorkeur hebben. In dit geval is de taxonomische kennis van de protist soorten die in een steekproef aanwezig zijn en het begrip van hun gedrag noodzakelijk. Vandaar dat er aanzienlijke hoeveelheden tijd en arbeid nodig zijn om goede resultaten te behalen op soortspecifieke tarieven van bacterivory die toe te schrijven zijn aan een bepaalde protistan groep of soort.
Ondanks deze moeilijkheden blijft deze aanpak het meest geschikte instrument dat momenteel beschikbaar is om protistan bacterivory in natuurlijke instellingen te beoordelen. Hier gepresenteerd is een uitgebreide, gemakkelijk te volgen methode voor het gebruik van FLB als een Tracer in aquatische microbiële ecologie studies. Alle genoemde problematische aspecten van de aanpak worden verantwoord en een verbeterde workflow wordt beschreven, met twee experimenten uit contrasterende omgevingen en contrasterende ciliate soorten als voorbeelden.
De eerste casestudy werd uitgevoerd in een epilimnetische omgeving van het mesotrofische Římov waterreservoir in de Tsjechische Republiek, dat Grazer en bacteriële Abundances vertoont die vergelijkbaar zijn met de meeste oppervlakte zoet waterlichamen (cf.5,7). De tweede casestudy werd uitgevoerd in de zeer specifieke omgeving binnen vallen van de aquatische vleesetende plant ,die een extreem hoge aantallen van beide grazende mixotrofische ciliaten (tetrahymena utaanariae) heeft. en bacteriële cellen. Berekeningen van de celspecifieke Graas percentages en bacteriële staande voorraden in beide soorten monsters worden weergegeven. Een reeks van ecologische interpretaties van de resultaten wordt dan besproken, en voorbeelden van mogelijke follow-up studies worden uiteindelijk voorgesteld.
Deciphering trofische interactie in aquatische systemen is altijd uitdagend28, vooral op de nano-plankton schalen waarbij protisten en hun prooi, bacteriën. Als het gaat om nutriëntenopname trajecten en kwantificering, is de toepassing van methoden met succes gebruikt op hogere trofische niveaus minder mogelijk, vanwege de hoge complexiteit van biotische interacties. Deze omvatten, bijvoorbeeld, stabiele isotoop labeling benaderingen. Dit protocol toont de voordelen van het gebruik van epifluore…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gesteund door de Tsjechische Science Foundation onder de Research Grant 13-00243S en 19-16554S toegekend aan K. Š. en D. S., respectievelijk. Dit artikel werd ook gesteund door het project “Biomanipulation als een instrument voor het verbeteren van de waterkwaliteit van stuw reservoirs” (no CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), gefinancierd door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling, in het operationele programma onderzoek, ontwikkeling en onderwijs.
0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
Centrifuge | 22 000 x g | ||
Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
Counting grid in one of the oculars | |||
Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
MQ water for diluting samples | Any brand |
||
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
Sonicator | Any brand | 30 W | |
Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |