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Bioengineering

Preparazione e caratterizzazione dei nanoliposomi per l'entratura delle proteine globulari bioattive

Published: August 31, 2019
doi:
10.3791/59900
, ,
1Chemistry Institute,Federal University of Rio de Janeiro

Summary

Questo studio descrive l’idratazione classica usando il metodo della pellicola lipidica sottile per la preparazione dei nanoliposomi seguito dalla caratterizzazione delle nanoparticelle. Una proteina clada e globulare k7 kDa-idrofilo, il tarino, è incapsulata con successo come strategia per migliorare la stabilità, evitare la clearance veloce e promuovere il rilascio controllato. Il metodo può essere adattato all’incapsulamento delle molecole idrofobiche.

Abstract

Le nanocapsule liposomiche sono state applicate per molti scopi nell’industria farmaceutica, cosmetica e alimentare. Gli attributi dei liposomi includono la loro biocompatibilità, biodegradabilità, non-immunogenicità, non tossicità e capacità di intrappolare composti idrofili e idrofobici. L’idratazione classica di pellicole lipidisottili sottili in un solvente organico viene applicata qui come tecnica per incapsulare tarina, una lectinvegetale vegetale, in nanoliposomi. Le dimensioni nanoliposomiche, la stabilità, l’efficienza dell’intrappolamento e la caratterizzazione morfologica sono descritte in dettaglio. I nanoliposomi sono preparati utilizzando 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoetanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glilycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonio; DSPE-MPEG 2000), e il colesterylhemisuccinate (CHEMS) come costituenti principali. I lipidi vengono prima disciolti nel cloroformio per ottenere una sottile pellicola lipidica che viene successivamente reidratata in soluzione di solfato di ammonio contenente la proteina da avvolgere e incubare durante la notte. Quindi, le tecniche di sonicazione ed estrusione vengono applicate per generare vesciche unilamellar nanodimensionate. L’indice di dimensioni e polidisità delle nanovessicle è determinato dalla dispersione dinamica della luce, mentre la morfologia delle nanovesicle viene valutata mediante microscopia elettronica a scansione. L’efficienza dell’aumento è determinata dal rapporto tra la quantità di proteine non incapsulate e la quantità originale di proteine caricate inizialmente. I liposomi omogenei sono ottenuti con una dimensione media di 155 nm e un valore di indice di polidisità pari a 0,168. Si ottiene un’elevata efficienza di intrappolamento dell’83%.

Introduction

Il numero di studi che studiano sistemi di somministrazione di farmaci efficienti è aumentato negli ultimi anni. Tuttavia, limitazioni come lo sgombero rapido, la scarsa biodistribuzione e la solubilità del pH fisiologico e l’insufficiente assorbimento cellulare devono ancora essere superate. L’uso di nanosistemi è emerso come recenti progressi nelle terapie contro il cancro, applicati per aumentare la concentrazione intracellulare di farmaci all’interno delle cellule cancerose riducendo al minimo la tossicità nelle cellule sane. Inoltre, le nanoparticelle ottenute da una diversa gamma di materiali (ad esempio, polimeri, dendrimer, liposomi, virus, nanotubi di carbonio e metalli come l’ossido di ferro e l’oro) sono attualmente applicate per migliorare gli effetti anticancro e ridurre tossicità1. Le nanocapsule liposomiche, in particolare, sono state applicate per molti scopi nell’industria farmaceutica, cosmetica e alimentare. Negli ultimi anni, vari prodotti nutraceutici come vitamine, enzimi ed estrattidi erbe sono stati formulati utilizzando la tecnologia liposoma2 .

I liposomi sono vescicole sferiche costituite da uno o più bistrati lipidici concentrici formati spontaneamente dalla dispersione di fosfatidi nei media acquosi3,4. Le teste polari dei fosfolipidi si trovano sulle superfici esterne ed interne delle membrane, a contatto con l’ambiente acquoso. Al contrario, le catene di acidi grassi formano il nucleo idrofobico delle membrane e sono protette dall’acqua5 . Alcuni attributi dei liposomi che li rendono attraenti sistemi di somministrazione di farmaci includono la loro biocompatibilità, biodegradabilità, non-immunogenicità, non-tossicità, e la capacità di intrappolare sia composti idrofili che idrofobici6.

