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Bioengineering

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Published: August 31, 2019
doi:
10.3791/59900
, ,
1Chemistry Institute,Federal University of Rio de Janeiro

Summary

Diese Studie beschreibt die klassische Hydratation mit der Dünnschichtmethode zur Nanoliposomenpräparation, gefolgt von der Nanopartikelcharakterisierung. Ein 47 kDa-hydrophiles und kugelförmiges Protein, Tarin, wird erfolgreich als Strategie zur Verbesserung der Stabilität verkapselt, schnelle Clearance vermieden und eine kontrollierte Freisetzung gefördert. Die Methode kann an hydrophobe Moleküle angepasst werden.

Abstract

Liposome Nanokapseln wurden für viele Zwecke in der pharmazeutischen, kosmetischen und Lebensmittelindustrie eingesetzt. Zu den Attributen von Liposomen gehören ihre Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit, Nicht-Immunogenität, Nichttoxizität und die Fähigkeit, sowohl hydrophile als auch hydrophobe Verbindungen einzufangen. Die klassische Hydratation von dünnen Lipidfilmen in einem organischen Lösungsmittel wird hierin als Technik zum Verkapseln von Tarin, einem pflanzlichen Lektin, in Nanoliposomen angewendet. Nanoliposome Größe, Stabilität, Einschlusseffizienz und morphologische Charakterisierung werden ausführlich beschrieben. Die Nanoliposomen werden mit 1,2-Dioleoyl-Sn-Glycerol-3-Phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Amino(Polyethylenglycol)-2000] (Ammoniumsalz; DSPE-MPEG 2000) und Cholesterylhemuccinate (CHEMS) als Hauptbestandteile. Lipide werden zunächst in Chloroform gelöst, um einen dünnen Lipidfilm zu erhalten, der anschließend in Ammoniumsulfatlösung rehydriert wird und das Protein enthält, das über Nacht eingeschlossen und inkubiert werden soll. Anschließend werden Beschallungs- und Extrusionstechniken angewendet, um nanogroße unilamellare Vesikel zu erzeugen. Die Größe und der Polydispersitätsindex der Nanovesiken werden durch dynamische Lichtstreuung bestimmt, während die Nanovesikle-Morphologie durch Rasterelektronenmikroskopie beurteilt wird. Die Einschließungseffizienz wird durch das Verhältnis der Menge an nicht verkapseltem Protein zur ursprünglichen Menge des ursprünglich geladenen Proteins bestimmt. Homogene Liposomen werden mit einer durchschnittlichen Größe von 155 nm und einem Polydispersitätsindexwert von 0,168 erhalten. Eine hohe Einschließungseffizienz von 83% wird erreicht.

Introduction

Die Zahl der Studien zur Untersuchung effizienter Arzneimittelabgabesysteme ist in den letzten Jahren gestiegen. Allerdings müssen Einschränkungen wie schnelle Clearance, schlechte Bioverteilung und Löslichkeit beim physiologischen pH-Wert und unzureichende zelluläre Aufnahme noch übertroffen werden. Der Einsatz von Nanosystemen hat sich als jüngster Fortschritt in der Krebstherapeutika herausgestellt, die angewendet wird, um die intrazelluläre Konzentration von Medikamenten in Krebszellen zu erhöhen und gleichzeitig die Toxizität in gesunden Zellen zu minimieren. Darüber hinaus werden Nanopartikel, die aus einer Vielzahl von Materialien (z. B. Polymere, Dendrimer, Liposomen, Viren, Kohlenstoffnanoröhren und Metalle wie Eisenoxid und Gold) gewonnen werden, derzeit eingesetzt, um die Krebsbekämpfung zu verstärken und die systemische Wirkung zu reduzieren. Toxizität1. Insbesondere Liposomen-Nanokapseln wurden für viele Zwecke in der Pharma-, Kosmetik- und Lebensmittelindustrie eingesetzt. In den letzten Jahren wurden verschiedene nutraceutical Produkte wie Vitamine, Enzyme und Kräuterextrakte mit Liposomentechnologieformuliert 2.

Liposomen sind kugelförmige Vesikel, die aus einem oder mehreren konzentrischen Lipid-Doppelschichten bestehen, die spontan durch die Dispersion von Phospholipiden in wässrigen Medien3,4gebildet werden. Die Polarköpfe der Phospholipide befinden sich auf den äußeren und inneren Oberflächen der Membranen, in Kontakt mit der wässrigen Umgebung. Im Gegensatz dazu bilden Fettsäureketten den hydrophoben Kern der Membranen und sind vor Wasser geschützt5. Einige Attribute von Liposomen, die sie attraktiv machen Arzneimittelabgabesysteme gehören ihre Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit, Nicht-Immunogenität, Nicht-Toxizität, und die Fähigkeit, sowohl hydrophile als auch hydrophobe Verbindungen zu fangen6.

