Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas
Summary
Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.
Abstract
Os nanocápsulas do liposome foram aplicados para muitas finalidades nas indústrias farmacêuticas, cosméticas, e do alimento. Os atributos dos lipossomas incluem sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-imunogenicidade, não-toxicidade, e capacidade de aprisionação de compostos hidrófilos e hidrofóbicos. A hidratação clássica de películas lipídicas finas em um solvente orgânico é aplicada nisto como uma técnica para encapsular a Tarina, uma lectina vegetal, em nanoliposomas. O tamanho de nanoliposome, a estabilidade, a eficiência do aprisionamento, e a caracterização morfológica são descritos em detalhe. Os nanolipossomas são preparados com 1,2-dioleoilo-SN-glicerol-3-Fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[amino (polietileno glicol)-2000] (sal de amônio; DSPE-MPEG 2000), e cholesterylhemisuccinate (CHEMS) como os constituintes principais. Os lipídios são primeiro dissolvidos em clorofórmio para obter um filme lipídico fino que é subsequentemente rehidratado em solução de sulfato de amônio contendo a proteína a ser aprisionada e incubadas durante a noite. Em seguida, técnicas de sonicação e extrusão são aplicadas para gerar vesículas unilamelares nanodimensionadas. O índice do tamanho e do polidispersão dos nanovesicles é determinado pelo espalhamento claro dinâmico, quando a morfologia do nanovesicle for avaliada pela microscopia de elétron de varredura. A eficiência de aprisionamento é determinada pela proporção da quantidade de proteína não encapsulada à quantidade original de proteína inicialmente carregada. Os lipossomas homogêneos são obtidos com um tamanho médio de 155 nm e valor de índice de polidispersidade de 0,168. Uma eficiência elevada do armadilha de 83% é conseguida.
Introduction
O número de estudos que investigam sistemas eficientes de entrega de medicamentos aumentou nos últimos anos. Entretanto, as limitações tais como o afastamento rápido, a biodistribuição pobre, e a solubilidade no pH fisiológico e a captação celular insuficiente ainda precisam de ser ultrapassada. O uso de nanosistemas surgiu como recente progresso na terapêutica oncológica, aplicada para aumentar a concentração intracelular de drogas dentro de células cancerosas, minimizando a toxicidade em células saudáveis. Além disso, as nanopartículas obtidas a partir de uma gama diferente de materiais (ou seja, polímeros, dendrímeros, lipossomas, vírus, nanotubos de carbono e metais como óxido de ferro e ouro) estão atualmente sendo aplicados para aumentar os efeitos anticâncer e reduzir o sistêmicos toxicidade1. Os nanocápsulas do liposome em particular foram aplicados para muitas finalidades nas indústrias farmacêuticas, cosméticas, e do alimento. Nos últimos anos, vários produtos nutracêuticos, como vitaminas, enzimas e extratos de ervas, foram formulados usando a tecnologia lipossomas2.
Os lipossomas são vesículas esféricas constituídas por um ou mais bicamadas lipídico concêntrico espontaneamente formados pela dispersão de fosfolipídios em meios aquosos3,4. As cabeças polares dos fosfolipídeos estão localizadas nas superfícies externa e interna das membranas, em contato com o ambiente aquoso. Em contraste, as cadeias de ácidos graxos formam o núcleo hidrofóbico das membranas e são protegidas da água5. Alguns atributos de lipossomas que os tornam atraentes sistemas de entrega de medicamentos incluem a sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-imunogenicidade, não-toxicidade, e capacidade de aprisionação de compostos hidrofílicos e hidrofóbicos6.
Os lipossomas podem ser preparados usando vários processos de etapas, tais como agitação, sonicação, extrusão, liofilização, congelamento, e thawing. Os métodos clássicos incluem evaporação de fase reversa, injeção de solvente e diálise em detergente. O método mais aplicado é a hidratação fina do filme lipídico, também conhecido como método de Bangham, que é utilizado para a obtenção de formas vesicular-lipídicas7,8,9,10,11. O lamellarity (o número de bilayers do fosfolipídeo) e o tamanho de partícula são os parâmetros clássicos usados para caracterizar lipossomas como 1) vesículas unilamelares (ULVs), formados por um BICAMADA original do fosfolipídeo e variando no tamanho como segue: i) unilamelares pequeno vesículas (SUVs, ~ 0,02-0,20 μm), II) grandes vesículas unilamelares (LUVs, ~ 0,2-1,0 μm) e III) vesículas unilamelares gigantes (GUVs, > 1 μm); ou 2) vesículas multilamelares (mlvs, > 0,1 μm)3,12. O tamanho da vesícula é um parâmetro importante quando se considera para uso terapêutico, como no tratamento do câncer, em que os tamanhos de < 200 nm são ideais para permitir que nanovesicles cruzem a barreira endotelial e alcancem os tecidos tumorais4.