I liposomi possono essere preparati utilizzando vari processi come agitazione, sonicazione, estrusione, liofilizzazione, congelamento e scongelamento. I metodi classici includono evaporazione in fase inversa, iniezione di solventi e dialisi detergente. Il metodo più applicato è l’idratazione sottile della pellicola lipidica, noto anche come metodo di Bangham, che viene utilizzato per ottenere forme vescicolari-lipidiche7,8,9,10,11. Lamellarità (il numero di bistrati fosfatidi) e la dimensione delle particelle sono parametri classici utilizzati per caratterizzare i liposomi come 1) vescicle unilamellar (ULV), formate da un unico bistrato fosfolipido e di dimensioni variabili come segue: i) piccoli unilamellar vescicanze (SUV, 0,02-0,20 m), ii) grandi vescicle unilamellar (LUN, 0,2-1,0 m) vesciche unilamellar giganti (GUV, >1 m); o 2) vesciche multilamellar (MLV, >0,1 m)3,12. Le dimensioni della vescica sono un parametro importante quando si considera per uso terapeutico, come nel trattamento del cancro, in cui le dimensioni di <200 nm sono ideali per consentire ai nanoveli di attraversare la barriera endoteliale e raggiungere i tessuti tumorali4.

Qui, la procedura di incapsulamento dopo l’idratazione classica di una tecnica di pellicola lipidica sottile7 è stata descritta utilizzando tarina, una lectinvegetale caratterizzata come una proteina globulare idrofila13,14,15 . Le vesciche nanodimensionate sono prodotte includendo passaggi di sonicazione ed estrusione nella tecnica principale, con conseguente nanovesicolo liposomico stabile con elevata efficienza di intrappolamento16.