Liposomen können mit verschiedenen Prozessen wie Rührung, Beschallung, Extrusion, Lyophilisierung, Einfrieren und Auftauen hergestellt werden. Zu den klassischen Methoden gehören die Rückphasenverdampfung, die Lösungsmittelinjektion und die Waschmitteldialyse. Die am häufigsten angewandte Methode ist die dünnste Lipidfilmhydratation, auch bekannt als Bangham-Methode, die verwendet wird, um vesikuläre Lipidformen7,8,9,10,11zu erhalten. Lamellarität (Anzahl der Phospholipid-Doppelschichten) und Partikelgröße sind klassische Parameter, die verwendet werden, um Liposomen entweder als 1) unilamellare Vesikel (ULVs) zu charakterisieren, die durch eine einzigartige Phospholipid-Bilayer gebildet werden und in der Größe variieren: i) kleiner Unilamellen Vesikel (SUVs, 0,02-0,20 m), ii) große unilamellare Vesikel (LUVs, 0,2-1,0 m) und iii) riesige unilamellare Vesikel (GUVs, >1 m); oder 2) Multilamellar-Vesikel (MLVs, >0,1 m)3,12. Vesikelgröße ist ein wichtiger Parameter bei der therapeutischen Anwendung, z. B. bei der Krebsbehandlung, bei der Größen von <200 nm ideal sind, um Nanovesiken zu ermöglichen, die Endothelbarriere zu überschreiten und Tumorgewebe zu erreichen4.

Dabei wurde das Verkapselungsverfahren nach der klassischen Hydratation einer dünnen Lipidfilmtechnik7 mit Tarin beschrieben, einem Pflanzenlektin, das als hydrophiles Kugelprotein13,14,15 . Nanogroße Vesikel werden durch Einbeziehung von Beschallungs- und Extrusionsschritten in die Haupttechnik hergestellt, was zu stabilen liposomalen Nanovesikeln mit hoher Einschlusseffizienz16führt.