Neste documento, o procedimento de encapsulamento após a hidratação clássica de uma técnica fina de filme lipídico7 foi descrito utilizando-se Tarin, uma lectina vegetal caracterizada como proteína globular hidrofílica13,14,15 . Vesículas nanodimensionadas são produzidas pela inclusão de sonicação e etapas de extrusão na técnica principal, resultando em nanovesicículos lipossomal estáveis com alta eficiência de aprisionamento16.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito foi testado por Correa et al.16 para encapsular a Tarina, uma lectina imuno-modulatória e antitumoral purificada da Colocasia esculenta22. A metodologia produziu resultados bem-sucedidos, permitindo a produção de nanoliposomas estáveis de tamanho adequado para aplicações terapêuticas. A formulação apresenta liberação controlada em diferentes níveis de pH em condições fisiológicas. Também potenciora as propriedades farmacológicas da Tarina, como a inibição do glioblastoma humano U-87 MG e o câncer de mama MDA-MB-231 linhas celulares e estimulação de células de medula óssea de camundongos. A preparação lipossomal não exibiu nenhuns efeitos tóxicos em pilhas saudáveis16dos ratos.
O método clássico, descrito pela primeira vez por Bangham et al.7, permite a produção de grandes vesículas lipoalgas multilamelares, heterogêneas em tamanho e forma. As adaptações deste método, como relatado no presente estudo, são aplicadas com sucesso, incluindo etapas adicionais, como sonicação e extrusão através de uma membrana de policarbonato de 0,2 μm. Isto permite a produção de uma dispersão mais homogênea em relação ao tamanho na faixa de nanômetro16,23,24. Conseqüentemente, para assegurar resultados bem sucedidos, o protocolo do encapsulamento e a formulação lipossomal descritas aqui devem estritamente ser seguidas.
A composição do nanoliposome foi selecionada com cuidado a fim assegurar a formação de uma membrana do BICAMADA com dope, MPEG 2000-dspe, e Chems como os constituintes principais. Estes são constituintes de BICAMADA de membrana animal natural e este último pode conferir fluidez à arquitetura nanoliposome, garantindo ampla aplicação para a entrega de compostos bioativos em seres humanos.
A peguilação de nanoliposome é essencial para garantir a estabilidade da estrutura lipossomas. A ausência de Peg conduz ao alargamento do tamanho, a um índice elevado do polidispersão, e à baixa eficiência do aprisionamento. Os resultados óptimos podem ser obtidos com o dope como o componente principal do lipossomas. No entanto, este é um fosfolípido de alto custo. Os custos financeiros da produção de nanoliposome podem ser conseguidos substituindo o NARCÓTICO com outros lipídios similares tais como o DOPC (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfocolina). O CHEMS é uma molécula de colesterol encontrada naturalmente em membranas de células animais, que não devem ser excluídas da formulação, uma vez que é importante garantir a fluidez e maleabilidade do bicayer lipídico16.
Outros aspectos do protocolo de encapsulamento também podem ser adaptados. O clorofórmio utilizado para dissolver os componentes lipossomal pode ser facilmente substituído por metanol sem efeitos na média de tamanho, homogeneidade e eficiência de aprisionamento. No entanto, alguns vazamentos de proteínas podem ocorrer no armazenamento 4 ° c16. O passo de incubação durante a noite com solução de sulfato de amônio contendo Tarina não é obrigatório; no entanto, por conveniência, pode ser realizada sem prejuízo para as características biofísicas nanoliposomáticas, encapsulação ou perdas de eficiência de estabilidade, como demonstrado por Correa et al.16. A etapa da extrusão é executada na temperatura ambiente, que pode diminuir a taxa de fluxo entre as seringas se uma membrana do tamanho de poro de 0,1 μm é usada.