Protocol

1. Preparazione di nanocapsule liposomiche tarin16 NOTA: Tutti i preparati devono essere preparati in triplice copia per ottenere un volume maggiore (7 mL) e consentire la centrifuga del campione in un’ultracentrica (vedere i dettagli di seguito). Pesare i componenti liposomi utilizzando un saldo analitico, come mostrato nella Tabella 1. Sciogliere i componenti lipidici nel cloroformio utilizzando un flacone volumetrico da 250 ml che si inserisce in un evaporatore rotante per evitare la perdita di materiale. Mescolare il composto a 150 rpm per 15 min. Rimuovere il cloroformio utilizzando un evaporatore rotante nelle seguenti condizioni: Regolare la bocca volumetrica del flacone alla posizione standard (25 gradi) per un’efficienza ottimale, mentre a contatto con l’acqua del bagno di riscaldamento.NOTA: Il braccio dell’apparecchiatura deve essere inclinato a 25 gradi per mantenere il contatto tra il pallone volumetrico e il bagno d’acqua, senza influire sull’efficienza dell’evaporazione o danneggiare il campione. La posizione standard può variare a seconda del marchio dell’apparecchiatura. Impostare la temperatura del condensatore ad un minimo di 3 gradi centigradi. Impostare la temperatura del bagno di riscaldamento a 40 x 1 gradi centigradi. Impostare la rotazione su 120 giri/min. Regolare il vuoto a 207 mbar e punto di ebollizione a 20 gradi centigradi. Dopo 25 minuti, rimuovere il pallone e scartare il solvente evaporato, rimanendo nel condensatore, in modo appropriato.NOTA: Una pellicola sottile e opaca, costituita dai componenti liposomici, è formata in questo passaggio e può essere facilmente visualizzata. Il solvente evaporato rimasto nel condensatore deve essere immagazzinato nei destinatari di smaltimento (clorato) per essere maneggiato da una società specializzata per un’adeguata rigetto. Idratare la pellicola lipidica per raggiungere una concentrazione di 0,01 M di lipidi in una soluzione di solfato di ammonio da 0,3 M (pH – 7,4) contenente tarina a 1 mg/mL fino a un volume finale di 10 mL. Mescolare il composto per 40 min e incubare per una notte a 4 gradi centigradi.NOTA: questo passaggio può essere considerato un punto di arresto. L’incubazione notturna non è obbligatoria. Dopo l’incubazione, sonicare la sospensione per 1 min a 25 gradi centigradi (temperatura ambiente; RT) per ridurre le dimensioni della vescica ed evitare l’aggregazione.NOTA: la riduzione delle dimensioni è stata eseguita in un sonicatore ad ultrasuoni nelle seguenti condizioni: 130 W e 40 kHz. Eseguire un’estrusione di 12 cicli attraverso una membrana di pori di policarbonato di 0,2 m.NOTA: prima del processo di estrusione, testare l’assieme del mini-estrusore utilizzando l’acqua per evitare perdite di campioni. È inoltre adatta una membrana di pori di 0,1 m. In questo caso, preriscaldare il mini-estrusore sopra la temperatura di transizione lipidica per facilitare l’estrusione, pur mantenendo le caratteristiche fisico dei lipidi e delle proteine. Montare le parti del mini estrusore, come descritto nel manuale del produttore. Posizionare la membrana in policarbonato tra due supporti filtro pre-bagnato e posizionarla nel supporto. Inserire una siringa vuota da 1 mL nel dispositivo, riempire l’altra siringa al suo volume totale con le sospensioni liposomiche e inserirla sul lato opposto. Eseguire un’estrusione di 12 cicli attraverso una membrana di pori di policarbonato di 0,2 m. Spingere il campione da una siringa all’altra, lentamente. Raccogliere la sospensione estruso in un tubo pre-raffreddato.NOTA: La membrana in policarbonato deve essere sostituita solo quando il trasferimento del campione da una siringa all’altra diventa difficile. La sospensione liposomica dovrebbe diventare chiara durante il processo di estrusione a causa della riduzione delle dimensioni a causa della formazione di SUV. Circa 0,2 mL del campione può andare perso durante questo passaggio. Liposomi separati dall’ultracentrifugazione.NOTA: Mantenere i campioni in un bagno di ghiaccio fino a quando l’ultracentrifuga è pronta per essere utilizzata. Separare i SUV dai restanti componenti e dal solfato di ammonio con ultracentrifuga utilizzando un’ultracentrifuga con un rotore a benna (vedi i dettagli di seguito). Pesare il campione nel tubo di titanio che si adatta al rotore e bilanciare i tubi. Controllare il volume minimo richiesto in base al rotore utilizzato per evitare di danneggiare i tubi e regolare il volume delle sospensioni liposomiche con solfato di ammonio, se necessario.NOTA: Il secchio a battente deve sempre essere supportato sul supporto quando si è fuori dalla centrifuga per evitare di graffiare le “strisce zebrate” (cioè le strisce bianche e nere sul fondo), che vengono utilizzate dalla centrifuga per determinare la velocità di rotazione. Accendere il vuoto prima di utilizzare la centrifuga per consentirne la refrigerazione. Inserire i tubi in titanio nel secchio a battente.NOTA: Sollevare i tubi nella posizione che assumono durante la corsa per assicurarsi che siano perfettamente montati. Rilasciare