Protocol

1. Herstellung von Tarin liposomalen Nanokapseln16 HINWEIS: Alle Zubereitungen sollten in Dreifachausführung vorbereitet werden, um ein größeres Volumen (7 ml) zu erhalten und die Probe in einer Ultrazentrifuge zentrifugieren zu können (siehe Details unten). Wiegen Sie die Liposomenkomponenten mit einer analytischen Waage, wie in Tabelle 1dargestellt. Lösen Sie die Lipidkomponenten in Chloroform mit einem 250 ml Volumetrischen Kolben, der in einen Rotationsverdampfer passt, um Materialverlust zu vermeiden. Die Mischung bei 150 Rpm 15 min rühren. Entfernen Sie das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer unter den folgenden Bedingungen: Stellen Sie den volumetrischen Kolbenmund auf die Standardposition (25°) für eine optimale Effizienz ein, während Sie mit dem Wasser aus dem Heizbad in Kontakt kommen.HINWEIS: Der Gerätearm sollte bei 25° geneigt sein, um den Kontakt zwischen dem Volumetkolben und dem Wasserbad aufrechtzuerhalten, ohne die Verdunstungseffizienz zu beeinträchtigen oder die Probe zu beschädigen. Die Standardposition kann je nach Ausstattungsmarke variieren. Stellen Sie die Kondensatortemperatur auf mindestens 3 °C ein. Stellen Sie die Heizbadtemperatur auf 40 °C und 1 °C ein. Stellen Sie die Drehung auf 120 Rpm ein. Stellen Sie das Vakuum auf 207 mbar und den Siedepunkt auf 20 °C ein. Nach 25 min den Kolben entfernen und das verdampfte Lösungsmittel entsorgen, das im Kondensator verbleibt, entsprechend.HINWEIS: In diesem Schritt wird eine dünne und undurchsichtige Folie, bestehend aus den Liposomenkomponenten, gebildet und lässt sich leicht visualisieren. Das im Kondensator verbleibende verdampfte Lösungsmittel muss bei Entsorgungsempfängern (chloriert) gelagert werden, die von einem spezialisierten Unternehmen für eine angemessene Entsorgung behandelt werden müssen. Hydratisieren Sie den Lipidfilm, um eine Lipidkonzentration von 0,01 M in 0,3 M Ammoniumsulfatlösung (pH = 7,4) zu erreichen, die Tarin bei 1 mg/ml bis zu einem Endvolumen von 10 ml enthält. Die Mischung 40 min rühren und über Nacht bei 4 °C bebrüten.HINWEIS: Dieser Schritt kann als Stopppunkt betrachtet werden. Eine nächtliche Inkubation ist nicht obligatorisch. Nach der Inkubation die Suspension für 1 min bei 25 °C beschallen (Raumtemperatur; RT) zur Verringerung der Vesikelgröße und Vermeidung von Aggregation.HINWEIS: Die Größenreduzierung wurde in einem Ultraschallschallgerät unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 130 W und 40 kHz. Führen Sie eine 12-Zyklus-Extrusion durch eine 0,2 m Polycarbonat-Porenmembran durch.HINWEIS: Testen Sie vor dem Extrusionsprozess die Miniextruderbaugruppe mit Wasser, um Probenlecks zu vermeiden. Eine 0,1 m Porenmembran ist ebenfalls geeignet. In diesem Fall den Miniextruderhalter über der Lipidübergangstemperatur vorheizen, um die Extrusion zu erleichtern, während die physikalisch-chemischen Eigenschaften sowohl von Lipiden als auch von Proteinen erhalten bleiben. Passen Sie die Teile des Miniextruders an, wie im Handbuch des Herstellers beschrieben. Legen Sie die Polycarbonatmembran zwischen zwei vornassen Filterstützen und legen Sie sie in den Halter. Legen Sie eine 1 ml leere Spritze in das Gerät ein, füllen Sie die andere Spritze mit der liposomalen Suspension auf ihr Gesamtvolumen und legen Sie sie auf der gegenüberliegenden Seite ein. Führen Sie eine 12-Zyklus-Extrusion durch eine 0,2 m Polycarbonat-Porenmembran durch. Drücken Sie die Probe langsam von einer Spritze auf eine andere. Sammeln Sie die extrudierte Suspension in einem vorgekühlten Rohr.HINWEIS: Die Polycarbonatmembran sollte nur ersetzt werden, wenn die Probenübertragung von einer Spritze auf eine andere schwierig wird. Die liposomale Suspension sollte während des Extrusionsprozesses durch Größenreduzierung durch die Bildung von SUVs deutlich werden. Etwa 0,2 ml der Probe können in diesem Schritt verloren gehen. Trennen Sie Liposomen durch Ultrazentrifugation.HINWEIS: Bewahren Sie die Proben in einem Eisbad auf, bis die Ultrazentrifuge einsatzbereit ist. Trennen Sie SUVs von den übrigen Komponenten und Ammoniumsulfat durch Ultrazentrifugation mit einer Ultrazentrifuge mit einem Schwenkschaufelrotor (siehe Details unten). Wiegen Sie die Probe im Titanrohr, das in den Rotor passt, und balancieren Sie die Rohre. Überprüfen Sie das Mindestvolumen, das gemäß dem Rotor erforderlich ist, um eine Beschädigung der Rohre zu vermeiden, und passen Sie ggf. das liposomale Suspensionsvolumen mit Ammoniumsulfat an.HINWEIS: Der Schwenkschaufel sollte immer auf dem Ständer unterstützt werden, wenn er außerhalb der Zentrifuge ist, um zu vermeiden, dass die “Zebrastreifen” (d. h. die schwarzen und weißen Streifen auf der Unterseite), die von der Zentrifuge zur Bestimmung der Rotationsgeschwindigkeit verwendet werden, zerkratzt werden. Schalten Sie das Vakuum ein, bevor Sie die Zentrifuge verwenden, damit sie gekühlt werden kann. Die Titanrohre in den Schwenkeimer einbauen.HINWEIS: Heben Sie die Rohre in die Position, die sie beim Laufen einnehmen, um sicherzustellen, dass sie perfekt montiert sind. Lösen Sie das Vakuum, öffnen