生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

1. タリンリポソームナノカプセルの調製16 注:すべての調製物は、より大きな体積(7 mL)を得て、サンプルが超遠心分離機で遠心分離されることを可能にするために三重に調製する必要があります(下記の詳細を参照)。 表 1に示すように、分析バランスを使用してリポソーム成分の重量を量る。 ロータリーエバポレーターに収まる250mLの体積フラスコを使用してクロロホルムで脂質成分を溶解し、材料の損失を防ぎます。 150 rpmで15分間撹拌します。 次の条件下でロータリーエバポレータを使用してクロロホルムを除去します。 加熱風呂の水と接触しながら、最適な効率のために、体積フラスコ口を標準位置(25°)に調整します。注:機器アームは、蒸発効率に影響を与えたり、サンプルを損傷したりしない間、体積フラスコと水浴の間の接触を維持するために25°で傾斜する必要があります。標準位置は、機器のブランドによって異なる場合があります。 コンデンサー温度を最低3°Cに設定します。 加熱浴温を40±1°Cに設定します。 回転を 120 rpm に設定します。 真空を207mbarに調整し、沸点を20°Cに調整します。 約25分後、フラスコを取り出し、蒸発した溶媒を捨て、凝縮器に残り、適切に。注:リポソーム成分からなる薄くて不透明なフィルムは、このステップで形成され、容易に視覚化することができます。凝縮器に残っている蒸発溶媒は、適切な廃棄のために専門会社が取り扱う処分受領者(塩素化)に保管する必要があります。 脂質フィルムを水和して、1mg/mLでタリンを含む0.3M硫酸アンモニウム溶液(pH=7.4)で0.01M脂質濃度に達し、最終体積は10mLに達する。 混合物を40分間撹拌し、4°Cで一晩インキュベートする。注: このステップはストップ ポイントと見なすことができます。一晩のインキュベーションは必須ではありません。 インキュベーション後、25°C(室温)で1分間懸濁液を超音波処理します。RT)小胞のサイズを減らし、凝集を避けるために。注:サイズの減少は、次の条件下で超音波超音波装置で行われました:130 Wと40 kHz。 0.2 μmのポリカーボネート細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行います。注:押出プロセスの前に、サンプル漏れを避けるために水を使用してミニ押出機アセンブリをテストします。0.1 μmの細孔膜も適しています。この場合、脂質とタンパク質の両方の物理化学的特性を維持しながら、押し出しを容易にするために、脂質転移温度の上にミニ押出器ホルダーを予熱する。 製造元のマニュアルに記載されているように、ミニ押出機の部品にフィットします。 ポリカーボネート膜を2つのプレウェットフィルターサポートの間に置き、ホルダーに入れます。 1 mLの空の注射器を装置に挿入し、リポソーム懸濁液で他の注射器をその総容積に充填し、反対側に挿入する。 0.2 μmのポリカーボネート細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行います。サンプルを注射器から別の注射器にゆっくりと押し込みます。予おかされたチューブに押し出された懸濁液を集める。注:ポリカーボネート膜は、あるシリンジから別のシリンジへのサンプル転移が困難になった場合にのみ交換する必要があります。リポソームサスペンションは、SUVの形成によるサイズ縮小の結果として押し出しプロセス中に明確になる必要があります。このステップでは、サンプルの約0.2 mLが失われる可能性があります。 超遠心分離により別々のリポソームを分離する。注:超遠心分離機を使用する準備ができるまで、氷浴でサンプルを維持します。スイングバケットローターを備えた超遠心分離機を用いた超遠心分離による残りのコンポーネントと硫酸アンモニウムを分離します(下記の詳細を参照)。 ローターに合うチタンチューブでサンプルを計量し、チューブのバランスをとります。チューブの損傷を防ぐために使用されるローターに従って必要な最小体積を確認し、必要に応じて硫酸アンモニウムでリポソーム懸濁液量を調整します。注:遠心分離機の外側では、回転速度を決定するために遠心分離機で使用される「シマウマストライプ」(底部の黒と白のストライプ)を傷つけないように、スイングバケットは常にスタンドでサポートする必要があります。 遠心分離機を使用する前に真空をオンにして、冷蔵できるようにします。 チタンチューブをスイングバケツに取り付けます。注:チューブを走行時に想定する位置に持ち上げて、完全にフィットしていることを確認します。 真空を離し、遠心分離機のドアを開け、ローターを中に入れます。