il vuoto, aprire la porta della centrifuga e posizionare il rotore all’interno.NOTA: Prestare attenzione al segno del cerchio sul fondo del rotore, che deve adattarsi nella direzione opposta dello stesso segno di cerchio nella centrifuga stessa. Chiudere lo sportello della centrifuga, premere Vuoto e attendere che il vuoto raggiunga da 200 a <20 micron o da 26 Pa a <3 Pa. Regolare i parametri nel display a ultracentrifuga a 150.000 x g (l’equivalente di 29.600 giri/mper per il suddetto secchio a battente) per 90 min a 4 gradi centigradi (accelerazione: max, decelerazione: max).NOTA: Convertire sempre la velocità in x g se la centrifuga specifica è impostata in rpm. Utilizzare il sito web della centrifuga per convertire l’unità in base al rotore utilizzato. Premere Richiamo, controllare le condizioni e premere Avvia per eseguire.NOTA: Attendere che la centrifuga raggiunga la velocità desiderata. Dopo 90 min, rilasciare il vuoto premendo il pulsante Vuoto e aprire la porta della centrifuga quando il vuoto raggiunge i 200-700 micron (equivalente a 26-93 Pa). Spegnere la centrifuga, rimuovere il rotore dall’interno e lasciarlo sulla panca con i secchi per asciugare. Mantenere i campioni ultracentrici sul ghiaccio. Con attenzione, separare il supernatante dal pellet capovolgendo il tubo in un tubo di centrifuga di 15 mL usa e getta per separare il supernatante e il pellet.NOTA: Conservare il supernatante contenente la proteina non incapsulata a 4 gradi centigradi. Verrà utilizzato per determinare l’efficienza di incapsulamento. Il pellet appare come una gelatina traslucida. Sospendere il pellet contenente la proteina incapsulata nella salina tamponata HEPES (3 mL di 1x HBS).NOTA: l’HBS 2x (soluzione stock) viene preparata diluindo le seguenti quantità di reagenti in acqua distillata: 140 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 m HEPES, quindi regolando il pH a 7,4 e il volume finale a 100 mL. Na2HPO4 può essere sostituito da NaHCO3o omesso per evitare interferenze se si vuole determinare la concentrazione liposomale. La soluzione di stock HBS 2x deve essere diluita in acqua distillata per ottenere HBS 1x prima dell’uso. 2. Efficienza di incapsulamento NOTA: Determinare l’efficienza di incapsulamento utilizzando il protocollo17di Peterson per evitare interferenze lipidiche nella quantificazione delle proteine. Tutti i campioni (standard BSA e liposomasuper supernatant) devono essere analizzati in triplice copia. Preparare anche un tubo vuoto. Preparazione di reagenti e soluzioni di lavoro17 Per i reagenti di riserva, preparare il carbonato di rame-tartrate (CTC) mescolando 10 mL di carbonato di sodio del 20%, 200 L dello 0,1% di solfato di rame, 200 – L dello 0,2% di crostata di potassio con 9,6 mL di acqua distillata. Preparare 100 mL di solfato dodecyl di sodio (SDS) e 0,8 N di idrossido di sodio (NaOH). Per le soluzioni di lavoro, preparare 10 mL di 0,15% deossicolato di sodio (DOC) e 72% acido tricloroacetico (TCA). Sciogliere 10 mg di albumina siero bovina (BSA) in 10 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione standard da 1 mg/mL. Preparare il reagente A aggiungendo parti uguali di CTC, NaOH, SDS e H2O. Preparare il reagente B diluendo il reagente del fenolo Folin-Ciocalteu 1:5 in acqua distillata.NOTA: il reagente A richiede 1 mL per ogni tubo di reazione, mentre il reagente B richiede 0,5 mL. Per determinare i volumi finali dei reagenti A e B, definire innanzitutto il numero di tubi di reazione da utilizzare, considerando tre concentrazioni distinte di BSA, vuoto e campioni in triplice copia. Il reagente A deve essere ben omogeneizzato prima dell’uso e può essere conservato a 25 gradi centigradi (RT) per 2 settimane. Anche il reagente B è stabile a 25 gradi centigradi (RT) se conservato in una bottiglia d’ambra. PrecipitazioniNOTA: Questo passaggio viene eseguito in tubi di microcentrismo. Diluire il liposomaso supernatante con acqua fino a un volume finale di 1 mL contenente 5-100 g di proteine.NOTA: Il tubo vuoto deve essere riempito con 1 mL di acqua distillata. Aggiungere 0,1 mL di 0,15% DOC, omogeneizzare vortice e incubare per 10 min a RT. Aggiungere 0,1 mL di 72% TCA, mescolare bene, e centrifugare a 3.000 x g e RT per 15 min.NOTA: DOC-TCA promuove la precipitazione proteica, formando due fasi distinte. La proteina bersaglio può essere recuperata con la centrifugazione, evitando interferenze lipidiche. Scartare con attenzione il supernatante tracciando il tubo verso il basso e posandolo su una carta assorbente. Salvare il pellet per il passaggio successivo.NOTA: Il pellet può essere molto difficile da vedere, ma il tubo deve essere capovolto anche se non è visibile. Spettrofotometria Sospendere il pellet ottenuto dal punto 2.2.4 in 1 mL di acqua distillata. Mescolare accuratamente per assicurarsi che il pellet sia sciolto e trasferire il campione in una nuova provetta. Preparare le diluizioni degli standard di albumina (BSA) ad un volume finale di 1 mL.NOTA: Gli standard proteici devono essere predisposti tra 5-100 g/mL. Aggiungere 1 