Sie die Zentrifugentür und platzieren Sie den Rotor darin.HINWEIS: Achten Sie auf die Kreismarkierung an der Unterseite des Rotors, die in die entgegengesetzte Richtung desselben Kreiszeichens in die Zentrifuge selbst passen muss. Schließen Sie die Zentrifugentür, drücken Sie Vakuum und warten Sie, bis das Vakuum von 200 bis <20 Mikrometer oder von 26 Pa bis <3 Pa reicht. Stellen Sie die Parameter in der Ultrazentrifugenanzeige auf 150.000 x g (entspricht 29.600 U/min für den oben genannten Schwenkschaufel) für 90 min bei 4 °C (Beschleunigung: max, Verzögerung: max.HINWEIS: Konvertieren Sie die Geschwindigkeit immer in x g, wenn die spezifische Zentrifuge in rpm eingestellt ist. Verwenden Sie die Zentrifugen-Website, um das Gerät entsprechend dem verwendeten Rotor zu konvertieren. Drücken Sie Rückruf, überprüfen Sie die Bedingungen, und drücken Sie Start, um ausgeführt zu werden.HINWEIS: Warten Sie, bis die Zentrifuge die gewünschte Geschwindigkeit erreicht. Nach 90 min lassen Sie das Vakuum durch Drücken der Vakuumtaste los und öffnen Sie die Zentrifugentür, wenn das Vakuum 200-700 Mikrometer erreicht (entspricht 26-93 Pa). Schalten Sie die Zentrifuge aus, entfernen Sie den Rotor von innen, und lassen Sie ihn auf der Bank mit den Eimer zum Trocknen. Halten Sie die ultrazentrifugierten Proben auf Eis. Trennen Sie den Überstand vorsichtig vom Pellet, indem Sie das Rohr auf den Kopf in ein Einweg-Zentrifugenrohr von 15 ml drehen, um den Überstand und das Pellet zu trennen.HINWEIS: Bewahren Sie den Überstand, der das nicht verkapselte Protein enthält, bei 4 °C auf. Es wird verwendet, um die Verkapselungseffizienz zu bestimmen. Das Pellet erscheint als durchscheinendes Gelee. Setzen Sie das Pellet, das das gekapselte Protein enthält, in HEPES gepufferter Saline (3 ml 1x HBS) aus.HINWEIS: Die HBS 2x (Lagerlösung) wird durch Verdünnung der folgenden Mengen an Reagenzien in destilliertem Wasser hergestellt: 140 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES, dann Einstellung des pH-Wertes auf 7,4 und Endvolumen auf 100 ml. Na2HPO4 kann durch NaHCO3ersetzt oder weggelassen werden, um Interferenzen zu vermeiden, wenn die Liposomenkonzentration bestimmt werden soll. Die HBS 2x-Stammlösung sollte in destilliertem Wasser verdünnt werden, um HBS 1x vor Gebrauch zu erhalten. 2. Verkapselungseffizienz HINWEIS: Bestimmen Sie die Verkapselungseffizienz mit dem Petersons Protokoll17,um Lipidstörungen in der Proteinquantifizierung zu vermeiden. Alle Proben (BSA-Standards und Liposomenüberstand) sollten in Dreifacharbeit analysiert werden. Bereiten Sie auch ein leeres Rohr vor. Herstellung von Stoffreagenzien und Arbeitslösungen17 Für Lagerreagenzien Kupfer-Tartrat-Carbonat (CTC) durch Mischen von 10 ml 20% Natriumcarbonat, 200 l 0,1% Kupfersulfat, 200 l mit 0,2 % Kaliumtartrat mit 9,6 ml destilliertem Wasser zubereiten. Bereiten Sie 100 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,8 N Natriumhydroxid (NaOH) vor. Für Arbeitslösungen 10 ml 0,15% Natriumdeoxycholat (DOC) und 72% Trichloressigsäure (TCA) zubereiten. 10 mg Rinderserumalbumin (BSA) in 10 ml destilliertem Wasser auflösen, um eine Standardlösung von 1 mg/ml zu erhalten. Reagenz A vorbereiten, indem Sie gleiche Teile von CTC,NaOH, SDS und H2 O hinzufügen. Reagenz B durch Verdünnen des Folin-Ciocalteu Phenolreagenz 1:5 in destilliertem Wasser vorbereiten.HINWEIS: Reagenz A benötigt 1 ml für jedes Reaktionsrohr, während Reagenz B 0,5 ml benötigt. Um die endletzten Vogen der Reagenzien A und B zu bestimmen, definieren Sie zunächst die Anzahl der zu verwendenden Reaktionsrohre unter Berücksichtigung von drei unterschiedlichen Konzentrationen von BSA, Rohling und Proben in Dreifacharbeit. Das Reagenz A muss vor gebrauchen gut homogenisiert sein und kann 2 Wochen lang bei 25 °C (RT) gelagert werden. Reagenz B ist auch bei 25 °C (RT) stabil, wenn es in einer Bernsteinflasche gelagert wird. niederschlagHINWEIS: Dieser Schritt wird in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt. Verdünnen Sie den Liposomenüberstand mit Wasser auf ein Endvolumen von 1 ml, das 5-100 g Protein enthält.HINWEIS: Das Rohrohr sollte mit 1 ml destilliertem Wasser gefüllt werden. 0,1 ml 0,15% DOC hinzufügen, durch Wirbeln homogenisieren und 10 min bei RT inkubieren. 0,1 ml 72% TCA hinzufügen, gut mischen und Zentrifuge bei 3.000 x g und RT für 15 min.HINWEIS: DOC-TCA fördert die Proteinfällung und bildet zwei unterschiedliche Phasen. Das Zielprotein kann durch Zentrifugation zurückgewonnen werden, wodurch Fettstörungen vermieden werden. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie das Rohr nach unten verdrehen und auf ein saugfähiges Papier legen. Speichern Sie das Pellet für den nächsten Schritt.HINWEIS: Das Pellet kann sehr schwer zu sehen sein, aber das Rohr sollte auf den Kopf gestellt werden, auch wenn es nicht sichtbar ist. Spektrophotometrie Das aus Schritt 2.2.4 gewonnene Pellet in 1 ml destilliertem Wasser aussetzen. Mischen Sie gründlich, um sicherzustellen, dass das Pellet gelöst ist und übertragen Sie die Probe in ein neues Reagenzglas. Bereiten Sie Verdünnungen von Albumin(BSA)-Standards auf ein Endvolumen von 1 ml vor.HINWEIS: Proteinstandards müssen zwischen 5-100 g/ml hergestellt werden. 