注:ローターの底面の円マークに注意してください。 遠心分離機のドアを閉じ、真空を押し、真空が200から<20ミクロンまたは26 Paから<3 Paに達するまで待ちます。 超遠心分離機ディスプレイのパラメータを150,000 x g(前述のスイングバケットの29,600 rpmに相当)に4°C(加速度:最大、減速:最大)で90分間調整します。注: 特定の遠心分離機が rpm に設定されている場合は、常に速度を x gに変換します。遠心分離機のウェブサイトを使用して、使用するローターに従ってユニットを変換します。 [リコール] を押し、条件を確認し、[開始] を押して実行します。注: 遠心分離機が目的の速度に達するまで待ちます。 90分後、真空ボタンを押して真空を解放し、真空が200-700ミクロン(26-93 Paに相当)に達したときに遠心分離機のドアを開きます。 遠心分離機を切り、内側からローターを取り外し、バケツを乾かしてベンチに置きます。 氷の上に超遠心サンプルを維持します。 慎重に、上清とペレットを分離するために使い捨て15 mL遠心管にチューブを逆さまにすることによって、ペレットから上清を分離します。注:封入されていないタンパク質を含む上清を4°Cに保管してください。カプセル化の効率を決定するために使用されます。ペレットは半透明のゼリーとして現れる。 HEPES緩衝生理生理中の封入タンパク質を含むペレット(1x HBSの3mL)を中断する。注:HBS 2x(ストック溶液)は、蒸留水中の試薬の次の量を希釈することによって調製されます:140 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO 4、50 mM HEPES、その後、pHを7.4に調整し、最終容積を100mLにします。Na2HPO4は、リポソーム濃度が決定される場合に干渉を避けるためにNaHCO3に置換することも、干渉を避けるために省略することもできる。 HBS 2xストック溶液は、使用前にHBS 1xを得るために蒸留水中で希釈する必要があります。 2. カプセル化効率 注:タンパク質定量における脂質干渉を回避するために、Petersonのプロトコル17を使用してカプセル化効率を決定する。すべてのサンプル(BSA規格およびリポソーム上清)は三重で分析されるべきである。また、ブランクチューブを準備します。 ストック試薬および作業ソリューションの調製17 ストック試薬の場合は、炭酸ナトリウム20%の10mL、硫酸銅0.1%の200μL、200 μLの0.2%の硫酸カリウムを9.6mLの蒸留水で混合して、炭酸銅(CTC)を調製します。10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および0.8N水酸化ナトリウム(NaOH)の100 mLを調出します。 作業溶液の場合は、デオキシコレートナトリウム(DOC)および72%トリクロロ酢酸(TCA)の10 mLを調記します。10mLの蒸留水にウシ血清アルブミン(BSA)を10mgを溶解し、1mg/mL標準溶液を得た。CTC、NaOH、SDS、およびH2 Oの等しい部分を加えて試薬Aを調製し、蒸留水中にフォリン・シオカルテウ・フェノール試薬1:5を希釈して試薬Bを調製する。注:試薬Aは各反応管に対して1mLを必要とし、試薬Bは0.5mLを必要とする。試薬AおよびBの最終容積を決定するには、まず使用する反応管の数を定義し、三量三極内のBSA、ブランク、およびサンプルの3つの異なる濃度を考慮します。試薬Aは、使用前に十分に均質化されなければならず、25°C(RT)で2週間保存することができます。試薬Bは、琥珀色のボトルに保存した場合も25°C(RT)で安定である。 沈殿 物注:このステップはマイクロ遠心管で行われる。 5-100 μgのタンパク質を含む1 mLの最終容積に水でリポソーム上清を希釈します。注:ブランクチューブは、蒸留水の1 mLで満たされるべきです。 0.15%DOCの0.1 mLを加え、渦によって均質化し、RTで10分間インキュベートする。 72% TCA の 0.1 mL を追加し、よく混ぜ、遠心分離機を 3,000 x gと RT で 15 分間追加します。注:DOC-TCAはタンパク質沈殿を促進し、2つの異なる相を形成する。標的タンパク質は遠心分離によって回収することができ、脂質の干渉を回避する。 チューブを下方に置き、吸収性の紙の上に置くことによって、慎重に上清を廃棄します。後続のステップのペレットを保存します。注:ペレットは見えにくいかもしれませんが、目に見えない場合でもチューブを逆さまにする必要があります。 分光光度計 ステップ2.2.4から得られたペレットを1mLの蒸留水に吊り下します。