mL di reagente A ai tubi dai tubi di passo 2.3.1 e 2.3.2 senza eccezione, mescolare bene e incubare per 10 min a RT.NOTA: SDS può alleviare possibili interferenze lipidiche, aiutando nel contempo nella solubilità delle proteine. Aggiungere 0,5 mL di reagente B ai tubi dai gradi 2.3.1 e 2.3.2, mescolare bene e incubare per 30 min a RT mentre protetto dalla luce.NOTA: Il reagente fenolo Follin-Ciocalteu è una miscela di fosfomolybdate e fosfoungstate utilizzati per i saggi colorimetrici di alcuni composti contenenti azoto, come le proteine. La complessità del rame aumenta la reattività dei fenoli verso questo reagente, producendo un complesso blu/viola in base alla concentrazione proteica. Determinare le assorbenze a 750 nm utilizzando uno spettrometro. Calcolare la concentrazione proteica nel supernatante in base alla curva standard come segue. Valore di assorbimento della trama (Abs) rispetto alla concentrazione di BSA (mg/mL) per ottenere il coefficiente angolare (k) considerando una linea di tendenza lineare. Determinare la concentrazione di proteine supernatali (C) in base al rapporto tra il valore di assorbimento e il coefficiente angolare (k), quindi moltiplicare per il volume totale come segue: Determinare l’efficienza di incapsulamento in base alla formula seguente:Determine encapsulation efficiency according to the following formula: dove la proteina caricata è 10 mg, la proteina non incapsulata, il valore di C ottenuto al passo 2.3.6.2.NOTA: In questo caso, un totale di 10 mg tarina disciolto in soluzione solfato di ammonio (1 mg/mL) viene utilizzato per eseguire la procedura di incapsulamento, poiché questa concentrazione è sufficiente per ottenere effetti in vitro soddisfacenti13,16, 18. 3. Determinazione delle dimensioni e della stabilità NOTA: la distribuzione delle dimensioni e l’indice di polidispersità (PdI) dei preparati liposomici sono valutati dalla diffusione dinamica della luce (DLS). Un PdI vicino a 0,1 indica una preparazione omogenea. Per la determinazione della stabilità, conservare i liposomi a 4 gradi centigradi e controllare regolarmente la distribuzione delle dimensioni e la media delle dimensioni. Accendere l’apparecchiatura DLS 30 min prima dell’uso per riscaldare la lampada laser. Trasferire la preparazione liposomica ottenuta al punto 1.10 in una cuvette di dimensionamento usa e getta. Impostare i parametri dell’apparecchiatura come segue: tipo di dispersione – acqua (RI – 1,33); materiale e lipidi (RI – 1,45); e RT. Premere Start e attendere che l’apparecchiatura termini la lettura. Rimuovere la cuvette e spegnere l’apparecchiatura.NOTA: Trasferire il campione dalla cuvette al tubo di centrifuga remunerale monouso da 15 mL per le analisi successive, oppure scartarlo se c’è una quantità sufficiente per le nuove letture. 4. Caratterizzazione morfologica NOTA: la caratterizzazione liposomica viene eseguita secondo Murtey e Ramasamy19. I campioni contenenti nanoliposomi ottenuti al punto 1.10 vengono preparati in triplice copia. Fissare i copricapi in vetro (13 mm di diametro) nella parte inferiore di un piatto Petri con nastro a due lati. Tagliare il nastro a pezzetti (dimensioni appropriate per fissare i copricopro), rimuovere la carta protettiva sottostante e fissarlo sul fondo della parabola Petri. Con l’aiuto di pinzette, rimuovere la carta protettiva sulla parte superiore del nastro e fissare i copricopertine su di esso.NOTA: Fare attenzione nei passaggi seguenti per non rilasciare i copricopertine e utilizzare un nastro forte. Rivestire i copricapi con poli-L-lisina. Collocare le carte da filtro bagnate all’interno della piastra Petri per mantenere l’umidità e incubare per 1 h a RT (25 gradi centigradi). Dopo il rivestimento, sciacquare le coperture con acqua distillata. Riempire i copricopertine con una goccia del campione dal punto 1.10 e lasciarli asciugare per 1 h a RT. Per fissare i campioni, coprirli con il 4% di glutaraldeide preparato in buffer di fosfato da 0,1 M, pH – 7,2. Posizionare le carte filtro bagnate all’interno della piastra Petri e sigillare il piatto per mantenere i livelli di umidità. Incubare a 4 gradi centigradi per 48 ore. Risciacquare le coverlips 3x per 5 min con lo stesso buffer di fosfato. Campioni disidratati come segue: 35% etanolo 1x per 15 min, 50% etanolo 1x per 15 min, 75% etanolo 1x per 15 min, 95% etanolo 2x per 15 min, elondico assoluto 3x per 20 min. Asciugare chimicamente i campioni mediante immersione 2x in 1/2 mL di hexamethyldisilazane (HMDS) per 10 min.NOTA: l’HMDS deve essere manipolato con attenzione all’interno di un cappuccio di fumi. I campioni devono essere lasciati asciugare durante la notte all’interno di un desiccatore o all’interno del cofano del fume a RT. Montare i campioni secchi su uno stub con un nastro adesivo conduttivo in carbonio. Sputter la superficie della coverslip in un vuoto con uno strato elettricamente conduttivo (20 nm spessore) di palladio oro- Registrare le immagini con un microscopio elettronico a scansione (SEM) a bassa modalità a vuoto e bassa tensione (20 kV).