1 ml Reagenz A aus Schritt 2.3.1 und 2.3.2 ausnahmslos in die Röhrchen geben, gut mischen und 10 min bei RT inkubieren.HINWEIS: SDS kann mögliche Lipidstörungen lindern und gleichzeitig die Proteinlöslichkeit unterstützen. 0,5 ml Reagenz B ab Schritt 2.3.1 und 2.3.2 in die Rohre geben, gut mischen und 30 min bei RT inkubieren, während sie vor dem Licht geschützt sind.HINWEIS: Das Follin-Ciocalteu Phenolreagenz ist eine Mischung aus Phosphomolybdat und Phosphowolframat, das für kolorimetrische Tests einiger stickstoffhaltiger Verbindungen, wie Proteine, verwendet wird. Die Kupferkomplexierung erhöht die Reaktivität von Phenolen gegenüber diesem Reagenz und erzeugt je nach Proteinkonzentration einen blau-violetten Komplex. Bestimmen Sie die Absorptionen bei 750 nm mit einem Spektralphotometer. Berechnen Sie die Proteinkonzentration im Überstand basierend auf der Standardkurve wie folgt. Plotabsorptionswert (Abs) vs. BSA-Konzentration (mg/ml), um den Winkelkoeffizienten (k) unter Berücksichtigung einer linearen Neigungslinie zu erhalten. Bestimmen Sie die überstande Proteinkonzentration (C) durch das Verhältnis zwischen dem Absorptionswert und dem Winkelkoeffizienten (k), und multiplizieren Sie dann mit dem Gesamtvolumen wie folgt: Bestimmen Sie die Verkapselungseffizienz nach der folgenden Formel: bei geladenem Protein = 10 mg, nicht verkapseltes Protein = In Schritt 2.3.6.2 erhaltener C-Wert.HINWEIS: In diesem Fall werden insgesamt 10 mg Tarin, gelöst in Ammoniumsulfatlösung (1 mg/ml), zur Durchführung des Verkapselungsverfahrens verwendet, da diese Konzentration ausreicht, um zufriedenstellende In-vitro-Effekte zu erzielen13,16, 18. 3. Größen- und Stabilitätsbestimmung HINWEIS: Größenverteilung und Polidispersitätsindex (PdI) der liposomalen Präparate werden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bewertet. Eine PdI nahe 0,1 weist auf eine homogene Zubereitung hin. Zur Stabilitätsbestimmung Liposomen bei 4 °C lagern und Größenverteilung und Größendurchschnitt regelmäßig überprüfen. Schalten Sie die DLS-Ausrüstung 30 min ein, bevor Sie die Laserlampe aufwärmen. Übertragen Sie das in Schritt 1.10 erhaltene liposomale Präparat auf eine Einweg-Sizing-Küvette. Stellen Sie die Geräteparameter wie folgt ein: Dispergiermitteltyp = Wasser (RI = 1,33); Material = Lipide (RI = 1,45); und RT. Drücken Sie Start und warten Sie, während das Gerät seine Lesung beendet. Entfernen Sie die Küvette und schalten Sie das Gerät aus.HINWEIS: Übertragen Sie die Probe von der Küvette entweder für nachfolgende Analysen zurück in das Einweg-Zentrifugenrohr von 15 ml, oder entsorgen Sie sie, wenn eine ausreichende Menge für neue Lesevorgänge vorhanden ist. 4. Morphologische Charakterisierung HINWEIS: Liposomencharakterisierung wird nach Murtey und Ramasamy19durchgeführt. Proben, die in Schritt 1.10 erhaltene Nanoliposomen enthalten, werden in Dreifachform hergestellt. Befestigen Sie die Glasabdeckungen (13 mm Durchmesser) im Boden einer Petrischale mit doppelseitigem Klebeband. Schneiden Sie das Band in kleine Stücke (geeignete Größe, um die Abdeckungen zu befestigen), entfernen Sie das Schutzpapier darunter, und fixieren Sie es auf der Unterseite der Petrischale. Mit Hilfe einer Pinzette entfernen Sie das Schutzpapier auf dem Band und befestigen Sie die Abdeckungen darauf.HINWEIS: Achten Sie in den folgenden Schritten darauf, die Abdeckungen nicht zu lösen, und verwenden Sie ein starkes Band. Beschichten Sie die Coverlips mit Poly-L-Lysin. Nassfilterpapiere in die Petrischale legen, um Feuchtigkeit zu erhalten und 1 h bei RT (25 °C) zu brüten. Nach dem Beschichten die Abdeckungen mit destilliertem Wasser abspülen. Füllen Sie die Deckellipsen mit einem Tropfen der Probe aus Schritt 1.10 und lassen Sie sie für 1 h bei RT trocknen. Um die Proben zu fixieren, bedecken Sie sie mit 4% Glutaraldehyd, das in 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 7,2 hergestellt wird. Legen Sie nasse Filterpapiere in die Petrischale und versiegeln Sie die Schale, um den Feuchtigkeitsgehalt aufrechtzuerhalten. Bei 4 °C für 48 h inkubieren. Spülen Sie die Abdeckungen 3x für 5 min mit dem gleichen Phosphatpuffer. Proben wie folgt dehydrieren: 35% Ethanol 1x für 15 min, 50% Ethanol 1x für 15 min, 75% Ethanol 1x für 15 min, 95% Ethanol 2x für 15 min und absolutes Ethanol 3x für 20 min. Trocknen Sie die Proben chemisch durch Eintauchen 2x in 1×2 ml Hexamethyldisilazan (HMDS) für 10 min.HINWEIS: Der HMDS sollte sorgfältig in einer Dunstabzugshaube manipuliert werden. Proben sollten über Nacht in einem Trockenschrank oder in der Dunstabzugshaube bei RT trocknen dürfen. Montieren Sie die getrockneten Proben auf einem Stub mit einem kohlenstoffleitfähigen Klebeband. Die Oberfläche des Deckels in einem Vakuum mit einer elektrisch leitfähigen Schicht (20 nm Dicke) aus Gold-Palladium sputtern. Nehmen Sie Bilder mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) im Niedrigen Vakuummodus und niedriger Spannung (20 kV) auf.