Para superar esse problema, o uso de uma membrana de tamanho de poros de 0,2 μm ou o aquecimento do suporte da extrusora acima da temperatura de transição lipídica devem ser considerados. O analista deve ter cuidado para não danificar os lipídios ou proteínas que podem ser inativados e perder a atividade biológica. Alternativamente, a preparação lipossomal pode ser diafiltrado de encontro a HBS em vez da ultracentilgação, usando uma membrana do corte de acordo com o peso molecular da proteína. A escolha da natureza química do tampão em que os em são suspendidos depois que o ultracentlee está diretamente relacionado a sua aplicação subseqüente. Como as perspectivas deste estudo incluem ensaios in vivo e in vitro, a suspensão em soro fisiológico tamponado de HEPES foi adequada para garantir que não houvesse efeitos citotóxicos e um intervalo de pH próximo às condições fisiológicas.
Os lipossomas devem ser tratados finamente, semelhantes às células vivas, para obter imagens SEM maior qualidade. Os procedimentos de fixação e secagem são importantes para garantir a visualização de vesículas intactas menores que suportam valores superiores a 20 kV condições de vácuo. Figura 2 A, B apresenta vesículas nanodimensionadas compatíveis com o procedimento de extrusão. A visualização de vesículas variando de 51-396 nm é possível se a preparação adequada da amostra após este procedimento for realizada. As etapas incluem fixação, secagem por aumento das concentrações de etanol e desidratação química para evitar a formação de agregados e vesículas rompidas causadas pelo vácuo e feixe de elétrons. Por outro lado, a Figura 2C, D mostra vesículas liofilizadas secas temperatura ambiente e não submetidas a quaisquer tratamentos aqui descritos, o que significa que eles foram preparados de forma inadequada. Como resultado do procedimento inadequado, as vesículas gigantes são formadas, mesmo após a extrusão através de uma membrana de tamanho de poros de 0,2 μm. Vesículas rupcionadas também são observadas em ambos os painéis como resultado de danos causados por vácuo e feixe de elétrons.
As vesículas de nanoliposome têm sido exploradas como um sistema de encapsulamento e entrega de moléculas hidrofóbicas, incluindo o resveratrol (3, 5, 4 ‘-trihidroxistilbene), um composto Bioativo contra células cancerosas Colorretais. O procedimento de encapsulamento pode superar a solubilidade pobre de compostos lipofílicos, além de fornecer biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-imunogenicidade, e características de não-toxicidade inerentes a liposoma nanocápsulas25. As adaptações do protocolo devem ser levadas em consideração, dependendo da via de administração e da finalidade, como o desenvolvimento de novas formulações de lipoalgumas para administração oral.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos às instalações do laboratório de caracterização de materiais multiusuários, laboratório de microscopia eletrônica e COPPE/UFRJ; ao Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe, e Rafael Lindoso, professores da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, para uso do ultracentlee; ao Dr. Alexandre Guedes Torres e Daniel Perrone, professores da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, para uso do evaporador rotativo; ao professor Roland Bodmeier e ao Dr. Andriy Dashevskiy da Freie Universität em Berlim, que ajudou com recursos, forneceu novas metodologias e supervisionou a ACNTF durante uma bolsa Erasmus + de 6 meses na Alemanha; ao Dr. Rossana Thiré e Aline Fernandes, professora e técnica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, para uso de Zetasizer Malvern; a Bluma Guenther e taissa Rodrigues, professora e técnica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, para uso do SEM; à Dr. Rachel Ann Hauser Davis, pesquisadora da Fundação Oswaldo Cruz, para narração. Este estudo foi financiado em parte pela coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior, Brasil (CAPES)-código financeiro 001 (subvenção n º 1627392; 1811605); pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant no. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 e e-26/202.860/2016); pelo Conselho Nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq) (subvenção n º 406601/2018-6), e Financiadora de estudos e projetos (FINEP).
Materials
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
References
- Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
- Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
- Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
- Ferreira, D. d. S., Lopes, S. C. d. A., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
- Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
- Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
- Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
- Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
- Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
- Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
- Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P., Janecek, M., Kral, R. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , (2016).
- Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
- dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
- Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
- Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
- Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).