Representative Results

Figura 1 descrive la preparazione nanolipososo16,20,21. Fosfolipidi, 1,2-dioleoil-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene gly)-2000] (ammonisò sale) -2000) (ammoniaco saleum; DSPE-MPEG 2000), e cholesterylhemisuccinate (CHEMS), i principali costituenti liposomi, sono stati prima sciolti nel cloroformio per ottenere la pellicola lipidica. La pellicola lipidica è stata poi reidratata in soluzione di solfato di ammonio contenente la proteina idrofila (tarina) da intrappolare, e l’incubazione è stata eseguita durante la notte. Poi, sono state applicate tecniche di sonicazione ed estrusione per generare piccole vesciche di unilamellar. La fase di ultracentrifuga separava la preparazione liposomica dai lipidi liberi e dalle proteine non incapsulate, mentre il sovrinnante veniva utilizzato per determinare l’efficienza dell’intrappolamento. I nanoliposomi prodotti utilizzando la metodologia di cui sopra presentavano una distribuzione delle dimensioni che andava da 51:396 nm e una dimensione media di 155 nm (tabella2). La preparazione è stata omogenea, poiché l’indice di polidispersità era 0,168. Un’elevata efficienza di intrappolamento dell’83% può essere raggiunta se i liposomi vengono estrusi attraverso una membrana di dimensioni dei pori di 0,2 m (Tabella 2). Le caratteristiche del nanolipososoma morfologico sono state valutate dalla SEM. Figura2,B mostra vesciche liposomiche a forma rotonda nell’intervallo di 121 nm e analizzate a 20 kV, mentre la figura 2C,D mostra display non adeguatamente preparati Campioni. I nanoliposomi sono stati semplicemente essiccati all’aria senza fissazione precedente o qualsiasi altro trattamento descritto in questo studio. Di conseguenza, sono state osservate vesciche più grandi e danneggiate nell’intervallo di 332 m e analizzate a 5 kV. Figura 1: Rappresentazione schematica della preparazione del nanoliposoma. DOPE, PEG e CHEMS, i principali costituenti liposomici, sono stati prima dissolti nel cloroformio per ottenere la pellicola lipidica (1, 2, 3). La pellicola lipidica è stata poi reidratata in un tampone salino contenente la proteina idrofila (tarina) da intrappolare, e l’incubazione è stata eseguita durante la notte (4). Quindi, sono state applicate tecniche di sonicazione ed estrusione per generare SUV (5, 6). Il passo dell’ultracentrifuga separava la preparazione liposomica dai lipidi liberi e dalle proteine non incapsulate, mentre il sovrinnante veniva utilizzato per la determinazione dell’efficienza di intrappolamento (7). Questa cifra è stata modificata da Correa etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Fotomicroscopia nanoliposomica di SEM. (A,B) Immagini di vesciche liposomiche rotonde nell’intervallo di 121 nm e analizzate a 20 kV. (C,D) Immagini di campioni non adeguatamente preparati. Campioni maltrattati hanno permesso l’osservazione di vesciche più grandi e/o danneggiate, che non possono resistere al vuoto e/o alle condizioni di tensione a 5 kV. Questa cifra è stata modificata da Correa etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Componenti Lipososome Peso (g) Concentrazione (mM) Volume finale informazioni fpl 0.0420 5.7 10 mL MPEG 2000-DSPE 0.1059 3.8 Chems 0.0024 0.5 DOPE – 1,2-dioleoyl-sn-glicerol-3-phosphoetanolamine); MPEG 2000-DSPE – 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polietilene glicole)-2000] (sale di ammonio); CHEMS – cholesterylhemisuccinate. Tabella 1: Preparazione di nanocapsule liposomiche tarin. Dimensione dei pori della membrana Distribuzione delle dimensioni (nm) Dimensioni medie (nm) Indice Polydispersity (PdI) Picco (nm) Efficienza dell’intrappolamento 0.2 51 – 396 155 0. 168 94 X 39 0.83 L’indice di dimensioni e polidisità è stato valutato mediante dispersione dinamica della luce, mentre l’efficienza di incapsulamento è stata determinata secondo Peterson17. Tabella 2: Dimensioni, indice di polidispersità e efficienza di intrappolamento della preparazione nanoliposoma.