Representative Results

Abbildung 1 beschreibt die Nanolipom-Präparation16,20,21. Phospholipide, 1,2-Dioleoyl-Sn-Glycerol-3-Phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Amino(Polyethylenglycol)-2000] (Ammoniumsalz; DSPE-MPEG 2000) und Cholesterylhemuccinate (CHEMS), die wichtigsten Liposomenbestandteile, wurden zuerst in Chloroform gelöst, um den Lipidfilm zu erhalten. Der Lipidfilm wurde dann in Ammoniumsulfatlösung rehydriert, die das zu umfonsende hydrophile Protein (Tarin) enthält, und die Inkubation wurde über Nacht durchgeführt. Dann wurden Beschallungs- und Extrusionstechniken angewendet, um kleine unilamellare Vesikel zu erzeugen. Der Ultrazentrifugationsschritt trennte die liposomale Zubereitung von freien Lipiden und unverkapseltem Protein, während der Überstand zur Bestimmung der Einschlusseffizienz verwendet wurde. Nanoliposomen, die nach der oben genannten Methode hergestellt wurden, wiesen eine Größenverteilung von 51 bis 396 nm und eine durchschnittliche Größe von 155 nm auf (Tabelle 2). Die Zubereitung war homogen, da der Polydispersitätsindex 0,168 betrug. Eine hohe Einschlusswirkungseffizienz von 83% kann erreicht werden, wenn die Liposomen durch eine 0,2 m Porenmembran extrudiert werden (Tabelle 2). Die morphologischen Nanolipominitika wurden von SEM bewertet. Abbildung 2A,B zeigt runde liposomale Vesikel im Bereich von 121 nm und analysiert bei 20 kV, während Abbildung 2C,D nicht ausreichend vorbereitet ist. Proben. Nanoliposomen wurden einfach luftgetrocknet, ohne vorherige Fixierung oder eine andere in dieser Studie beschriebene Behandlung. Als Ergebnis wurden größere und beschädigte Vesikel im Bereich von 332 m beobachtet und bei 5 kV analysiert. Abbildung 1: Schematische Darstellung der Nanolipom-Präparation. DOPE, PEG und CHEMS, die wichtigsten Liposomenbestandteile, wurden zuerst in Chloroform gelöst, um den Lipidfilm zu erhalten (1, 2, 3). Der Lipidfilm wurde dann in einem Kochsalzlösungspuffer rehydriert, der das zu umfonsende hydrophile Protein (Tarin) enthält, und die Inkubation wurde über Nacht durchgeführt (4). Dann wurden Beschallungs- und Extrusionstechniken angewendet, um SUVs zu erzeugen (5, 6). Der ultrazentrifugationsschritt trennte die liposomale Zubereitung von freien Lipiden und unverkapseltem Protein, während der Überstand zur Bestimmung der Einschlusseffizienz verwendet wurde (7). Diese Zahl wurde von Correa et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Nanolipomin-Photomikroskopie von SEM. (A,B) Bilder von runden liposomalen Vesikeln im Bereich von 121 nm und analysiert bei 20 kV. (C,D) Bilder von unzureichend vorbereiteten Proben. Misshandelte Proben ermöglichten die Beobachtung größerer und/oder beschädigter Vesikel, die Vakuum- und/oder Spannungsbedingungen bei 5 kV nicht standhalten können. Diese Zahl wurde von Correa et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Liposomenkomponenten Gewicht (g) Konzentration (mM) Endvolumen rauschgift 0.0420 5.7 10 ml MPEG 2000-DSPE 0.1059 3.8 CHEMS 0.0024 0.5 DOPE – 1,2-Dioleoyl-sn-Glycerol-3-Phosphoethanolamin); MPEG 2000-DSPE – 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- [Amino (Polyethylenglycol)-2000] (Ammoniumsalz); CHEMS – Cholesterylhemuccinat. Tabelle 1: Herstellung von Tarin liposomalen Nanokapseln. Membranporengröße (m) Größenverteilung (nm) Durchschnittliche Größe (nm) Polydispersitätsindex (PdI) Spitze (nm) Entrapment-Effizienz 0.2 51 – 396 155 0. 168 94 x 39 0.83 Größen- und Polydispersitätsindex wurden durch dynamische Lichtstreuung ausgewertet, während die Verkapselungseffizienz nach Peterson17bestimmt wurde. Tabelle 2: Größe, Polidispersitätsindex und Verschlusseffizienz der Nanolipomin-Zubereitung.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde von Correa et al.16 getestet, um Tarin, ein immunmodulatorisches und antitumorales Lektin, das von Colocasia esculenta22gereinigt wird, zu verkapseln. Die Methodik lieferte erfolgreiche Ergebnisse, die die Herstellung stabiler Nanoliposomen von geeigneter Größe für therapeutische Anwendungen ermöglichten. Die Formulierung stellt eine kontrollierte Freisetzung bei verschiedenen pH-Werten unter physiologischen Bedingungen dar. Es potenziert auch tarin pharmakologische Eigenschaften, wie Hemmung des menschlichen Glioblastoms U-87 MG und Brustkrebs MDA-MB-231 Zelllinien und Stimulation von Mäusen Knochenmarkzellen. Das liposomale Präparat zeigte keine toxischen Wirkungen in gesunden Mäusezellen16.