ペレットが溶解していることを確認し、新しい試験管にサンプルを転送するために完全に混合します。 アルブミン(BSA)規格の希釈を最終容積1mLに調剤する。注: タンパク質規格は、5~100 μg/mLの間で調製する必要があります。 ステップ2.3.1および2.3.2からチューブに試薬Aの1 mLを例外なく加え、よく混ぜ、RTで10分間インキュベートします。注:SDSはタンパク質の可溶化を助けながら、可能な脂質の干渉を緩和することができます。 ステップ2.3.1および2.3.2からチューブに試薬Bの0.5 mLを加え、よく混ぜ、光から保護しながらRTで30分間インキュベートします。注:Follin-Ciocalteuフェノール試薬は、タンパク質などのいくつかの窒素含有化合物の着色アッセイに使用されるホスモリブデートとホスホトンステートの混合物です。銅の複雑化は、この試薬に向かってフェノールの反応性を増加させ、タンパク質濃度に応じて青/紫色の複合体を生成します。 分光光度計を使用して750nmの吸光度を決定します。 標準曲線に基づいて上清中のタンパク質濃度を以下のように算出する。 線形傾向線を考慮して角度係数(k)を得るために吸光度値(Abs)対BSA濃度(mg/mL)をプロットする。 上清タンパク質濃度(C)を吸光度値と角係数(k)の比率で決定し、次のように総体積を掛けます。 次の式に従ってカプセル化の効率を決定します。 ここで、読み込まれたタンパク質=10mg、非カプセル化タンパク質=ステップ2.3.6.2で得られたCの値。注:この場合、硫酸アンモニウム溶液に溶解した合計10mgのタリン(1mg/mL)を用いて封入手順を行い、この濃度はインビトロ効果13、16で満足のいく得られるのに十分であるので、 18. 3. サイズと安定性の決定 注:リポソーム製剤のサイズ分布およびポリ分散指数(PdI)は、動的光散乱(DLS)によって評価される。0.1 に近い PdI は、均質な調製を示します。安定性の決定のために、リポソームを4°Cで保存し、サイズ分布とサイズ平均を定期的にチェックします。 レーザーランプをウォームアップする前に、DLS機器の電源を30分オンにします。 ステップ1.10で得られたリポソーム製剤を使い捨てサイジングキュベットに移す。 装置パラメータを次のように設定します: 分散型 = 水 (RI = 1.33)。材料 = 脂質 (RI = 1.45);とRT。 [開始] を押して、機器が読み取りを終了する間待ちます。 キュベットを取り外し、機器の電源を切ります。注:後続の分析のために、キュベットから使い捨て15 mL遠心チューブにサンプルを戻すか、新しい読み取りに十分な量がある場合は廃棄してください。 4. 形態学的特徴付け 注:リポソームの特徴付けは、ムルテイとラマサミー19に従って行われます。ステップ1.10で得られたナノリポソームを含む試料は、三分三で調製される。 ガラスカバーリップ(直径13mm)を両面テープでペトリ皿の底面に固定します。テープを小さく切り(カバースリップを固定するのに適したサイズ)、下の保護紙を取り外し、ペトリ皿の底に固定します。ピンセットの助けを借りて、テープの上に保護紙を取り外し、その上にカバースリップを修正します。注: 次の手順では、カバースリップを解放せず、強力なテープを使用しないように注意してください。 カバーをポリL-リジンでコーティングします。水分を維持するためにペトリ皿の中に濡れフィルターペーパーを置き、RT(25°C)で1時間インキュベートします。 コーティング後、カバースリップを蒸留水ですすいでください。 ステップ1.10からサンプルの滴でカバーリップを充填し、RTで1時間乾燥させます。 サンプルを固定するには、0.1 Mリン酸バッファー、pH = 7.2で調製した4%グルタルアルデヒドでそれらをカバーします。ペトリ皿の中に濡れフィルターペーパーを入れ、水分レベルを維持するために皿を密封します。4°Cで48時間インキュベートします。 同じリン酸バッファーでカバースリップを3×5分間すすいで下します。 以下のようにサンプルを脱水:35%エタノール1×15分、15分間50%エタノール1x、15分間75%エタノール1x、15分間95%エタノール2x、20分間の絶対エタノール3x。 ヘキサメチルジラザン(HMDS)の1−2 mLに浸漬2xでサンプルを化学的に乾燥させます(HMDS)。注:HMDSは、ヒュームフード内で慎重に操作する必要があります。サンプルは、デシケータ内またはRTのヒュームフード内で一晩乾燥させるべきです。 乾燥したサンプルを炭素伝導粘着テープでスタブに取り付けます。 金パラジウムの電気伝導層(厚さ20nm)を有する真空中のカバースリップの表面をスパッタする。 低真空モードおよび低電圧(20 kV)で走査型電子顕微鏡(SEM)で画像を記録します。