Discussion

Il protocollo qui descritto è stato testato da Correa et al.16 per incapsulare tarin, una lectina immunomodulatore e antitumorale purificata da Colocasi esculenta22. La metodologia ha dato risultati di successo, consentendo la produzione di nanoliposomi stabili di dimensioni appropriate per applicazioni terapeutiche. La formulazione presenta il rilascio controllato a diversi livelli di pH in condizioni fisiologiche. Potenzia anche le proprietà farmacologiche tarin, come l’inibizione del glioblastoma umano U-87 MG e il cancro al seno MDA-MB-231 linee cellulari e la stimolazione delle cellule del midollo osseo dei topi. La preparazione liposomica non ha mostrato effetti tossici nelle cellule di topi sani16.

Il metodo classico, descritto per la prima volta da Bangham et al.7, consente la produzione di grandi vesciche liposome multilamellari, eterogenee per dimensioni e forma. Gli adattamenti di questo metodo, come riportato nel presente studio, sono applicati con successo includendo ulteriori passaggi come la sonicazione e l’estrusione attraverso una membrana policarbonata di 0,2 m. Ciò consente la produzione di una dispersione più omogenea per quanto riguarda le dimensioni nell’intervallo nanometrico16,23,24. Pertanto, per garantire risultati positivi, il protocollo di incapsulamento e la formulazione liposomica qui descritti dovrebbero essere rigorosamente seguiti.

La composizione nanolipososomiana è stata accuratamente selezionata al fine di garantire la formazione di una membrana bistrato con DOPE, MPEG 2000-DSPE e CHEMS come costituenti principali. Si tratta di costituenti del bistrato naturale della membrana animale e questi ultimi possono conferire fluidità all’architettura nanoliposomica, garantendo un’ampia applicazione per la somministrazione di composti bioattivi negli esseri umani.

La pegilazione nanoliposoma è essenziale per garantire la stabilità della struttura liposoma. L’assenza di PEG porta all’allargamento delle dimensioni, a un elevato indice di polidispersità e a una bassa efficienza di intrappolamento. Risultati ottimali possono essere ottenuti con DOPE come componente principale del liposoma. Tuttavia, questo è un fosfolipido ad alto costo. I costi finanziari della produzione di nanoliposomi possono essere conseguiti sostituendo DOPE con altri lipidi simili come DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). CHEMS è una molecola di colesterolo che si trova naturalmente nelle membrane cellulari animali, che non dovrebbe essere esclusa dalla formulazione, poiché è importante garantire la fluidità e la malleabilità del bistrato lipidico16.

Altri aspetti del protocollo di incapsulamento possono anche essere adattati. Il cloroformio utilizzato per sciogliere i componenti liposomici può essere facilmente sostituito da metanolo senza effetti sulla media delle dimensioni, sull’omogeneità e sull’efficienza dell’intrappolamento. Tuttavia, alcune perdite di proteine possono verificarsi al momento di stoccaggio sotto i 4 gradi centigradi. La fase di incubazione notturna con soluzione solfato di ammonio contenente tarin non è obbligatoria; tuttavia, per comodità può essere eseguito senza danneggiare le caratteristiche biofisiche nanoliposomiche, l’incapsulamento o le perdite di efficienza di stabilità, come dimostrato da Correa et al.16. La fase di estrusione viene eseguita a temperatura ambiente, che può diminuire la portata tra le siringhe se viene utilizzata una membrana di dimensioni dei pori di 0,1 m.

Per ovviare a questo problema, si deve considerare l’uso di una membrana di dimensioni dei pori di 0,2 m o il riscaldamento del supporto estrusore sopra la temperatura di transizione dei lipidi. L’analista deve fare attenzione a non danneggiare i lipidi o le proteine che possono essere inattivate e perdere attività biologica. In alternativa, la preparazione liposomica può essere dialzata contro l’HBS invece dell’ultracentrifuga, utilizzando una membrana cut-off in base al peso molecolare delle proteine. La scelta della natura chimica del tampone in cui i nanoliposomi sono sospesi dopo l’ultracentrifugaè è direttamente correlata alla sua successiva applicazione. Poiché le prospettive di questo studio includono analisi in vivo e in vitro, la sospensione nella salina tamponata HEPES era adeguata a non garantire effetti citotossici e una gamma di pH vicina a condizioni fisiologiche.