Die klassische Methode, die zuerst von Bangham et al.7beschrieben wurde, ermöglicht die Herstellung von großen multilamellarliposomen Vesikeln, heterogen in Größe und Form. Anpassungen dieser Methode, wie in der vorliegenden Studie berichtet, werden erfolgreich durch zusätzliche Schritte wie Beschallung und Extrusion durch eine 0,2 m Polycarbonatmembran angewendet. Dies ermöglicht die Herstellung einer homogeneren Dispersion in Bezug auf die Größe im Nanometerbereich16,23,24. Um erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten, sollten daher das hier beschriebene Verkapselungsprotokoll und die liposomale Formulierung strikt eingehalten werden.

Die Nanolipominzusammensetzung wurde sorgfältig ausgewählt, um die Bildung einer bilayermembran mit DOPE, MPEG 2000-DSPE und CHEMS als Hauptbestandteilen zu gewährleisten. Dabei handelt es sich um natürliche Tiermembran-Bilayer-Komponenten, die der Nanolipom-Architektur Flüssigkeit verleihen können, was eine breite Anwendung für die Bioaktivitäts-Wirkstoffabgabe beim Menschen gewährleistet.

Nanoliposome Pegylierung ist wichtig, um liposome Strukturstabilität zu gewährleisten. Das Fehlen von PEG führt zu einer Größenvergrößerung, einem hohen Polydispersitätsindex und einer geringen Einschließungseffizienz. Optimale Ergebnisse können mit DOPE als Hauptliposomenkomponente erzielt werden. Dies ist jedoch ein kostenreiches Phospholipid. Die finanziellen Kosten der Nanolipomin-Produktion können durch den Ersatz von DOPE durch andere ähnliche Lipide wie DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin) erreicht werden. CHEMS ist ein Cholesterinmolekül, das natürlicherweise in tierischen Zellmembranen vorkommt und nicht von der Formulierung ausgeschlossen werden sollte, da es wichtig ist, Lipid-Bilayer-Fluidität und Formbarkeit zu gewährleisten16.

Andere Aspekte des Verkapselungsprotokolls können ebenfalls angepasst werden. Das Zum Auflösen der liposomalen Komponenten verwendete Chloroform kann leicht durch Methanol ersetzt werden, ohne dass sich dies auf den Größendurchschnitt, die Homogenität und die Einschlusseffizienz ausdeut. Bei Lagerung unter 4 °C16kann es jedoch zu einem Proteinaustritt kommen. Der nächtliche Inkubationsschritt mit Tarin-haltiger Ammoniumsulfatlösung ist nicht obligatorisch; Aus Gründen der Bequemlichkeit kann es jedoch ohne Schäden an nanoliposomalen biophysikalischen Eigenschaften, Verkapselung strotzen oder Effizienzverluste der Stabilität aufweisen, wie Correa et al.16zeigen. Der Extrusionsschritt wird bei Raumtemperatur durchgeführt, was die Durchflussrate zwischen den Spritzen verringern kann, wenn eine Membran mit einer Porengröße von 0,1 m verwendet wird.

Um dieses Problem zu lösen, sollte die Verwendung einer Membran mit einer Porengröße von 0,2 m oder eine Erwärmung des Extruderhalters über der Lipidübergangstemperatur in Betracht gezogen werden. Der Analytiker muss darauf achten, die Lipide oder das Protein, das inaktiviert werden kann, nicht zu beschädigen und biologische Aktivität zu verlieren. Alternativ kann die liposomale Zubereitung gegen HBS anstelle von Ultrazentrifugation dialyziert werden, indem eine Abgeschnittene Membran nach Proteinmolekulargewicht verwendet wird. Die Wahl der chemischen Natur des Puffers, in dem Nanoliposomen nach der Ultrazentrifugation suspendiert werden, steht in direktem Zusammenhang mit ihrer späteren Anwendung. Da die Perspektiven dieser Studie In-vivo- und In-vitro-Assays umfassen, war die Suspension in HEPES gepufferter Salzlösung ausreichend, um keine zytotoxischen Wirkungen und einen pH-Bereich in der Nähe physiologischer Bedingungen zu gewährleisten.

Liposomen sollten fein behandelt werden, ähnlich wie lebende Zellen, um eine höhere Qualität von SEM-Bildern zu erhalten. Befestigungs- und Trocknungsverfahren sind wichtig, um die Visualisierung kleinerer intakter Vesikel zu gewährleisten, die Werte über 20 kV unter Vakuumbedingungen unterstützen. Abbildung 2 A,B zeigt nanogroße Vesikel an, die mit dem Extrusionsverfahren kompatibel sind. Die Visualisierung von Vesikeln im Bereich von 51-396 nm ist möglich, wenn eine angemessene Probenvorbereitung nach diesem Verfahren durchgeführt wird. Die Schritte umfassen Fixierung, Trocknung durch Erhöhung der Ethanolkonzentrationen und chemische Austrocknung, um die Bildung von Aggregaten und gebrochenen Vesikeln zu vermeiden, die durch das Vakuum und den Elektronenstrahl verursacht werden. Auf der anderen Seite zeigt Abbildung 2C,D Liposomenbläschen, die unter Raumtemperatur getrocknet und keiner behandlung unterzogen werden, was bedeutet, dass sie unzureichend zubereitet wurden. Durch das unzureichende Verfahren bilden sich auch nach der Extrusion durch eine Membran mit einer Porengröße riesige Vesikel. Ruptured Vesikel werden auch in beiden Platten als Folge von Vakuum- und Elektronenstrahlschäden beobachtet.

Nanoliposome Vesikel wurden als Verkapselungs- und Abgabesystem für hydrophobe Moleküle erforscht, einschließlich Resveratrol (3,5,4′-Trihydroxystilbene), eine bioaktive Verbindung gegen Kolorektalkrebszellen. Das Verkapselungsverfahren kann die schlechte Löslichkeit lipophiler Verbindungen überwinden und bietet neben Biokompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, Nichtimmunogenität und nicht-toxischen Eigenschaften, die Liposomen-Nanokapseln inhärent sind25. Protokollanpassungen müssen je nach Verabreichungsweg und -zweck berücksichtigt werden, wie z. B. die Entwicklung neuer Liposomenformulierungen für die orale Verabreichung.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Einrichtungen des COPPE/UFRJ, des Elektronischen Mikroskopielabors und des Multiuser Materials Characterization Laboratory; an Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe und Rafael Lindoso, Professoren an der Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, für den Einsatz der Ultrazentrifuge; an Dr. Alexandre Guedes Torres und Daniel Perrone, Professoren an der Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, für den Einsatz des Rotationsverdampfers; an Professor Roland Bodmeier und Dr. Andriy Dashevskiy von der Freien Universität Berlin, die mit Ressourcen halfen, neue Methoden zur Verfügung stellten und ACNTF während eines 6-monatigen Erasmus+-Stipendiums in Deutschland betreuten; an Dr. Rossana Thiré und Aline Fernandes, Professorin und Technikerin an der Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, für den Einsatz von Zetasizer Malvern; an Bluma Guenther und Taissa Rodrigues, Professorin und Technikerin an der Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, für die Nutzung des SEM; an Dr. Rachel Ann Hauser Davis, Forscherin bei Fundao Oswaldo Cruz, für Erzählung. Diese Studie wurde zum Teil durch den Coordenao de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior, Brasil (CAPES) – Finance Code 001 (Grant Nr. 1627392; 1811605) finanziert. von Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo , Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant Nr. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 und E-26/202.860/2016); von Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnolégico (CNPq) (Zuschuss Nr. 406601/2018-6) und Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).

Materials

Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich Co A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw Mettler Inc. 417870
Beckman DU-640 Spectrophotometer Beckman Coulter 8043-30-1090
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich Co 5470
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump Thermo Fischer Scientific 05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) Sigma-Aldrich Co C6512
Chloroform Sigma-Aldrich Co 48520-U CAUTION
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) Sigma-Aldrich Co 209198
Coverslips (13mm diameter) Thermo Scientific Nunc EW-01839-00
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) Lipoid GMBH 565600.1
Ethanol Absolute Sigma-Aldrich Co 32205
Folin -Ciocalteu phenol reagent Sigma-Aldrich Co F9252
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich Co G5882
HEPES Sigma-Aldrich Co H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich Co 440191 CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope JEOL LTD
Mini Extruder 7 Avanti Polar Lipids 610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Lipoid GMBH 588200.1
Optima L-90k Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
Phosphate Buffer Sigma-Aldrich Co P3619
Poli-L-lysine Sigma-Aldrich Co P8920
Potassium L-tartrate monobasic Sigma-Aldrich Co 243531
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich Co S7795
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co S7653
Sodium Deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich Co D6750
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich Co L3771
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich Co S8045
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich Co RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope Tescan #657874
Trichloroacetic Acid (TCA) Sigma-Aldrich Co 91230
Zetasizer Nano ZSP Malvern Panalytical LTD
Ultrasonic cleaning bath model 2510 Branson
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Corrêa, A. C. N. T. F., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59900, doi:10.3791/59900 (2019).
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