I liposomi devono essere trattati finemente, simili alle cellule viventi, per ottenere immagini SEM di qualità superiore. Le procedure di fissaggio e essiccazione sono importanti per garantire la visualizzazione di vesciche più piccole e intatte che supportano valori superiori a 20 kV in condizioni di vuoto. Figura 2 A,B mostra vesciche nanodimensionate compatibili con la procedura di estrusione. La visualizzazione di vesciche che vanno da 51 a 396 nm è possibile se viene eseguita un’adeguata preparazione del campione seguendo questa procedura. I passaggi includono fissaggio, essiccazione aumentando le concentrazioni di etanolo e disidratazione chimica per evitare la formazione di aggregati e vesciche rotte causate dal vuoto e dal fascio di elettroni. D’altra parte, la figura 2C,D mostra vesciche liposose essiccate a temperatura ambiente e non sottoposte ad alcun trattamento qui descritto, il che significa che sono state preparate in modo inadeguato. Come risultato della procedura inadeguata, si formano vesciche giganti, anche dopo l’estrusione attraverso una membrana di dimensioni dei pori di 0,2 m. Le vesciche rotti sono osservate anche in entrambi i pannelli a causa del vuoto e del fascio di elettroni.

Le vesciche nanoliposome sono state esplorate come un sistema di incapsulamento e di somministrazione per molecole idrofobiche, tra cui il resveratrolo (3,5,4′-triidrossistilbene), un composto bioattivo contro le cellule tumorali del colon-retto. La procedura di incapsulamento può superare la scarsa solubilità dei composti lipofili oltre a fornire biocompatibilità, biodegradabilità, non immunogenicità e caratteristiche non-tossicizza inerenti alle nanocapsule liposomiche25. Gli adattamenti del protocollo devono essere presi in considerazione a seconda del percorso e dello scopo di amministrazione, come lo sviluppo di nuove formulazioni liposomiche per l’amministrazione orale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati alle strutture COPPE/UFRJ, Electronic Microscopy Laboratory e Multiuser Materials Characterization Laboratory; al Dr. Adalberto Vieyra, alla Dott.ssa Jennifer Lowe e a Rafael Lindoso, professori dell’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasile, per l’uso dell’ultracentrifuga; al Dr. Alexandre Guedes Torres e Daniel Perrone, professori presso l’Università Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasile, per l’uso dell’evaporatore rotativo; al professor Roland Bodmeier e al Dr. Andriy Dashevskiy della Freie Universitat di Berlino, che hanno fornito risorse, fornito nuove metodologie e supervisionato l’ACNTF durante una borsa di studio Erasmus di 6 mesi in Germania; al Dr. Rossana Thiré e Aline Fernandes, professore e tecnico presso l’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasile, per l’uso di Malvern; a Bluma Guenther e Taissa Rodrigues, professoressa e legratrice presso l’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasile, per l’uso del SEM; alla Dott.ssa Rachel Ann Hauser Davis, ricercatrice presso la Nio Oswaldo Cruz, per la narrazione. Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de N’vel Superior, Brasil (CAPES) – Codice finanziario 001 (concessione n. 1627392; 1811605); di Fondo Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (grant No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 e E-26/202.860/2016); di Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient’fico e Tecnol’gico (CNPq) (concessione n. 406601/2018-6), e Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).

Materials

Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich Co A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw Mettler Inc. 417870
Beckman DU-640 Spectrophotometer Beckman Coulter 8043-30-1090
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich Co 5470
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump Thermo Fischer Scientific 05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) Sigma-Aldrich Co C6512
Chloroform Sigma-Aldrich Co 48520-U CAUTION
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) Sigma-Aldrich Co 209198
Coverslips (13mm diameter) Thermo Scientific Nunc EW-01839-00
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) Lipoid GMBH 565600.1
Ethanol Absolute Sigma-Aldrich Co 32205
Folin -Ciocalteu phenol reagent Sigma-Aldrich Co F9252
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich Co G5882
HEPES Sigma-Aldrich Co H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich Co 440191 CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope JEOL LTD
Mini Extruder 7 Avanti Polar Lipids 610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Lipoid GMBH 588200.1
Optima L-90k Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
Phosphate Buffer Sigma-Aldrich Co P3619
Poli-L-lysine Sigma-Aldrich Co P8920
Potassium L-tartrate monobasic Sigma-Aldrich Co 243531
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich Co S7795
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co S7653
Sodium Deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich Co D6750
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich Co L3771
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich Co S8045
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich Co RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope Tescan #657874
Trichloroacetic Acid (TCA) Sigma-Aldrich Co 91230
Zetasizer Nano ZSP Malvern Panalytical LTD
Ultrasonic cleaning bath model 2510 Branson
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Corrêa, A. C. N. T. F., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59900, doi:10.3791/59900 (2019).
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